尹 娟，朱超望，眭 陽(yáng)，周莉靖，江 春，王瑩超

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院北區(qū)檢驗(yàn)中心，江蘇蘇州 215008)

隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在臨床上的大量使用，耐碳青霉烯類(lèi)藥物的革蘭陰性桿菌，如肺炎克雷伯菌(KPN)、粘質(zhì)沙雷菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌等耐藥菌的檢出率逐年上升。其中產(chǎn)碳青霉烯酶的KPN在臨床樣本中的分離率位于前列[1]。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥機(jī)制分兩大類(lèi)：產(chǎn)碳青霉烯酶和非產(chǎn)碳青霉烯酶，并以前者為主。按照Ambler分子分類(lèi)方法可將碳青霉烯酶分為A、B、D三類(lèi)。A類(lèi)和D類(lèi)為絲氨酸酶，B類(lèi)為金屬酶。A類(lèi)中的KPC，B類(lèi)中的NDM、VIM、IMP和D類(lèi)中的OXA-48是腸桿菌科細(xì)菌中最常見(jiàn)的碳青霉烯酶。碳青霉烯酶基因可通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子等在同種菌或不同菌種間傳播，導(dǎo)致多種革蘭陰性桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥，給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[2-4]。因此，提高臨床微生物實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)耐碳青霉烯類(lèi)細(xì)菌碳青霉烯酶的檢出率及分型的能力，有助于控制碳青霉烯酶基因在菌種間的傳播。

乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活(eCIM)是2018年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的一種最新的可對(duì)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶表型分型的方法[5]。eCIM與改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)聯(lián)合使用可區(qū)分產(chǎn)金屬酶和絲氨酸酶碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌。與金標(biāo)法PCR相比，這種方法不需購(gòu)買(mǎi)特殊試劑和儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，易于在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室推廣，可為臨床抗感染用藥提供重要參考。本研究以臨床微生物室分離的耐碳青霉烯類(lèi)藥物的KPN為研究對(duì)象，擬探討在臨床應(yīng)用實(shí)踐過(guò)程中，eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)對(duì)KPN耐碳青霉烯酶的檢出率及分型準(zhǔn)確率。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年9月至2018年1月蘇州市立醫(yī)院住院患者臨床樣本分離KPN非重復(fù)株684株，經(jīng)BD Phoenix儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，選擇其中耐碳青霉烯類(lèi)(亞胺培南和美羅培南)KPN 94株作為研究對(duì)象。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株：KPN ATCCBAA 1705(KPC陽(yáng)性，絲氨酸碳青霉烯酶產(chǎn)生株)，KPN ATCCBAA 1706(碳青霉烯酶陰性株)，KPN ATCCBAA 2146(NDM陽(yáng)性，金屬酶產(chǎn)生株)。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD公司，型號(hào)Phoenix 100；MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；金屬浴購(gòu)自中國(guó)蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)TZL-150-2C；低溫超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)microfuge 22R centrifuge；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，型號(hào)ARKTIK；核酸電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)上海天能科技有限公司，型號(hào)5200 multi；超低溫冰箱購(gòu)自中國(guó)海爾公司。

哥倫比亞血平板、麥康凱平板、MH平板購(gòu)自中國(guó)鄭州安圖生物公司；胰蛋白胨大豆肉湯購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉公司；亞胺培南和美羅培南藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXIOD公司，規(guī)格10 μg；Taq PCR Master Mix、瓊脂糖M、TAE緩沖液、4S Red Plus核酸染色劑、6×聚蔗糖凝膠上樣緩沖液Ⅲ均購(gòu)自中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司；所有引物由中國(guó)蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌鑒定及藥物敏感試驗(yàn) 標(biāo)本分區(qū)劃線接種于血平板和麥康凱平板后，根據(jù)菌落形態(tài)特征分離KPN單菌落，使用BD Phoenix100全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果參照CLSI 2018年版標(biāo)準(zhǔn)判讀。收集對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥的KPN，菌株鑒定經(jīng)MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀確認(rèn)，亞胺培南和美羅培南藥敏數(shù)據(jù)經(jīng)K-B法確認(rèn)。用含40%甘油的LB液體培養(yǎng)基保存KPN于-70 ℃超低溫冰箱。

