宋慕波 帥良 方方

摘要：利用RACE技術(shù)首次從荸薺中克隆得到PPO基因全長cDNA序列，并分析其在鮮切荸薺貯藏過程中的表達變化。克隆得到的荸薺PPO基因cDNA序列全長為2 006 bp，開放閱讀框長度為1 734 bp，編碼577個氨基酸，命名為CwPPO（登錄號：MG702489）。預測分析表明，CwPPO編碼蛋白質(zhì)的分子量為64.86 ku，分子式為C2891H4417N795O873S18，理論等電點為6.50，屬親水性蛋白。CwPPO蛋白可能定位于線粒體基質(zhì)空間，具有3個典型的保守結(jié)構(gòu)域和2個銅離子結(jié)合域。此外，預測發(fā)現(xiàn)CwPPO有20個絲氨酸磷酸化位點、7個蘇氨酸磷酸化位點及6個酪氨酸磷酸化位點，其二級結(jié)構(gòu)以不規(guī)則卷曲為主。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，CwPPO蛋白與菠蘿、油棕有較近的親緣關(guān)系。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，CwPPO在鮮切荸薺中的初始表達水平較低，但在貯藏后期表達量快速提高。

關(guān)鍵詞：鮮切荸薺;多酚氧化酶;基因克隆;表達分析

中圖分類號： TS255.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0046-04

荸薺（Eleocharis tuberosa）別稱馬蹄、地栗，屬莎草科多年生淺水草本植物，其球莖風味獨特并有較高的藥用價值[1]。隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展，鮮切果蔬產(chǎn)品越來越受到消費者的喜愛。荸薺洗凈和削皮不易，殘留果肉的表皮寄生病菌容易進入人體而引發(fā)疾病，加之一般荸薺加工產(chǎn)品難以保持荸薺口感爽脆、清甜可口的特點，因此，衛(wèi)生和方便的鮮切荸薺產(chǎn)品有較好的市場前景。然而，鮮切荸薺保鮮難度大、貨架期短，特別是色澤劣變問題嚴重影響了鮮切荸薺產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[2]。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，簡稱PPO）是植物體內(nèi)普遍存在的一種末端氧化酶，可催化酚類物質(zhì)氧化，形成黑色高聚物，其在果蔬褐變過程中起到的關(guān)鍵作用已經(jīng)在蘋果、梨和姜等果蔬的研究中得到證實[3-5]。一些研究表明，鮮切荸薺表面黃化可能與PPO活性相關(guān)，例如，殼聚糖、檸檬酸和水楊酸處理在抑制PPO活性上升的同時改善了鮮切荸薺的黃化[6-8]。然而，Pan等研究發(fā)現(xiàn)，導致荸薺黃化的物質(zhì)是柚皮素和圣草酚而不是PPO參與的氧化反應(yīng)產(chǎn)物[9]。因此，PPO在鮮切荸薺黃化過程中的作用仍不明確。

由于PPO是參與果蔬褐變的關(guān)鍵酶，其編碼基因已在菠蘿、甘薯、茶樹、香蕉等多種植物中克隆得到[10-12]。荸薺分子生物學方面的研究較少，關(guān)于荸薺PPO基因的克隆和相關(guān)分子生物學研究未見報道。鑒于此，本研究擬利用前期獲得的荸薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行荸薺果肉的PPO基因全長cDNA的克隆，研究鮮切荸薺貯藏過程中PPO基因的表達變化，可為多酚氧化酶的研究、鮮切荸薺黃化機制研究以及完善鮮切荸薺貯藏方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及處理

荸薺（Eleocharis tuberosa）于2016年12月10日購自廣西壯族自治區(qū)賀州市八步區(qū)農(nóng)產(chǎn)品市場。購買后運回實驗室清洗，挑選大小均一和無機械損傷、無病蟲害的荸薺，去皮后橫切成厚度為0.5 cm的圓片，然后用0.1%（w/V）次氯酸鈉溶液殺菌10 min，將樣品晾干后置于塑料托盤中用0.02 mm聚乙烯保鮮膜包裝，于10 ℃下貯藏。

