王秀文 王穎莉 于茜 裴曉麗

摘要：研究新型反離子季銨鹽DDAI與BSA的相互作用。通過單因素法，選出適宜的作用時間、Na濃度和pH值;并采用熒光光譜法和三維熒光光譜法研究DDAF與BSA的相互作用機制。作用時間15min，鈉離子濃度為0.04mol/L、pH值為待測液的初始pH值為適宜的實驗條件;不同溫度（290.15，296.15，303.15，310.15K）下二者的雙分子猝滅常數(shù)（K_q）分別為7.03×10¹⁰，8.53×10¹⁰，1.09×10¹¹，1.12×10¹¹L/（mol-s）;結合位點數(shù)（n）分別為1.17、0.84、0.97和1.02; AH和AS均大于0;三維熒光光譜顯示，加入DDAF后，BSA的熒光峰發(fā)生藍移，且熒光強度下降16.63%。DDAF和BSA為混合猝滅;二者以1：1結合;二者間的作用力是疏水作用力;DDAF使BSA氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強。

關鍵詞：雙癸基二甲基甲酸鉸;牛血清白蛋白;熒光光譜法;三維熒光光譜法

中圖分類號：TQ423：0657.3 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）07-0080-07

收稿日期：2018-11-23;收到修改稿日期：2019-01-15

基金項目：山西省留學回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目（2017066）;太原科技大學博士啟動基金（20162015）;山西省"1331工程”工程（技術）研究中心建設計劃（晉教科[20]7]14號）

作者簡介：王秀文（1981-），女，山西太谷縣人，講師，碩士，主要從事中藥及其制劑的質量研究。

通信作者：王穎莉（1967-），女，山西太原市人，教授，博士，主要從事中藥藥效物質基礎研究工作。

0 引言

雙癸基二甲基甲酸銨（DDAF）是中國日用化學研究院有限公司合成的一種新型反離子季銨鹽表面活性劑，屬于陽離子表面活性劑。其陽離子部分為季銨鹽，反離子為甲酸根（-HCOO-），化學結構如圖1所示。DDAF在水溶液中電離而帶正電荷，可以吸附在帶負電的細菌細胞膜表面，影響細胞膜正常生理功能，具有良好的殺菌效果[1]。唐偉月等[2]研究表明，DDAF僅需10μg/mL，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率即可達到100%。該機構還研制了含DDAF的洗手液配方[1]，其抑菌性能達到GB 19877.1-、2005關于洗手液抑菌率不低于50%的要求。此外DDAF泡沫少、易降解，在抑菌清洗液方面有良好的開發(fā)前景[1]。

蛋白質是細胞的重要成分，是生命的基本物質，表面活性劑的殺、抑菌活性與蛋白質的相互作用是緊密相關的。研究表面活性劑與蛋白質的相互作用對深入了解表面活性劑的殺、抑菌作用機制、藥代動力學以及毒理研究具有重要意義。其次，表面活性劑對皮膚的刺激作用，對頭發(fā)、羊毛的柔順作用等，都涉及到表面活性劑與蛋白質的相互作用，在工業(yè)、生物、制藥和化妝品等領域中具有廣泛意義[3-4]。

目前國內對于DDAF的研究不多[1-2，5-6]，也未曾發(fā)現(xiàn)有DDAF與BSA（牛血清白蛋白）相互作用的研究，因此本文采用熒光光譜法和三維熒光光譜法研究DDAF與BSA的相互作用，希望為擴大DDAF的應用范圍提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計（F97 pro熒光分光光度計，上海棱光技術有限公司）;智能酸度計（pHS-4C⁺，成都世紀方舟科技有限公司）;水浴鍋（數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2，金壇市杰瑞爾電器有限公司）;萬分之一分析天平（JM-B-2003，余姚紀銘稱重校驗設備有限公司）。

牛血清白蛋白（生物技術級，96%，AladdinIndustrial Corporation）;DDAF（由中國日用化學研究院有限公司提供，質量分數(shù)84%）;高純水（市售娃哈哈純凈水）;氯化鈉（分析純，北京康普匯科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

1.0×10^-4mol/L BSA溶液的配制：用萬分之一分析天平準確稱取約0.7g BSA樣品，置于小燒杯內，用高純水溶解，定量轉移至100mL容量瓶，定容，搖勻。

2.06×10^-4mol/L DDAF溶液的配制：將DDAF樣品搖勻（動作要輕、慢，防止氣泡夾入），用1mL移液管準確移取0.1mL該樣品，置于小燒杯中，用高純水稀釋，洗滌移液管內壁3次，定量轉移至100mL容量瓶，定容，搖勻，制成2.06×10^-3mol/LDDAF的儲備液。準確吸取10mL儲備液至100mL容量瓶，用高純水定容，搖勻，即得。

