朱珺，錢永清，孫盛，陳作國，陳蘇

(杭州娃哈哈科技有限公司，浙江 杭州，310018)

隨著人們生活水平提高與健康意識加強，通過飲食調(diào)整促進自身健康的觀念日益得到認同。乳酸菌發(fā)酵可賦予產(chǎn)品更為豐富的口感，同時賦予其更豐富的健康功能。近幾十年來，乳酸菌發(fā)酵飲品的消費量日益擴大，呈倍數(shù)增長[1]。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品也不再限于發(fā)酵乳制品。發(fā)酵果蔬汁飲料概念自2014年提出后逐漸被行業(yè)所關(guān)注[2]。發(fā)酵后的果蔬汁相比一般果蔬汁具有更為豐富的營養(yǎng)和功能成分，如VC、VK、葉酸、β-胡蘿卜素、多酚類物質(zhì)等[3-4]。乳酸菌作為人及動物腸道的益生菌，具有維持腸道生態(tài)平衡、提高機體免疫力等多種生理功能[5]。開發(fā)具有多種功能的乳酸菌發(fā)酵飲品，強化其保健作用將成為未來的發(fā)展方向[1]。同時，這對于可應(yīng)用于果蔬汁發(fā)酵的成熟發(fā)酵劑產(chǎn)品也提出了更為迫切的需求。

乳酸菌本身的益生功能可為消費者提供更多的有益因素。隨著現(xiàn)代人飲食結(jié)構(gòu)的變化、心理因素和社會因素的影響，便秘的發(fā)病率有增高趨勢。全球約16%的人群被功能性便秘困擾[6]。益生菌在發(fā)揮其潤腸通便等腸道調(diào)節(jié)功能時，相比其他藥物具有安全、無副作用等明顯優(yōu)勢[7]。本研究從四川地區(qū)自然發(fā)酵的農(nóng)家泡菜樣品中分離乳酸菌，篩選獲得1株同時具有良好植物基發(fā)酵性能與良好益生特性的菌株，為開發(fā)安全、有效且可應(yīng)用于果蔬汁發(fā)酵的功能發(fā)酵劑產(chǎn)品提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

8株植物乳桿菌，植物乳桿菌553、557、566、573、578、581、590、596分離自四川甘孜藏族自治州、阿壩藏族羌族自治州、涼山彝族自治州等地區(qū)農(nóng)戶采用傳統(tǒng)方法制作的自然發(fā)酵泡菜樣品。植物乳桿菌581(Lactobacillusplantarum581)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，微生物保藏號CGMCC No.13121。

1.2 儀器與材料

Type B2 Steril GARD Ⅲ生物安全柜，美國Baker公司； Delta 320 pH計，瑞士Mettler Toledo公司；5810 R離心機，日本Olympus株式會社；DNP-111電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海海向儀器的設(shè)備廠。

MRS培養(yǎng)基，英國Oxoid生物試劑有限公司；牛膽鹽分析純試劑，廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；HT-29細胞株，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；ICR雄性SPF級小鼠，浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動物試驗中心；麻仁丸，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司；復(fù)方地芬諾酯，常州康普藥業(yè)有限公司；活性炭、阿拉伯樹膠，北京寶瑞杰科技有限公司。

紫薯汁、胡蘿卜汁、大蒜濃縮汁、姜汁，金鄉(xiāng)縣金得利食品有限公司；香蕉汁、芒果汁，山東佳美食品工業(yè)有限公司；蘆薈汁，云南萬綠生物股份有限公司。

1.3 菌株培養(yǎng)

于-80℃條件下冷凍保存的乳酸菌種子液，室溫解凍后，以2%接種比例接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)16 h，連續(xù)活化2代。

1.4 耐酸性試驗

植物乳桿菌581菌株培養(yǎng)至對數(shù)末期后，取適量菌液。4 000 r/min離心10 min后，棄上清，分別加入pH值為2.0和2.5的MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，于0、1、2、4 h后采用平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)，每組3次平行。