1.2 試劑

植物RNA提取試劑盒，華越洋生物科技（北京）有限公司;SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE試劑盒、LA Taq DNA聚合酶、PMD-19T載體、感受態(tài)細胞DH5α、感受態(tài)細胞Stellar、DNA Marker、SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量酶、6×Loading buffer、PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄去基因組試劑盒，日本TaKaRa公司;溴化乙錠，生工生物工程（上海）股份有限公司;DNA凝膠回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司;瓊脂糖，西班牙Biowest公司;Tris、乙醇、EDTA-Na2均為分析純，國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 荸薺果肉總RNA提取 采用華越洋植物RNA提取試劑盒提取荸薺果肉總RNA，具體方法按照說明書進行。得到RNA后利用K5600超微量分光光度計測定其純度和含量，RNA樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于反轉(zhuǎn)錄等后續(xù)試驗。

1.3.2 荸薺果肉PPO基因克隆 3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA的合成具體操作按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE試劑盒進行。根據(jù)之前從荸薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到的PPO基因片段設(shè)計3′RACE和5′RACE引物（表1）。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預變性1.5 min;94 ℃變性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，25個循環(huán);72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接（pRACE vector）、轉(zhuǎn)化（Stellar感受態(tài)細胞）、重組子篩選及菌液PCR鑒定后，測序委托華大基因科技股份有限公司進行。應(yīng)用DNAMAN軟件和NCBI在線工具對荸薺PPO基因進行序列基本結(jié)構(gòu)和特征分析。

根據(jù)拼接得到的基因全長核苷酸序列設(shè)計引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進行PCR擴增，經(jīng)檢測和測序獲得全長序列。

1.3.3 荸薺PPO基因生物信息學分析 采用NCBI中的BLASTN、BLASTP程序進行核苷酸序列及其推導的氨基酸序列的同源性比較;ORF Finder程序?qū)ふ议_放閱讀框;采用ProtParam Tool分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì);采用Conserved Domains分析氨基酸序列的保守區(qū)域;采用Post Prediction和SubLocv 1.0進行蛋白亞細胞定位信號預測;ProtScale以Hphob./Kyte & Doolittle算法進行親疏水性預測;使用NetPhos 2.0 Server預測蛋白質(zhì)序列的磷酸化位點;使用ExPaSy-SOPMA軟件分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu);使用Clustal X2軟件進行多重序列比對;采用Mega 5軟件進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建;采用SWISS-MODEL預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu);采用Swiss-PdbViewer構(gòu)建蛋白模型的拉氏構(gòu)象圖。

1.3.4 ?荸薺PPO基因的表達分析 根據(jù)獲得的荸薺PPO基因cDNA序列利用Primer 5.0設(shè)計Q-PCR特異引物（表1）。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit去除基因組和反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成Q-PCR的模板cDNA，操作方法見說明書。參考TaKaRa公司的SYBR Green qPCR Master Mix說明書進行 Real-time PCR擴增。以18S rRNA（登錄號：MG742686）為內(nèi)參。利用2-ΔΔCt方法計算鮮切荸薺PPO基因在貯藏過程中的表達量。各樣品的表達量均為3次生物重復的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 荸薺果肉PPO基因cDNA全長序列克隆