1.3.2eCIM聯(lián)合mCIM對(duì)碳青霉烯酶進(jìn)行分型試驗(yàn) mCIM試驗(yàn)：取1.0 μL接種環(huán)滿(mǎn)環(huán)刮取血瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)純菌落，接種于2.0 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，渦旋震蕩混勻10～15 s，每管放入1張含10 μg美羅培南的無(wú)菌紙片，確認(rèn)紙片浸沒(méi)于菌懸液中，35 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h。孵育結(jié)束時(shí)，用生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌ATCC 25922懸液；用10.0 μL接種環(huán)將美羅培南紙片從胰蛋白胨大豆肉湯中取出，將紙片貼于試管內(nèi)壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MH平板上。100 mm的MH平板貼4張紙片，倒置平板，35 ℃培養(yǎng)箱孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。

eCIM試驗(yàn)：取第2支含2.0 mL胰蛋白胨大豆肉湯的小型離心管，管壁上標(biāo)記細(xì)菌名稱(chēng)。加入20.0 μL 0.5 μmol/L乙二胺四乙酸溶液于2.0 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，乙二胺四乙酸最終濃度為5.0 mM，剩下步驟同mCIM試驗(yàn)。mCIM和eCIM試驗(yàn)同步進(jìn)行，mCIM和eCIM試驗(yàn)管中的美羅培南紙片貼于同1塊已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MH平板上。

結(jié)果判讀的方法如下。mCIM試驗(yàn)：抑菌圈直徑為6～15 mm或?yàn)?6～18 mm但其內(nèi)有散在菌落生長(zhǎng)，為產(chǎn)碳青霉烯酶陽(yáng)性菌株。抑菌圈直徑≥19 mm,為碳青霉烯酶陰性菌株。抑菌圈直徑在16～18 mm，不確定是否存在碳青霉烯酶。eCIM試驗(yàn)：與mCIM結(jié)果相比，美羅培南抑菌圈直徑之差≥5 mm，為金屬酶陽(yáng)性菌株。與mCIM結(jié)果相比，美羅培南抑菌圈直徑之差<4 mm，為金屬酶陰性菌株。當(dāng)mCIM結(jié)果為陰性時(shí)，不解釋eCIM結(jié)果，因?yàn)樘记嗝瓜┟笝z測(cè)為陰性。mCIM陽(yáng)性，eCIM陽(yáng)性，報(bào)告為金屬酶陽(yáng)性。mCIM陽(yáng)性，eCIM陰性，報(bào)告為絲氨酸酶碳青霉烯酶檢測(cè)陽(yáng)性。

1.3.3菌株DNA提取 金屬浴裂解法提取細(xì)菌總DNA。取臨床分離保存于超低溫冰箱的菌株，室溫復(fù)蘇后平板劃線培養(yǎng)于血平板，35 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。挑取單個(gè)菌落加入預(yù)先分裝有1 mL無(wú)菌蒸餾水的1.5 mL 小型離心管中，置于100 ℃金屬浴，高溫裂解15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液100.0 μL分裝凍存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4碳青霉烯酶基因PCR檢測(cè) PCR法檢測(cè)5種碳青霉烯酶基因：KPC-2、OXA-48、IMP、NDM-1、VIM。反應(yīng)體系為25.0 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物(10.0 μmol/L)各1.0 μL、DNA模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s,退火(KPC-2 59 ℃；OXA48 57 ℃；IMP 57 ℃；NDM1 60 ℃；VIM 57 ℃)30 s，72 ℃延伸(KPC-2 1 min；OXA48 45 s；IMP 2 s；NDM1 48 s；VIM 32 s)。產(chǎn)物經(jīng)1 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)分析。PCR引物參照文獻(xiàn)[6-7]設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 碳青霉烯酶基因PCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS軟件對(duì)eCIM聯(lián)合mCIM及PCR法對(duì)碳青霉烯酶分型及檢出率進(jìn)行χ2分析，P>0.05表示二者結(jié)果一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)檢測(cè)KPN碳青霉烯酶分型結(jié)果 94株試驗(yàn)株中，mCIM試驗(yàn)陰性7株(碳青霉烯酶陰性)，mCIM試驗(yàn)陽(yáng)性87株，eCIM陰性(絲氨酸酶表型)75株，eCIM陽(yáng)性(金屬酶表型)12株，見(jiàn)圖1、表2。