0.1mol/L NaCl溶液的配制：用萬分之一分析天平準確稱取約5.85g氯化鈉，用高純水溶解，定量轉移至1000mL容量瓶，定容，搖勻。

上述溶液均放入4℃冰箱中保存，使用前取出，放至室溫使用。

1.2.2 熒光光譜的測量條件

熒光發(fā)射光譜測量條件：激發(fā)波長283nm，掃描波長范圍為290～450nm，掃描步長1nm，激發(fā)帶寬10nm，發(fā)射帶寬5nm，增益中（650V），掃描次數(shù)為3次。

三維熒光光譜測定條件：激發(fā)光波長范圍為200～500nm;發(fā)射光波長范圍為200～500nm：激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5mm;激發(fā)光波長掃描間隔為5nm;掃描步長1nm。

每次測定前，均要用高純水潤洗石英比色皿3次，再用待測液潤洗2～3次，每次測量均用同一比色皿。

2 結果與討論

2.1 DDAF與BSA相互作用適宜條件的研究

2.1.1 不同濃度DDAF對BSA的熒光強度的影響

取編號為0～7號的10mL容量瓶，用1mL移液管分別準確移取1mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液，再用10mL移液管分別移入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0ml，2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，最后用高純水定容，搖勻，靜置15min，用熒光分光光度計，按照1.2.2項下熒光發(fā)射光譜測量條件，測量待測液中BSA的熒光強度，結果見表1和圖2。

從表1和圖2可以看出，隨著DDAF濃度的升高，BSA的熒光強度從503.6降至418.7，并且最大發(fā)射波長由342.3nm藍移到333.3nm，說明DDAF對BSA有猝滅作用[7]。BSA分子的熒光發(fā)射光譜在270～350nm有吸收，這種吸收主要來自色氨酸（Ttp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基。Ttp、Tyr和Phe產(chǎn)生不同的熒光光譜，其熒光峰（λ_max）分別位于348nm、303nm和282nm，熒光強度比約為100：9：0.5，即Trp的熒光強度最大，因而可以認為342.3mm的熒光峰主要由Ttp所產(chǎn)生的[8]。熒光峰發(fā)生藍移說明蛋白質轉向了一個更加疏水的環(huán)境，說明DDAF結合在了BSA的Trp殘基附近，導致7知殘基周圍環(huán)境的疏水性增強。

2.1.2 作用時間對BSA/DDAF相互作用的影響

取編號為0、1的100mL容量瓶，準確吸取10mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液于。號容量瓶，用高純水定容至刻度;并準確吸取10mL 1.0×10^-4mol/LBSA溶液于1號容量瓶，再準確吸取10mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容至刻度。全部待測液配完后開始計時，按照1.2.2項下熒光發(fā)射光譜測量條件，分別測量靜置0，15，30，45，60，75，90，105，120min后待測液的熒光強度。測得的結果如圖3所示。

由圖可知，在0～120min內，隨著時間的延長，未加入和加入DDAF的兩組待測液中BSA的熒光強度分別基本維持在497、480左右，可能是二者相互作用的速度較快，且二者的復合物比較穩(wěn)定。理論上說后續(xù)的實驗可以在溶液配完之后立即檢測，但考慮到后續(xù)研究作用機制的實驗需要保溫，為盡量避免無關因素的干擾，選擇15min作為每項實驗的適宜反應時間。

2.1.3 鈉離子濃度對BSA/DDAF體系熒光強度的影響

離子強度對DDAF和BSA的相互作用具有一定影響，本文研究了NaCl濃度對DDAF和BSA的相互作用的影響。取A、B兩組編號均為0-8的 10mL容量瓶，A組用1mL移液管準確移入1.0mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液，再分別準確移入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mL 0.1mol/L NaCl溶液，高純水定容，搖勻。B組按上述操作加入1.0×10^-4mol/L BSA和0.1mol/L NaCl溶液，再加入1mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容，搖勻，靜置15min，按照1.2.2項下熒光發(fā)射光譜測量條件，測定待測液的熒光強度，所得結果見圖4。