1.5 耐膽鹽試驗

植物乳桿菌581菌株培養(yǎng)至對數(shù)末期后，取適量菌液。4 000 r/min離心10 min后，棄上清，分別加入含有0.3%和0.6%(質(zhì)量分數(shù))膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，于0、4、8 h后用平板計數(shù)法測定其活菌數(shù)，每組3次平行。

1.6 通便功能評價試驗

1.6.1 動物飼養(yǎng)與分組

參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003版中通便功能檢驗方法[8]。

試驗動物選擇6周齡ICR雄性小鼠220只。動物飼養(yǎng)保持環(huán)境溫度為(21±2)℃，濕度為 30%～70%，12 h光照交替，自由飲水，自由攝入小鼠維持飼料。試驗小鼠自購入起適應(yīng)1周后，按體重進行隨機分組。排便試驗與小腸運動性試驗各分為11組，每組10只。

11組包括陰性對照組、模型組、陽性對照組與8組給藥組。8組給藥組分別灌胃植物乳桿菌581、553、557、566、573、578、590、596。分別制備上述8株植物乳桿菌菌株的冷凍干燥菌粉，采用平板培養(yǎng)法對凍干菌粉進行活菌計數(shù)。取一定量菌粉，重懸于無菌生理鹽水，用于小鼠灌胃。菌粉給藥劑量為3×109CFU/kg小鼠體重。陽性對照組灌胃麻仁丸試液，灌胃劑量為2 g/kg小鼠體重。劑量換算依據(jù)如表1所示。陰性對照組與模型組分別灌胃等量的無菌生理鹽水。受試樣品連續(xù)給喂7 d。

表1 人體服用量與小鼠灌胃量換算Table 1 The dosage for human body and mice

注：#小鼠服用劑量按人體服用量10倍進行換算，正常人體體重按60 kg進行換算。

1.6.2 模型的建立

排便試驗組：第1組小鼠于受試樣品給喂7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h，模型組、陽性對照組與給藥組灌胃復(fù)方地芬諾酯懸液(10 mg/kg小鼠體重)進行造模，陰性對照組給予等量的蒸餾水。

小腸運動性試驗組：第2組小鼠于受試樣品給喂7 d后，禁食不禁水，模型組、陽性對照組與給藥組灌胃復(fù)方地芬諾酯懸液(5 mg/kg小鼠體重)進行造模，陰性對照組給予等量的蒸餾水。

1.6.3 指標(biāo)的測量

排便試驗組：給予復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，各組小鼠灌胃墨汁(含5%活性碳粉，10%阿拉伯樹膠)，觀察并記錄每只小鼠的首粒排黑便時間、6 h內(nèi)排黑便的粒數(shù)及重量。

小腸運動性試驗組：給予復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，灌胃墨汁，25 min后立即處死并打開腹腔，測量小腸總長度與墨汁推進長度，計算墨汁推進率(%)=墨汁推進長度(cm)/小腸總長度(cm)×100。

1.7 發(fā)酵果蔬汁試驗

分別取芒果汁、香蕉汁、紫薯汁、蘆薈汁、胡蘿卜汁、大蒜汁、姜汁，稀釋至Brix=12后，于95℃下滅菌5 min。待料液冷卻至30℃后，將植物乳桿菌581以0.002%(1.0×107CFU/mL)的添加量接種到發(fā)酵基料中，37℃下進行發(fā)酵。在發(fā)酵后16 h測定基料的pH變化與活菌數(shù)，對發(fā)酵后果蔬汁進行感官品嘗。

1.8 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準差”表示。顯著性分析采用SPSS 19.0軟件，利用單因素方差分析(ANOVA)兩兩比較中的Duncan法進行分析,以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的判斷標(biāo)準。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸性試驗

植物乳桿菌581的耐酸性結(jié)果如表2所示。經(jīng)過4 h的孵育試驗，植物乳桿菌581在pH 2.5與pH 2.0的酸環(huán)境下都呈現(xiàn)了較強的耐酸性。在pH 2.5的條件下作用4 h后，581的活菌數(shù)降低(0.157±0.104)個數(shù)量級。當(dāng)pH值下降到2.0時，581的活菌數(shù)在孵育4 h后降低(0.243±0.035)個數(shù)量級。食物在胃部停留的時間一般為2～4 h。人體胃液中的pH值因飲食不同波動較大，空腹或食用酸性食品時pH值最低可達到1.5時，食用堿性食物時pH可達4.0～5.0，通常pH值為3.0左右[9]。以上結(jié)果表明植物乳桿菌581具有良好的耐酸特性。

