李超 姬鵬鵬 黃顯章

摘要：為了建立不同產(chǎn)地艾葉藥材的紅外指紋圖譜，為艾葉產(chǎn)地鑒別提供新的技術和方法，采用傅里葉變換紅外光譜技術對國內(nèi)6個主產(chǎn)地的艾葉樣品進行分析，通過圖譜的表征解析、相似度對比、主成分分析及聚類分析等方法，建立艾葉紅外指紋圖譜并探討鑒別不同產(chǎn)地艾葉的方法。結果表明：不同產(chǎn)地艾葉的紅外圖譜相似度較高，但運用適當?shù)挠嬃繉W方法可實現(xiàn)艾葉的產(chǎn)地鑒別;紅外圖譜解析、相關系數(shù)分析及聚類分析等方法可對不同產(chǎn)地艾葉樣品進行正確的分類，結果相互驗證和補充?？梢?，紅外指紋圖譜分析技術適用于艾葉的產(chǎn)地鑒別，該結果為艾葉的產(chǎn)地溯源和質(zhì)量控制提供了一種新的思路。

關鍵詞：艾葉;不同產(chǎn)地;紅外指紋圖譜;相關系數(shù);聚類分析

中圖分類號：R284.1 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0222-03

艾葉為菊科多年生草本植物艾（Artemisia argyi Levl.et Vant.）的干燥葉[1]，性溫，味苦，歸肝經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血、補氣安胎、止咳平喘等功效，是中醫(yī)婦科常用中藥之一[2]。艾葉于夏季花未開時采摘，除極干旱和高寒地區(qū)外，在我國大部分地區(qū)均有分布，主要分布于湖北、浙江、安徽、河南、河北等省份，并在局部植物群落中呈現(xiàn)為優(yōu)勢種群。

近年來，艾產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展帶來了艾葉資源需求的激增，但同時也存在諸多安全隱患，艾葉產(chǎn)地難以溯源及艾葉品質(zhì)參差不齊已成為制約艾產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。前人雖對不同產(chǎn)地艾葉的品質(zhì)評價做了大量的研究工作，為艾葉產(chǎn)地間的差異研究提供了有益的本底材料[3-5]，但前人研究方法具有操作復雜、預處理繁瑣、試驗周期長等缺點。因此，一種操作簡單、快捷準確的試驗方法亟待開發(fā)。

中藥材紅外光譜具有“指紋性”，借助紅外特征吸收的差異可達到區(qū)分和鑒別中藥材的目的，且該技術具有無損、快捷等顯著的優(yōu)點，已成功應用于多種中藥材的產(chǎn)地鑒別[6-11]，但不同產(chǎn)地艾葉藥材的紅外光譜研究尚未開展。因此，本試驗以6個不同主產(chǎn)區(qū)的艾葉樣品為研究對象，建立艾葉紅外指紋圖譜，挖掘指紋譜圖中的潛在差異信息，并結合相似度評價及化學計量學方法，最終對艾葉藥材進行質(zhì)量評價。本研究為艾葉藥材的質(zhì)量控制及產(chǎn)地鑒別提供一種新的技術和方法。

1 材料與方法

1.1 材料收集

2017年5—6月，從河北安國、浙江寧波、湖北蘄春、山東煙臺、河南湯陰及河南西峽采集野生狀態(tài)的艾葉樣品，經(jīng)南陽理工學院中藥教研室黃顯章副教授鑒定為艾的干燥葉。將艾葉樣品去雜、清洗、自然干燥、粉碎、過篩，混勻后備用。

1.2 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀（自帶DTGS檢測器，TENSOR 27型，德國Bruker公司）;分析天平（FA-2204B，上海精密科學儀器有限公司）;萬能粉碎機（FW-135型，天津泰斯特儀器有限公司）;粉末壓片機（FY-15型，上海天闔機械設備有限公司）;紅外干燥箱（8401-2A型，常州諾基儀器有限公司）;KBr（光譜純，南京化學試劑公司）。

1.3 試驗環(huán)境及方法

1.3.1 試驗環(huán)境 不同產(chǎn)地艾葉紅外圖譜的測定在南京農(nóng)業(yè)大學分析測試中心完成，分析過程中溫度保持在22～27 ℃，空氣濕度保持在30%～40%，每個艾葉粉末壓片累積掃描次數(shù)32次，每次掃描時均扣除H2O和CO2的干擾。

1.3.2 試驗方法 稱取艾葉粉末樣品1.0 mg，于瑪瑙研缽內(nèi)與KBr研磨充分（比例約為1 ∶ 200），并壓制成厚度約為1 mm 的透明錠片，放入傅里葉變換紅外光譜儀測定。每個產(chǎn)地均以溴化鉀為背景，制備3個艾葉粉末樣品片，每個樣品片隨機掃描3個不同的位置，獲得3張紅外光譜圖，取計算后的平均譜圖作為最終的艾葉譜圖。

