高蘇平，馬大喜，韓 江，蔡 端

(1.上海市健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院普通外科，上海 201318；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科，上海 200040)

肝外膽管損傷(extrahepatic bile duct injury，EBDI)是膽囊切除術嚴重的并發(fā)癥之一，包括開腹膽囊切除術(open cholecystectomy，OC)和腹腔鏡膽囊切除術(laparoscopic cholecystectomy，LC)。EBDI在OC術中的發(fā)生率為0.1%～0.3%，在LC術中的發(fā)生率為0.4%～0.6%[1-3]。膽總管損傷修復最經典的方法是膽總管空腸Roux-en-Y吻合術，但術后可出現消化性潰瘍、腸液反流、膽道反復感染等問題，甚至可誘發(fā)膽管癌。眾多學者研究認為，保留Oddi括約肌功能的膽總管損傷修復手術是理想的術式，其中利用自體組織修復膽總管損傷是比較符合生理狀況的治療手段。本實驗建立豬膽總管缺損模型，采用帶蒂胃漿肌瓣管修補膽總管缺損，保留其Oddi括約肌功能，探討帶蒂胃漿肌瓣管修復膽總管缺損的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性成年實驗豬(湖北白豬)18頭，體質量14.5～15.5 kg，由上海交通大學農學院動物實驗中心提供。

1.2 主要藥物、試劑與儀器注射用青霉素鈉購自四川制藥制劑有限公司(批準文號：H51021742)，諾氟沙星膠囊購自安徽三精萬森制藥有限公司(批準文號：H34022906)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色劑購自上海聯碩生物科技有限公司，細胞角蛋白7(cell keratin 7，CK7)一抗和Calretinin一抗及二抗購自北京中山金橋生物有限公司；日立 7600全自動生物化學分析儀購自日本日立公司，CX41型光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及模型制作所有豬分欄飼養(yǎng)，并隨機分為帶蒂胃漿肌瓣管組、膽總管斷端吻合組和膽腸內引流組，每組6頭。豬麻醉后，剖腹、切除十二指腸上段0.5～0.8 cm長的膽總管，建立膽總管缺損模型。

1.3.2 手術方法帶蒂胃漿肌瓣管組豬采用帶蒂胃漿肌瓣管修復膽總管：先在臨近膽總管處切取2 cm×3 cm帶蒂胃漿肌瓣，以漿膜面為內壁，環(huán)繞直徑為0.5 cm 支撐管，再用可吸收縫線縫合成漿肌瓣管，然后翻轉漿肌瓣管，依序于膽總管上、下斷端分別吻合，漿肌瓣管外包帶蒂大網膜。膽總管斷端吻合組豬采用膽總管斷端吻合修復膽總管：先將膽總管游離切斷，然后膽總管內置支撐管，再用可吸收縫線行斷端吻合。膽腸內引流組豬采用膽腸內引流術，先將豬切斷的膽總管遠端關閉，然后膽總管近端與近段空腸行Rox-en-Y膽總管空腸吻合術，所有操作均在眼鏡式手術放大鏡下進行，采用顯微血管吻合技術。3組豬術中給予靜脈滴注青霉素鈉10萬U預防感染，術后第1、2、3天飲水中給予諾氟沙星0.1 g，每日1次。

1.4 觀察指標

1.4.1 存活情況術后觀察各組豬的一般情況及存活情況。

1.4.2 肝功能指標3組豬術前及術后4、12周經耳靜脈抽血，測定丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)水平。

1.4.3 肝組織和膽總管大體檢查和顯微檢查各組豬于術后12周進行安樂死，迅速開腹，取出肝臟進行大體檢查。切除修復區(qū)膽總管及附近肝臟，Zamboni固定液固定，甲醇梯度脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，切片、展片、烤片，行HE染色，梯度脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察肝臟和膽總管內壁顯微結構。

1.4.4 膽總管CK7和Calretinin 表達的測定各組豬膽總管石蠟切片脫蠟、水化，抗原修復，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗3次，加入封閉劑進行封閉。分別加入CK7、Calretinin 一抗室溫下孵育2 h，PBS清洗3次；滴加試劑盒增強劑室溫孵育20 min，加入二抗孵育30 min；PBS清洗3次；加入二氨基聯苯胺顯色10～15 min；自來水沖洗，復染，PBS清洗3次；甲醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。細胞呈現黃色或棕色染色即為陽性表達細胞。

2 結果

2.1 各組動物存活情況各組豬手術均順利完成，均未出現術中死亡情況，術后均未出現膽漏。

2.2 各組豬膽總管及肝臟標本大體觀帶蒂胃漿肌瓣管組有5頭豬肝臟呈紫紅色，表面光滑，質地柔軟；膽總管修復段質地較柔軟，管壁平整，管腔光滑通暢。有1頭豬術后支撐管脫入腸管導致梗阻性黃疸，其肝臟呈土黃色，表面光滑，質地韌硬，且膽總管修復段管壁增厚，內有黏凍狀、泥沙狀膽泥阻塞膽總管；修復段近端膽總管和肝內膽管擴張明顯，膽囊增大，膽汁淤積。膽總管斷端吻合組豬吻合口未見明顯狹窄，膽總管質地柔軟，管壁平整，管腔光滑，肝臟呈紫紅色，表面光滑，質地柔軟。膽腸內引流組5頭豬吻合口未見明顯狹窄，膽總管質地柔軟，管壁平整，管腔光滑，肝臟呈紫紅色，表面光滑，質地柔軟；1頭豬術后膽管炎發(fā)作，其肝臟組織充血腫脹。