表2 植物乳桿菌 581對酸的耐受性Table 2 Acid-tolerance of L.plantarum 581

注：“—”表示無。

2.2 耐膽鹽試驗

由表3可知，植物乳桿菌 581 在0.3%(質(zhì)量分數(shù))膽鹽作用4 h后，菌數(shù)降低(0.994±0.168)個數(shù)量級。延長作用時間至8 h后，菌數(shù)降低(1.084±0.257)個數(shù)量級，仍在1個數(shù)量級左右。將膽鹽質(zhì)量分數(shù)提升至0.6%后，植物乳桿菌581的菌數(shù)在4和8 h作用時間下分別降低(1.205±0.096)和(1.378±0.205)個數(shù)量級。延長作用時間和提升膽鹽濃度對 581菌數(shù)影響不大。人體內(nèi)膽鹽質(zhì)量分數(shù)一般在0.3%以下波動[10]，因此植物乳桿菌 581在體內(nèi)環(huán)境下能更好的存活。

表3 植物乳桿菌581對膽鹽的耐受特性Table 3 Bile salt-tolerance of L.plantarum 581

注：—表示無。

2.3 通便功能評價試驗

2.3.1 排便試驗

試驗期間，各處理組小鼠均未出現(xiàn)不良癥狀。排便試驗結(jié)果如表4所示。與陰性對照組相比，模型組小鼠的首次排黑便時間顯著增加(P<0.01)，6 h排黑便粒數(shù)和排黑便質(zhì)量均顯著降低(P<0.01)，表明使用復(fù)方地芬諾酯構(gòu)建小鼠便秘模型成功。

與模型組相比，灌胃581菌株的小鼠首次排黑便時間(P<0.01)、 6 h排黑便粒數(shù)(P<0.01)和排黑便質(zhì)量(P<0.01)均得到顯著改善。同樣分離自四川泡菜樣品的其余7株植物乳桿菌中，僅566和596菌株灌胃組小鼠的首次排便時間、 6 h排便粒數(shù)與排便質(zhì)量顯著改善(P<0.05)，但效果均不及581菌株。同時，581菌株對首次排黑便時間(P<0.01)與6 h排黑便粒數(shù)(P<0.05)2項指標(biāo)的改善效果也顯著優(yōu)于陽性對照的麻仁丸藥物服用組。

表4 不同菌株對便秘小鼠各排便指標(biāo)的影響Table 4 Effects of different strains of lactobacillus on defecation in constipation rice model

注：平均值±標(biāo)準差。標(biāo)注*表示與模型組相比具有顯著性差異，P<0.05；標(biāo)注**表示與模型組相比具有極顯著性差異，P<0.01。

2.3.2 小腸運動性試驗

試驗期間，各處理組小鼠均未出現(xiàn)不良癥狀。小腸運動性試驗結(jié)果如表5所示。模型組小鼠的墨汁推進率與陰性對照組相比顯著降低(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比，灌胃植物乳桿菌581可顯著提高小腸的墨汁推進率(P<0.01)，其作用效果與陽性對照組相當(dāng)(P>0.05)。

表5 不同菌株對小鼠墨汁推進率的影響Table 5 Effects of different strains on the ink propelling rates in mice model

2.4 發(fā)酵果蔬汁試驗

植物乳桿菌581在多種果蔬汁中的發(fā)酵情況如表6所示。經(jīng)581菌株發(fā)酵后，果蔬汁本身的體系與色澤無顯著影響，也未觀察到任何不良風(fēng)味。在pH值較低的高酸性果汁體系中，581菌株也可以進行發(fā)酵。芒果汁發(fā)酵前pH=3.91，發(fā)酵后pH=3.28，發(fā)酵液中活菌數(shù)達1.57×109CFU/mL。對于胡蘿卜汁、大蒜汁、生姜汁，發(fā)酵后料液中原本帶有的生沖味道明顯減少，口感更加柔和綿厚，醇香可口。同時，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸以及其他風(fēng)味物質(zhì)也為多款果蔬汁增加了清新、酸爽的口感。