1.3.3 試驗數(shù)據(jù)預處理 將得到的不同產(chǎn)地艾葉原始紅外光譜數(shù)據(jù)進行多點基線校正，除去基線影響;進行自動多點平滑處理，去除噪聲;進行標準歸一化處理，消除樣本間稱量的差異;借助SPSS 20.0分析軟件選取指紋區(qū)域1 300～500-1 cm 進行主成分分析、因子分析及聚類分析等;應用Origin和Omnic軟件拾取特征峰和繪制分析圖譜，借助SPSS和 SIMCA-P 軟件進行計量學分析。

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度試驗 稱取同一艾葉樣品，參照“2.3.2”節(jié)中試驗方法，連續(xù)測定5次，計算其共有峰波數(shù)的相對標準差。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗 稱取同一艾葉樣品，參照“2.3.2”節(jié)中試驗方法，分別于0、2、4、8、24 h測定，計算其共有峰波數(shù)的相對標準差。

1.4.3 重復性試驗 稱取同一艾葉樣品，稱取5份平行樣，參照“1.3.2”節(jié)中的試驗方法，計算共有峰波數(shù)的相對標準差。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

穩(wěn)定性試驗表明，共有峰波數(shù)的相對標準差在 0.08%～2.95%之間，24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定;精密度試驗表明，共有峰波數(shù)的相對標準差均小于0.13%;重復性試驗表明，共有峰波數(shù)的相對標準差在0.11%～4.55%，說明該方法可靠、重復性好、穩(wěn)定性強，符合指紋圖譜的要求。

2.2 對照紅外指紋圖譜

本試驗以共有模式建立艾葉對照紅外指紋圖譜，選擇道地產(chǎn)區(qū)（蘄艾）并且經(jīng)傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒定品質(zhì)較好的10批次蘄艾樣品作為對照藥材，取其平均光譜為對照譜圖。每份蘄艾樣品選取不同位置隨機掃描3次，以吸收強度均值作為紅外對照圖譜的吸收強度，對照紅外圖譜見圖1。

2.3 對照紅外圖譜解析及表征

在得到的對照圖譜（圖1）中，3 411 cm-1附近頻率低，譜帶寬的吸收峰可能為N—H及O—H的伸縮振動峰;2 918 cm-1 附近的吸收峰可能為C—H伸縮振動峰;1 638 cm-1 處附近的吸收峰可能為CO或CC的伸縮振動峰;1 398 cm-1 處的吸收峰可能為C—O伸縮振動峰;1 262 cm-1 處的吸收峰可能為取代苯類C—H面內(nèi)彎曲振動峰;1 058 cm-1處可能為苷類，多糖類等碳水化合物的C—O彎曲振動;616 cm-1處可能為C—H的面外彎曲振動峰。

2.4 艾葉紅外指紋圖譜的相似度分析

本試驗采用共有特征峰及全譜相似度分析相結合的方法，這樣既能突出共有峰的特點，又能將全譜信息強度和位置差異體現(xiàn)出來，分析方法較為全面和準確，提高了樣品間的可比性和比較的精度。

2.4.1 艾葉紅外指紋圖譜共有特征峰的相似度分析 經(jīng)過對不同產(chǎn)地艾葉樣品進行比較，發(fā)現(xiàn)共有特征峰為616、1 058、1 262、1 398、1 638、2 918、3 411 cm-1，其編號分別為1、2、3、4、5、6。從不同產(chǎn)地艾葉樣品的共有特征峰與蘄艾對照紅外圖譜的相似度分析結果（表1）可以看出，不同產(chǎn)地艾葉樣品紅外圖譜的共有特征峰相關系數(shù)可分為2類。第1類為河南湯陰所產(chǎn)艾葉，該產(chǎn)區(qū)艾葉的相關系數(shù)在0.99以上，與道地產(chǎn)區(qū)蘄艾的相似度較高;第2類主要包括河北安國、山東煙臺、河南湯陰、浙江寧波，以上產(chǎn)區(qū)艾葉的相關系數(shù)在0-8～0.9之間。

2.4.2 艾葉FTIR指紋圖譜全波段的相似度分析 從不同產(chǎn)地艾葉樣品的全波段圖譜與蘄艾對照紅外圖譜的相似度分析結果（表1）可以看出，不同產(chǎn)地艾葉樣品紅外圖譜的全波段相關系數(shù)可分為2類。第1類為河南湯陰所產(chǎn)艾葉，該產(chǎn)區(qū)艾葉的相關系數(shù)在0.990以上，與道地產(chǎn)區(qū)蘄艾的相似度較高;第2類主要包括河北安國、山東煙臺、河南西峽、浙江寧波，以上產(chǎn)區(qū)艾葉的相關系數(shù)在0.950～0.990，仍具有較高的相似性。

2.5 艾葉紅外指紋圖譜主成分分析

選取波段 1 300～500 cm-1 作為不同產(chǎn)地艾葉的“指紋區(qū)”進行分析，并建立基于主成分分析的模型，表2為不同產(chǎn)地艾葉紅外圖譜的特征向量值及累計貢獻率。從表2可以看出，所提取的前5主成分累計貢獻率已經(jīng)高達99.99%，可以替代原始的FTIR圖譜。