2.3 各組豬肝臟顯微結構結果見圖1。術后12周，帶蒂胃漿肌瓣管組豬肝臟間質內少量散在粒細胞，呈輕度炎癥反應；膽總管斷端吻合組豬肝臟間質內大量粒細胞聚集，呈明顯炎癥反應；膽腸內引流組豬肝臟間質可見散在粒細胞，亦呈輕度炎癥反應。

A:帶蒂胃漿肌瓣管組，光標處示少量散在炎癥細胞；B:膽總管斷端吻合組，光標處示大量炎癥細胞聚集；C:膽腸內引流組，光標處示散在炎癥細胞。

圖1 各組豬術后12周肝臟組織的顯微結構(HE染色，×100)

Fig.1 Microstructure of liver tissue of pigs in each group ( HE staining，×100 )

2.4 各組豬膽總管的顯微結構結果見圖2。術后12周帶蒂胃漿肌瓣管組豬胃漿肌瓣管腔面完整覆蓋著單層柱狀上皮，中外層為增生肌纖維、纖維組織，可見散在淋巴細胞、漿細胞、成纖維細胞和巨噬細胞，并見較完整的毛細血管。膽總管斷端吻合組豬膽總管黏膜下可見大量成纖維細胞，并部分纖維化；膽腸內引流組豬術后吻合口亦可見上皮增生，局部纖維化。

A:帶蒂胃漿肌瓣管組；B:膽總管斷端吻合組；C:膽腸內引流組。

圖2 帶蒂胃漿肌瓣管組豬胃漿肌瓣管內壁的顯微結構(HE染色，×100)

Fig.2 Microstructure of inner wall of gastric seromuscular flap tube of pigs in pedicled gastric pulp muscle flap tube group(HE staining,×100)

2.5 各組豬膽總管免疫組織化學結果結果見圖3和圖4。3組實驗豬術后12周膽總管內壁黏膜上皮細胞中CK7呈陽性表達，表明為膽道來源上皮；Calretinin呈陰性表達，表明為非間皮組織。

A:帶蒂胃漿肌瓣管組；B:膽總管斷端吻合組；C:膽腸內引流組。

圖3 術后12周各組豬膽總管內襯黏膜上皮細胞中CK7的表達(免疫組織化學染色，×100)

Fig.3 Expression of CK7 in lining mucosa of common bile duct of pigs at 12 weeks after operation in each group (immunohistochemistry staining，×100)

A:帶蒂胃漿肌瓣管組；B:膽總管斷端吻合組；C:膽腸內引流組。

圖4 術后12周各組豬膽總管內襯黏膜上皮細胞中Calretinin的表達(免疫組織化學染色，×100)

Fig.4 Expression of Calretinin in lining mucosa of common bile duct of pigs of pigs at 12 weeks after operation in each group( immunohistochemistry staining，×100)

2.6 各組豬手術前后肝功能比較結果見表1。3組豬術前TBIL、ALT、AST水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；3組豬術后4、12周TBIL、ALT、AST水平與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。3組豬術后4、12周TBIL、ALT、AST水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組豬手術前后肝功能比較

Tab.1 Comparison of liver function indexes of pigs before and after operation in each group

組別nTBIL/(μmol·L-1)術前術后4周術后12周ALT/(U·L-1)術前術后4周術后12周AST/(U·L-1)術前術后4周術后12周帶蒂胃漿肌瓣管組647.6±5.156.2±7.153.1±5.024.3±8.369.3±12.155.3±8.835.4±7.3458.4±89.3124.3±37.4膽總管斷端吻合組643.4±5.358.3±9.450.4±8.032.8±7.472.4±13.450.6±11.237.7±5.4511.7±101.8133.2±48.6膽腸內引流組640.3±7.148.6±10.646.7±9.027.4±3.880.6±8.358.9±10.741.2±8.6631.4±143.8166.7±72.1

3 討論

EBDI多是醫(yī)源性損傷。目前LC已成為膽囊切除術的金標準，其明顯減少了術后疼痛和住院時間，但相應的并發(fā)癥也隨之增高，據報道，EBDI在LC術中的發(fā)生率為0.1%～0.3%，而在OC術中的發(fā)生率上升至0.4%～0.6%[1-3]。外傷性膽管損傷較少見，發(fā)生率約為0.1%[4]。膽腸吻合內引流術是治療肝外膽總管損傷狹窄的經典術式[5]。但膽總管下端Oddis括約肌存在并有功能時，應用膽腸吻合內引流術修復膽總管損傷狹窄不盡合理。有學者認為,盡管膽腸吻合術是膽道損傷及狹窄的可選治療方式，但絕不是最佳治療方案[6]。無論膽道還是腸道，膽腸吻合均可造成其結構和功能的極大損傷。黃志強[7]院士指出，將膽道系統作為一個整體器官來對待和更多地保存其生理功能的完整性，可能是治療損傷性膽管狹窄的發(fā)展方向。因此，保存膽總管下端括約肌已成為損傷性膽總管狹窄修復的最終目的。任何模式的膽腸吻合術均破壞了括約肌的自然防護作用，導致膽道感染、炎癥、膽管黏膜上皮細胞增生。