從圖中可以看出，鈉離子濃度在0～0.04mol/L區(qū)間時，隨著離子濃度的升高，A組待測液的熒光強度逐漸由483.4上升到503.4，上升了20個單位，而B組待測液熒光強度則由463.4上升到493.34，上升了30個單位。這說明NaCl的存在可能不僅會影響B(tài)SA本身的熒光強度，也影響了DDAF與BSA的結合，文獻[9]也報道過類似情況。同時可以看出，鈉離子濃度達到0.04mol/L時，隨著離子濃度的升高，A、B兩組待測液的熒光強度分別基本穩(wěn)定在503、493，這說明鈉離子對BSA/DDAF的影響達到飽和。因此，選用0.04mol/L NaCl溶液作為適宜的鈉離子強度。

2.1.4 不同酸堿度對BSA/DDAF體系熒光強度的影響

取編號為0～5的100mL容量瓶，均準確移入10mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液和40mL 0.1mol/LNaCl溶液，再分別準確移入0，10，20，30，40，50mL2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容，搖勻，靜置15min。分別準確吸取30mL止此待測液，置于A、B兩組50mL燒杯中，A燒杯中適量滴加0.1mol/L HCl溶液，調節(jié)待測液pH值分別為2.7、3.7、4.7、5.7、6.7（待測液的原始pH值），B燒杯中滴加適量0.1mol/L NaOH溶液，調節(jié)待測液的pH值分別為7.4、7.7、8.7、9.7、10.7、按照1.2.2項下熒光發(fā)射光譜測量條件，分別測量待測液的熒光強度，所得結果見表2和圖5。

可以看出，未加入猝滅劑的待測液中，當pH值為5.7時，BSA的熒光強度最強;當pH值在4.7～7.7范圍內BSA的熒光強度大而且較為穩(wěn)定;當pH值在2.7～4.7范圍內，隨著待測液酸性的增強，體系的熒光強度均下降;當pH為7.7～10.7范圍內，隨著待測液堿性的增強，體系的熒光強度也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢，但后者的降幅比前者大。這可能是因為天然的BSA等電點為pH4.6～4.8[10-12]，而體系中加了0.04mol/L的NaCl溶液，可能使BSA的等電點升高[13]到pH5.7附近，此時BSA以分子狀態(tài)存在，比較穩(wěn)定，因此熒光最強，而過量的酸堿會使BSA的分子存在狀態(tài)發(fā)生改變，導致熒光強度下降，并且可以看出堿性環(huán)境對于BSA熒光強度的影響較大。

當加入2.06×10^-5mol/L DDAF溶液后，在pH值為2.7、3.7、4.7、5.7、6.7時，待測液的熒光強度與未加入DDAF時的熒光強度差值分別為8.6、7.7、4.6、6.2、7.8、而當pH值為7.4、7.7、8.7、9.7、10.7時，差值分別為12.3、13.4、47.4、22.5、35.3。由此可看出堿性環(huán)境下，DDAF對于BSA的猝滅作用較強?？赡苁且驗镈DAF屬于季銨鹽陽離子表面活性劑，堿性環(huán)境有利于含氮陽離子部分的解離，從而增強DDAF對于BSA熒光的猝滅作用。由于pH在4.7～7.7范圍內，BSA的熒光強度大而且較為穩(wěn)定，又由于BSA初始pH值為6.7、在此范圍之內，考慮到實驗操作的簡化，選擇BSA的初始pH值即pH6.7為適宜的pH值。

2.2 DDAF與BSA相互作用機理的研究

2.2.1 DDAF對BSA熒光猝滅機制的研究

取A、B、C、D4組編號為0～5的10mL容量瓶，每組加入1mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液和4.0mL 0.1mol/L NaCl溶液，每組再分別加入0～5mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容，搖勻，A、B、C、D4組分別在290.15 K、296.15K、303.15K、310.15K下保溫15min，按照1.2.2項下熒光發(fā)射光譜測量條件，測定待測液的熒光強度，所得結果如表3所示。

采用Stern-Volmer方程[14]處理數(shù)據(jù)：

F₀/F=1+K_qτ₀[Q]=1+K_SV[Q]（1）式中F₀為未加入DDAF時BSA的熒光值;F為加入DDAF后BSA的熒光值;[Q]表示DDAF的摩爾濃度;K_q為雙分子猝滅速率常數(shù);τ₀表示生物大分子的平均壽命，約為1×10^-8s：K_SV表示Stern-Volmer動態(tài)猝滅常數(shù)。以F₀/F為縱坐標，[Q]為橫坐標作圖，結果見圖6。計算不同溫度下（290.15，296.15，303.15，310.15K）DDAF對BSA的動態(tài)猝滅常數(shù)，結果見表4。