從圖2可看出，不同產(chǎn)地艾葉紅外光譜在散點圖上的位置關系與其光譜的相似度相吻合，如河南湯陰艾葉與湖北蘄春艾葉相似度較高（相關系數(shù)在0.990以上），則在主成分散點圖上均分布于第二象限;河南西峽艾葉和浙江寧波艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度較低，則在散點圖上分布第四象限，與湖北蘄春艾葉距離較遠;同理，河北安國所產(chǎn)艾葉和山東煙臺所產(chǎn)艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度居中，則分別分布于第一象限和第三象限。

2.6 不同產(chǎn)地艾葉指紋圖譜聚類分析

艾葉紅外圖譜在距離系數(shù)為5時， 可將不同產(chǎn)地艾葉樣品劃分為3個表征群（圖3），其中山東煙臺和河南西峽的艾葉樣品、湖北蘄春和河南湯陰的艾葉樣品首先聚為一類，這與圖2的主成分散點圖分布象限相吻合; 河北安國和浙江寧波的艾葉樣品分別處于第二、第三表征群，說明親緣關系和相似度匹配相對較遠，這也與“2.4”節(jié)中部分分析結果吻合。

3 討論和結論

紅外光譜技術在中藥質(zhì)量控制和產(chǎn)地鑒別等研究領域應用較為廣泛和深入，該技術具有無損、快捷等顯著的優(yōu)點，且操作簡單快捷，檢測速度快，無需復雜預處理，較為適合實際生產(chǎn)。紅外光譜法僅需少量粉末樣品，收集4 000～400 cm-1光譜圖后進行數(shù)據(jù)分析和信息挖掘即可得出鑒定結果，尤其是將紅外圖譜與相關系數(shù)法、偏最小二乘法、主成分分析法等計量學方法相結合，可以挖掘藥材原始光譜中潛在的地理信息，在中藥材產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量監(jiān)控等方面起重要作用。

本試驗在筆者所在課題組前期研究的基礎上構建不同產(chǎn)地艾葉紅外指紋圖譜，通過適當?shù)挠嬃繉W方法（相關系數(shù)法、主成分分析法、聚類分析法等）挖掘艾葉產(chǎn)地間的差異。在主成分分析中，河南湯陰艾葉與湖北蘄春艾葉相似度較高，在第一、第二散點圖上均分布于第二象限;河南西峽艾葉和浙江寧波艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度較低，在第一、第二散點圖上均分布于距離較遠的第四象限;河北安國艾葉和山東煙臺艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春相似度居中，則分別分布于第一象限和第三象限;在聚類分析中，山東煙臺和河南西峽的艾葉樣品、湖北蘄春和河南湯陰的艾葉樣品首先聚為一類，河北安國和浙江寧波的艾葉樣品分別處于第二、第三表征群，這也與主成分分析的結果相吻合。本研究結果與孔德鑫等研究不同產(chǎn)地紫金牛藥材的主成分分析模型結果[12]和韋記青等研究不同產(chǎn)地戰(zhàn)骨的聚類分析結果[13]相似。筆者推測同種不同產(chǎn)地的中藥材受特定生態(tài)環(huán)境的影響，在長期生態(tài)適應過程中，中藥材生長所需的溫度、光照、土壤、水文等生態(tài)因素與其生長發(fā)育和品質(zhì)唇齒相關，并附帶了地域信息的指紋特征，中藥材品質(zhì)的優(yōu)劣取決于活性成分，而活性成分的合成和積累與其產(chǎn)地環(huán)境密切相關，這種關系可以體現(xiàn)在紅外光譜的差異上;同時，筆者還發(fā)現(xiàn)河南湯陰艾葉與道地產(chǎn)區(qū)湖北蘄春艾葉相關系數(shù)較高，說明該地區(qū)艾葉的品質(zhì)與道地產(chǎn)區(qū)相近;在主成分分析和聚類分析中，又將湖北蘄春和河南湯陰艾葉劃分為一類，試驗結果與上述分析相吻合，充分說明河南湯陰與湖北蘄春艾葉品質(zhì)相近，質(zhì)量較好，故筆者建議在艾葉資源需求量緊缺的情況下可將河南湯陰作為艾葉的另一優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)。

本研究首次采用FTIR技術對6個不同產(chǎn)地的艾葉樣品進行測定和分析，建立了艾葉產(chǎn)地間紅外指紋圖譜的共有模式，并進行了共有特征峰的解析表征;從紅外圖譜和共有特征峰2個方面進行相似度分析，試驗結果相互補充和印證;建立了艾葉紅外指紋圖譜的主成分和聚類分析方法，試驗結果與相似度分析結果相吻合。本試驗結果表明，不同產(chǎn)地艾葉紅外圖譜整體相似度較高，但也存在一定的差異，運用適當數(shù)據(jù)分析方法可將不同產(chǎn)地的艾葉正確分類，從而實現(xiàn)艾葉的產(chǎn)地鑒別，為艾葉的產(chǎn)地溯源和質(zhì)量控制提供新的理論依據(jù)和技術支持。

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