2.2PCR檢測(cè)KPN碳青霉烯酶基因結(jié)果 75株eCIM陰性菌株中PCR檢測(cè)到絲氨酸酶基因KPC-2陽(yáng)性75株。12株eCIM試驗(yàn)陽(yáng)性(金屬酶表型)菌株中PCR檢測(cè)到IMP基因陽(yáng)性12株，未檢測(cè)到NDM-1和VIM基因，其中1例同時(shí)檢測(cè)到了KPC-2基因，即同時(shí)攜帶絲氨酸酶和金屬酶兩種基因。見(jiàn)圖2、表3。

表2 eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)檢測(cè)KPN碳青霉烯酶分型結(jié)果(n)

圖1 eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)碳青霉烯酶分型結(jié)果示例

表3 KPN碳青霉烯酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果

注：*表示有1例IMP陽(yáng)性菌株同時(shí)檢測(cè)到KPV-2陽(yáng)性

2.3兩種方法對(duì)KPN碳青霉烯酶檢測(cè)的一致性分析 eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)和PCR法對(duì)KPN碳青霉烯酶檢出率及分型，二者結(jié)果一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

圖2 部分菌株KPC-2陽(yáng)性和IMP陽(yáng)性凝膠電泳圖

表4 兩種方法對(duì)KPN碳青霉烯酶檢出率的比較

3 討 論

近年來(lái)碳青霉烯類(lèi)耐藥菌在臨床樣本中的分離率日益上升。有研究統(tǒng)計(jì)了2014-2015年，中國(guó)27個(gè)省市的KPN、大腸埃希菌碳青霉烯酶耐藥率分別為8%和2%，其中KPN占耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科的70%，位居首位，92%的KPN產(chǎn)碳青霉烯酶，主要基因型為KPC(63%)和NDM(34%)，有2%的菌株同時(shí)表達(dá)KPC和NDM[1]。碳青霉烯酶基因主要通過(guò)質(zhì)粒傳播，給臨床抗感染治療及醫(yī)院感染控制帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)碳青霉烯酶表型常見(jiàn)方法有改良Hodge試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)和mCIM試驗(yàn)等，但都無(wú)法對(duì)金屬酶和絲氨酸酶表型進(jìn)行區(qū)分[8-12]。本文通過(guò)CLSI 2018版推薦eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)檢測(cè)臨床KPN碳青霉烯酶并分型，結(jié)果與PCR法相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)可對(duì)絲氨酸酶和金屬酶兩種碳青霉烯酶類(lèi)型進(jìn)行快速分型，并不需特殊試劑和特定儀器設(shè)備，準(zhǔn)確率高[13]。雖此法在檢測(cè)同時(shí)攜帶金屬酶和絲氨酸酶基因的菌株時(shí)，只能發(fā)現(xiàn)金屬酶表型，但在兩種基因同時(shí)攜帶流行的概率并不高的情況下，對(duì)碳青霉烯酶類(lèi)耐藥腸桿菌(CRE)菌株篩查碳青霉烯酶并分型，按照CLSI 2018版的標(biāo)準(zhǔn)給臨床報(bào)告eCIM陽(yáng)性(金屬酶)或陰性(絲氨酸酶)，可為臨床用藥提供重要參考依據(jù)。

臨床抗CRE感染治療常聯(lián)合使用多種抗菌藥物。碳青霉烯類(lèi)藥物(亞胺培南、美羅培南等)的大量使用導(dǎo)致CRE菌株流行。頭孢他啶-阿維巴坦是2015年在美國(guó)被批準(zhǔn)用于治療產(chǎn)KPC或OXA-48等絲氨酸酶菌株感染的復(fù)方藥物[14-15]。若臨床醫(yī)生根據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，在對(duì)eCIM試驗(yàn)陰性的CRE菌株的抗感染治療中及時(shí)選擇如頭孢他啶-阿維巴坦等對(duì)產(chǎn)絲氨酸酶菌株特異作用的藥物，精準(zhǔn)用藥，可減少產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的院內(nèi)流行，控制感染，提高患者生存率。

4 結(jié) 論

eCIM聯(lián)合mCIM試驗(yàn)檢測(cè)KPN中碳青霉烯酶分型，與PCR結(jié)果一致性高，不需購(gòu)買(mǎi)特殊試劑，操作簡(jiǎn)便，易于推廣，可為臨床抗感染用藥及醫(yī)院感染控制提供參考依據(jù)。