常見的猝滅類型有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)隨溫度升高而降低，但均大于2.0×10¹⁰L/（mol·s），動態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大[15]。由表4可知，在290.15K、296.15K、303.15K和310.15K下，雙分子猝滅常數(shù)K_q分別為7.03×10₁₀，8.53×10¹⁰，1.09×10¹¹，1.12×10¹¹L/（mol·s），均大于2.0×10¹⁰L/（mol·s），是靜態(tài)猝滅，但隨溫度升高，K_q值卻一直上升，又是動態(tài)猝滅的現(xiàn)象。文獻也報道過類似情況，認為是混合機制[16]，因此，DDAF與BSA的相互作用可能也是動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅的混合機制所致。

2.2.2 DDAF與BSA作用的結合常數(shù)、結合位點的確定

結合常數(shù)和結合位點是研究物質與BSA相互作用的重要參數(shù)。熒光強度和猝滅劑的關系可用修正的Stern-Volmer雙對數(shù)方程來描述[17]，即：

1g[（F₀-F）/F]=1gK_a+nlg[Q]（2）式中F₀為未加入DDAF時BSA的熒光強度;F表示加入不同濃度DDAF后BSA的熒光強度;K_a為結合常數(shù);n為結合位點數(shù);[Q]為DDAF的摩爾濃度。以lg[（F₀-F）/F]對1g[Q]作圖，如圖7所示。由直線的斜率和截距可計算出相應的結合位點n和結合常數(shù)K_a，所得結果見表5。

由表5可知，在290.15K、296.15K、303.15K和310.15K下，結合常數(shù)的數(shù)量級在10³左右，說明DDAF與BSA的結合較弱;4個溫度下的結合位點數(shù)分別為1.17、0.84、0.97、1.02，都接近1，說明DDAF與BSA的結合比為1：1。

2.2.3 DDAF與BSA相互作用力的研究

有機小分子與生物大分子的相互作用力可用如下3個熱力學函數(shù)來判斷：

△G=-RT1nKa（3）

△G=△H-T△S（4）

ln[K_a2/K_a1]=[1/T₁-1/T₂]△H/R（5）

計算結果見表6，由表可知，△G都小于0，說明DDAF與BSA的相互作用是在自發(fā)條件下進行的;△H和△S均大于0，表明DDAF和BSA的相互作用力是典型的疏水作用力[18]。

2.2.4 DDAF對BSA構型的影響研究

三維熒光光譜是以激發(fā)波長、發(fā)射波長、熒光強度分別為X、Y和Z軸，所得到的熒光圖譜，能夠更加全面反映待測品的熒光信息[19]?？梢越璐搜芯緿DAF對BSA構型的影響。

取0和1號10mL容量瓶，分別準確加入1mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液和4mL 0.1mol/L NaCl溶液，并在1號瓶中加入5mL 2.06×10^-4mol/L DDAF，0和1號容量瓶均用高純水定容，搖勻，靜置15min后，用熒光分光光度計，按照1.2.2項下三維熒光光譜測量條件，測定待測液的熒光強度。所得數(shù)據(jù)見表7，待測液的三維熒光光譜見圖8。

熒光峰反映了BSA中氨基酸的疏水環(huán)境[20]，由表7可知，加入DDAF后，BSA的熒光峰的強度下降了16.63%，說明DDAF對BSA分子中的氨基酸殘基有影響;最大發(fā)射波長由343nm藍移到336nm，說明DDAF的加入會使BSA分子中的氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強。

3 結束語

本文通過單因素實驗，選定作用時間為15min;鈉離子濃度為0.04mol/L;待測液的初始pH值為適宜的實驗條件;并且，可以看出pH對于DDAF/BSA體系的熒光強度影響最大，鈉離子的影響次之，作用時間的影響最小。在上述適宜實驗條件下，進行DDAF與BSA相互作用的研究，認為DDAF對BSA熒光猝滅的機制可能為混合猝滅;二者以1：1結合;二者間的作用力是典型的疏水作用力。三維熒光光譜表明，DDAF的加入使得BSA氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強。

本文采用熒光光譜法和三維熒光法研究了DDAF與BSA相互作用，研究結果表明，DDAF與BSA會形成靜態(tài)復合物，而且DDAF的加入使得BSA氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強，這些均表明DDAF的加入可能使得BSA化學結構發(fā)生變化，從而影響蛋白質的生理功能。這為 DDAF殺、抑菌作用機制的研究提供了一些有益的結論。另外，由于條件及時間有限，我們對于DDAF與BSA相互作用及研究僅僅采用了熒光光譜法及三維熒光光譜法，我們將在以后采用紫外分光光度法、同步熒光法、圓二色相光譜法等等方法來進一步研究。

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（編輯：莫婕）