高的活菌數(shù)是益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)標(biāo)準之一。本研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌581在胡蘿卜汁中發(fā)酵活力最強，發(fā)酵后活菌數(shù)可達1.24×109CFU/mL。安興娟等[11]以胡蘿卜和枸杞為原料，經(jīng)單因素試驗與正交優(yōu)化，制作的發(fā)酵果蔬汁中最終活菌數(shù)為7.1×107CFU/mL?；罹鷶?shù)的高低是益生菌發(fā)揮益生功效的前提與基礎(chǔ)，但前期一些相關(guān)研究未關(guān)注發(fā)酵果蔬汁中的活菌數(shù)[12-13]。

表6 植物乳桿菌581在多種果蔬汁中的發(fā)酵情況Table 6 Use of L.plantarum 581 in fermented fruit and vegetable juice

3 結(jié)論與討論

乳酸菌的分離鑒定和篩選工作對選育優(yōu)良菌株至關(guān)重要，乳酸菌對胃腸道環(huán)境是否具有耐受性、能否順利到達腸道是其發(fā)揮益生功能的前提條件[14-15]。植物乳桿菌581在pH=2.0酸環(huán)境下脅迫4 h后活菌數(shù)降低(0.243±0.035)個數(shù)量級，在0.3%(質(zhì)量分數(shù))膽鹽作用8 h后，活菌數(shù)降低(1.084±0.257)個數(shù)量級。呂源玲[16]從嬰兒糞便中篩選獲得的1株具有最強耐酸耐膽鹽能力的植物乳桿菌，在pH=3.0條件下1、2、3 h后的存活率分別為75%、64%、46%。便秘是由于腸道功能紊亂引起的慢性疾病，主要臨床癥狀有排便困難、排便頻率低、糞便干硬和延長腸道排空時間[17]。本研究表明，服用植物乳桿菌581可以縮短便秘小鼠的首次排便時間，增加小鼠的排便粒數(shù)、排便質(zhì)量，并提高小鼠的小腸墨汁推進速率。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，植物乳桿菌581具有潤腸通便的功能。研究同時比較了分離自四川泡菜樣品的8株植物乳桿菌，植物乳桿菌581菌株在通便功能評價中的各項指標(biāo)均優(yōu)于其他菌株，表明植物乳桿菌在發(fā)揮通便功能方面也表現(xiàn)出明顯的菌株特異性。

植物乳桿菌581在多種果蔬汁中均表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能，在胡蘿卜汁中發(fā)酵活力最強，發(fā)酵后活菌數(shù)可達1.24×109CFU/mL。根據(jù)動物試驗結(jié)果，服用14.5 mL胡蘿卜汁發(fā)酵液即可達到581菌株的有效劑量。胡蘿卜中含有豐富的膳食纖維。高昂等[18]利用擠壓噴霧技術(shù)從胡蘿卜中提取的可溶性膳食纖維占原料質(zhì)量的27.3%?？扇苄陨攀忱w維能通過增加糞便持水力發(fā)揮潤腸通便的功能，膳食纖維經(jīng)乳酸菌分解利用，產(chǎn)生乙酸、丁酸、丙酸等代謝產(chǎn)物，能進一步刺激腸道蠕動[19]。張敏佳等[20]報道了發(fā)酵果蔬汁對功能性便秘與肥胖都具有改善作用。某些植物乳桿菌在發(fā)酵過程中還可提高游離酚、抗壞血酸的含量，增加果蔬汁的抗氧化能力[21-22]。后續(xù)將針對581菌株發(fā)酵果蔬汁的成分變化與益生功能做進一步研究。植物乳桿菌581具備潤腸通便的益生特性和良好的果蔬汁發(fā)酵性能，該菌株可用于功能性發(fā)酵果蔬汁產(chǎn)品的開發(fā)，在提供良好風(fēng)味的同時為消費者提供更多的有益因素。