保留Oddis括約肌的EBDI修復手術主要有闌尾間置膽管重建術[6]、帶蒂臍靜脈瓣移植術[8-9]、帶蒂空腸瓣修補術[10]、帶蒂肝圓韌帶修復術[11]等。但是在行闌尾間置膽管重建術時闌尾周圍淋巴組織豐富且管腔較狹窄，一旦發(fā)生膽管炎時易導致膽汁排出不暢，難以在臨床推廣。上述膽管重建手術僅被少數學者所試用，缺乏進一步實驗研究及確切的臨床數據支持。

有學者報道了采用靜脈、腹膜瓣等自體組織替代修復EBDI的動物研究，證實以聚全氟乙丙烯共聚物導管作為支撐管，通過自體靜脈補片修復膽管損傷是可行的[12-14]。BELZER等[15]采用靜脈補片修補長約1.5～4.0 cm的部分膽管壁缺損，取得良好效果。AYDIN等[16]成功地進行了自體游離腹直肌鞘移植物修復膽管缺損的動物實驗。國內學者劉會春等[17]用大隱靜脈段結合內襯支架修復山羊膽道缺損亦取得良好效果。韓江等[18]用自體腹膜管修復缺損膽總管后，使用帶蒂大網膜包裹，腹膜管的成活率高。但是，動物實驗亦發(fā)現，采用自體靜脈和自體腹膜等組織修復肝外膽管缺損時，由于缺乏肌層，遠期難以保持足夠的膽道張力，因此難以維持肝外膽道的通暢[12-14]。

本研究設計了帶蒂胃漿肌瓣管內襯支撐管、外包裹大網膜修復膽管整段缺損的動物實驗，采取內支撐管技術，防止膽道狹窄的發(fā)生和發(fā)展。帶蒂胃漿肌瓣管組在臨近膽總管的胃壁大彎側切取2 cm×3 cm帶網膜右血管蒂的漿肌瓣，然后以所取胃壁漿肌瓣漿膜面為內壁，圍繞直徑約0.5 cm的支撐管，再用可吸收縫線縫合成漿肌瓣管，依序于膽管上、下斷端分別吻合，漿肌瓣管外包帶蒂大網膜，從大體標本的觀察發(fā)現，帶蒂胃漿肌瓣管組豬膽管修復段質地較柔軟，管壁平整，管腔光滑通暢。病理學結果證實，帶蒂胃漿肌瓣管腔面覆蓋著單層柱狀上皮，且免疫組織化學檢測結果證實為膽道來源，說明本組實驗是成功的，使用帶蒂胃漿肌瓣管修復膽總管缺損，膽管上皮可逐漸由兩端向中央移行覆蓋漿肌瓣管腔面，完成缺損膽管的修復。胃壁面積大，切除部分胃壁漿肌層不影響胃的修復；保留胃大彎網膜右血管的胃漿肌瓣，移動范圍大，便于手術操作，且所取胃漿肌瓣血供好，張力小，修復段容易成活。帶蒂胃漿肌瓣管修復的膽管通暢性與“經典”的膽管斷端對端吻合術及膽腸內引流術相仿。本研究結果顯示，術前及術后4、12周，3組豬肝功能各指標組內、組間比較差異均無統計學意義。帶蒂胃漿肌瓣管組豬術后肝臟組織切片HE染色顯示，其肝臟間質內僅少量散在粒細胞，呈輕度炎癥反應，說明保留Oddis括約肌的膽管修復術不會因膽腸反流導致肝臟嚴重炎癥。帶蒂胃漿肌瓣管組中1頭豬出現梗阻性黃疸，可能是由于支撐管脫入腸管使修復段膽總管缺乏有效的支撐造成膽總管狹窄，進一步發(fā)展，膽汁淤積形成膽泥，出現膽總管結石而導致梗阻性黃疸。因此，選擇合適的支撐管及預防遠期修復段膽管的狹窄仍需繼續(xù)研究。

在本實驗獲得初步結果的基礎上，對1例膽總管損傷修復后狹窄3 a伴肝損傷、梗阻性黃疸患者，采用帶網膜右血管蒂胃漿肌瓣片修復狹窄段膽管，隨訪7個月效果良好(另撰文報道)。

綜上所述，帶蒂胃漿肌瓣管修復膽總管缺損，組織瓣血供好，無張力，膽管上皮可逐漸由兩端向中央移行覆蓋修復段管腔面，具有一定臨床應用前景。