荸薺轉(zhuǎn)錄組測序篩選得到與其他植物PPO基因同源性較高的基因片段，利用NCBI的BLAST程序進行比對，結(jié)果顯示，與其他植物的PPO基因核苷酸序列相似度為62%～73%，其中與菠蘿（Ananas comosus，XM_020246795.1）PPO基因核苷酸序列相似性最高，為73%。根據(jù)該序列設(shè)計3′RACE和5′RACE引物，進行PCR獲得3′和5′端序列分別約為1 700 bp和600 bp（圖1-A，圖1-B）。將片段回收后進行測序分析發(fā)現(xiàn)3′端序列長度為1 663 bp，包含了3′非翻譯區(qū)（3′UTR）及poly A結(jié)構(gòu);5′端序列長度為547 bp，包含了5′非翻譯區(qū)（5′UTR）。將3′和5′端序列拼接后得到基因全長序列，在拼接序列的5′端和3′端設(shè)計引物擴增PPO的cDNA全長序列（圖1-C），測序結(jié)果顯示，該序列與拼接結(jié)果一致。

將克隆得到的全長序列使用NCBI中ORF Finder軟件進行分析。該序列長度為2 006 bp，含有1個1 734 bp的最大開放閱讀框（ORF）、57 bp的5′UTR區(qū)、188 bp的3′UTR區(qū)及27 bp的polyA結(jié)構(gòu)，起始密碼子ATG位于第58～60位，終止密碼子為TGA（圖2）。將該cDNA序列在NCBI上進行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與油棕（Elaeis guineensis;XM_010912626.2，XM_010928464.2）、海棗（Phoenix dactylifera;XM_008779971.1）和菠蘿（Ananas comosus;XM_020246795.1）的PPO基因相似度較高，均大于68%。因此，可證明已經(jīng)克隆獲得荸薺PPO基因，將此基因命名為CwPPO，并在GenBank上登錄，登錄號為MG702489。

2.2 CwPPO基因生物信息學分析

經(jīng)預測分析，CwPPO編碼蛋白質(zhì)的分子量為64.86 ku;分子式為C2891H4417N795O873S18;理論等電點為6.50;利用ProtScale軟件預測其屬于親水性蛋白，親水指數(shù)（GRAVY）為-0.572。

CwPPO蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白，可能存在由內(nèi)到外或由外到內(nèi)的雙向跨膜的2個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。采用NCBI的Conserved domains數(shù)據(jù)庫預測CwPPO的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)了3個典型的保守結(jié)構(gòu)域，分別為未知功能的保守結(jié)構(gòu)域（446～575，PPO1_KFDV，pfam12143）及酪氨酸普通中心區(qū)域（162～372，Tyrosinase，pfam00264）、多酚氧化酶中間保守域（379～429，PPO1_DWL，pfam12142）（圖3）。使用SignalP 3.0和Post Prediction預測顯示CwPPO為非分泌蛋白，定位于線粒體基質(zhì)空間的可能性最大。

蛋白質(zhì)的磷酸化是最普遍和重要的蛋白翻譯后修飾方式。經(jīng)磷酸化預測發(fā)現(xiàn)，CwPPO編碼的蛋白可在20個Ser、7個Thr和6個Tyr氨基酸位點進行磷酸化修飾。在這33個磷酸化位點分值最高的是S467，為0.997。磷酸化位點能夠影響CwPPO蛋白的分子構(gòu)象和活性，其位點預測能夠為今后基因表達調(diào)控，蛋白修飾提供參考。

采用SOPMA軟件預測CwPPO蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白最主要的結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲占64.52%，其次α-螺旋占19.83%， 延伸鏈占15.65%。α-螺旋和延伸鏈

分散于整個蛋白質(zhì)中，且N-末端多以無規(guī)則卷曲形式存在，C-末端主要為延伸鏈形式。

利用Swiss-model預測CwPPO蛋白的三級結(jié)構(gòu)，由軟件自動匹配模板（PDB No. 4z11.1）進行參照建模，CwPPO蛋白三維結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲呈均勻分布，中間有2個銅離子結(jié)合域，位于172～202和324～359處（圖4）。采用Swiss-Pdb Viewer軟件分析上述同源建模結(jié)果，通過拉氏構(gòu)象可以看出蛋白質(zhì)殘基的二面角（ψ和φ）位于核心區(qū)域，表明其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，故上述利用同源建模的方法對CwPPO蛋白進行建模的結(jié)果較為可靠（圖5）。

2.3 CwPPO蛋白序列多重比對和進化樹構(gòu)建

通過與其他植物PPO蛋白比對發(fā)現(xiàn)，不同PPO功能區(qū)域的氨基酸序列較為保守，而C-端、N-端區(qū)域的差異較大，尤其C-端的差異最大。為了解CwPPO蛋白與其他植物PPO蛋白的進化關(guān)系，對CwPPO蛋白進行多序列比對并建立系統(tǒng)進化樹（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CwPPO與油棕（Elaeis guineensis）、菠蘿（Ananas comosus）的PPO蛋白親緣關(guān)系較近。

2.4 CwPPO在鮮切荸薺貯藏過程中的表達分析

通過熒光定量PCR分析鮮切荸薺貯藏過程中CwPPO的表達變化。結(jié)果表明，荸薺果肉中CwPPO的初始表達水平較低，切分后隨著貯藏時間的延長，CwPPO表達水平逐漸升高，與鮮切荸薺的顏色變化表現(xiàn)出一定的相關(guān)性（圖7）。

3 討論與結(jié)論

多酚氧化酶（PPO）能夠氧化植物中的酚類物質(zhì)形成黑色高聚物，是導致鮮切果蔬褐變的關(guān)鍵酶[13]。其編碼基因PPO在多種植物中屬于多基因家族，如番茄、馬鈴薯中都發(fā)現(xiàn)了多個不同的編碼基因[14-15]。但并非所有植物的PPO都屬于多基因家族，例如葡萄藤中僅發(fā)現(xiàn)了1個PPO基因[16]。筆者前期在荸薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中只發(fā)現(xiàn)了1個與其他植物PPO同源性較高的基因片段。本試驗克隆得到的荸薺果肉PPO基因序列長度為2 006 bp，編碼577個氨基酸，命名為CwPPO。CwPPO蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測顯示其含有3個典型的保守結(jié)構(gòu)域，這與以往報道的PPO蛋白的保守結(jié)構(gòu)域[17]吻合。植物多酚氧化酶基因序列的2個銅離子結(jié)合域的同源性都很高，這是多酚氧化酶的主要功能區(qū)[18]。通過對蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)CwPPO基因包含2個含銅的高度保守區(qū)（CuA、CuB），在同源構(gòu)建CwPPO蛋白的三維模型中也可以看到2個銅離子結(jié)合域，分別是位于172～202和324～359處，這些功能域是植物PPO的主要功能區(qū)。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，CwPPO編碼的氨基酸與油棕（Elaeis guineensis）、菠蘿（Ananas comosus）有較近的親緣關(guān)系。

鮮切荸薺10 ℃下貯藏前2 d基本沒有顏色變化，之后荸薺表面組織才均勻黃化，與傳統(tǒng)酶促褐變相比有明顯的“啟動”期。同時，貯藏期間荸薺PPO活性也較低，表明荸薺果肉中可能預先并不存在大量的PPO，而且鮮切荸薺貯藏過程中PPO的底物含量也較低[19-20]。因此，研究者推測荸薺的黃化與PPO參與的酶促褐變不同。本研究發(fā)現(xiàn)鮮切荸薺貯藏過程中CwPPO的表達水平逐漸升高，與荸薺黃化進程表現(xiàn)出了一定的相關(guān)性。切割傷害可以誘導植物PPO表達，增加酶的合成量，從而導致鮮切果蔬和外植體的褐變[21]。隨著貯藏時間的延長，荸薺完全黃化后還會出現(xiàn)明顯的褐變。因此，PPO可能沒有參與荸薺貯藏前期的黃化過程，但貯藏后期逐漸積累的PPO是否參與了鮮切荸薺黃化后的褐變有待進一步研究。

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