曹培杰 馬艷弘 崔晉

摘要：以桑葚為原料，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)考察纖維素酶用量、果膠酶用量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)桑葚出汁率的影響，對(duì)桑葚濃縮汁的加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，探究酶添加量對(duì)桑葚汁中活性成分的影響并分析其抗氧化性能。結(jié)果表明，添加1.0%果膠酶、2.6%纖維素酶，50 ℃條件下酶解40 min，得到桑葚的出汁率最高，為81.1%。當(dāng)果膠酶添加量為1.0%時(shí)，濃縮汁中花青素和維生素C含量最高，分別為95.184 g/L和1 099.412 mg/L;當(dāng)纖維素酶添加量為2-5%時(shí)，濃縮汁中花青素和維生素C含量分別為85.999 g/L和957.416 mg/L。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溫度為65 ℃，其抗氧化能力較強(qiáng)，抗超氧陰離子自由基能力和DPPH自由基清除能力分別為31 194.21 U/L和98.99%。

關(guān)鍵詞：桑葚濃縮汁;出汁率;工藝優(yōu)化;抗氧化;響應(yīng)面設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)： TS275.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0204-06

桑葚，多年生木本植物桑樹的果實(shí)，是一種營養(yǎng)成分十分豐富的水果，含有人體所需的多種營養(yǎng)成分，如礦物元素、維生素及氨基酸等，并且含有黃酮類物質(zhì)、花色苷類化合物、白藜蘆醇、花青素等多種活性成分[1-2]，因而和沙棘、懸鉤子等一起被譽(yù)為“第三代水果”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，桑葚可以提升人體免疫力、降低血糖血脂、延緩肌體衰老、改善皮膚血液供應(yīng)等[3-5]。目前，桑葚除了鮮食以外，還可以加工成桑葚果醬、果汁飲料、桑葚果酒、桑葚果醋等。由于桑葚水分含量高達(dá)80%，因此不易貯存和運(yùn)輸，將其加工成果汁可以更有效地利用桑葚資源，提高其商業(yè)價(jià)值。

桑葚濃縮汁[6-7]是由原果汁脫除部分水分而得到的，將果汁濃縮可以減少體積、降低水分活度從而延長(zhǎng)產(chǎn)品貯存期和貨架期，而且濃縮更加有利于富集營養(yǎng)物質(zhì)，方便其他以濃縮汁為原料的食品加工工藝的開展[8-9]。目前桑葚濃縮的方法主要有真空濃縮、冷凍濃縮、膜分離濃縮等[10]。本研究以桑葚為原料，出汁率為指標(biāo)，優(yōu)化桑葚汁的提取工藝，并測(cè)定其中的活性成分，探究真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溫度對(duì)其抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

桑葚;纖維素酶、果膠酶、氯化鉀、乙酸鈉、抗壞血酸（維生素C），江蘇南京建安實(shí)業(yè)有限公司;羥自由基測(cè)定測(cè)試盒、抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒、DPPH試劑，上海源葉生物科技有限公司。

多功能榨汁機(jī)，美的集團(tuán)股份有限公司;微孔板分光光度計(jì)，美國伯騰儀器有限公司;TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;AL104型精密分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇常州國華電器有限公司;RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司;WYT-4手持糖度計(jì)，福建泉州中友光學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濃縮桑葚汁制備工藝流程 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的終點(diǎn)判定[11]：采用WYT-4手持糖度計(jì)測(cè)試在不同溫度下濃縮的桑葚濃縮汁白利度，待濃縮汁的白利度達(dá)到60°Brix，即為濃縮終點(diǎn)。桑葚濃縮汁制備工藝流程見圖1。

1.2.2 原料預(yù)處理 挑選無腐爛、表面無損傷和雜質(zhì)的桑葚凍果，解凍后，清洗干凈，放入榨汁機(jī)中榨汁，制備桑葚原漿。桑葚汁的出汁率按照以下公式計(jì)算：

出汁率=離心后汁液質(zhì)量/（原漿質(zhì)量+酶質(zhì)量）×100%。

1.2.3 桑葚汁提取單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)

1.2.3.1 果膠酶酶解單因素試驗(yàn) 初步選定果膠酶添加量為0.8%，酶解時(shí)間為60 min，酶解溫度為50 ℃，以桑葚果汁的原果漿pH值3.8為基礎(chǔ)條件，依次考察果膠酶添加量（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、果膠酶酶解時(shí)間（0、20、40、60、80、100、120 min）、果膠酶酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60 ℃）對(duì)桑葚出汁率的影響。

1.2.3.2 纖維素酶酶解單因素試驗(yàn) 選定纖維素酶添加量為2.2%，酶解時(shí)間為60 min，酶解溫度為50 ℃，以桑葚果汁的原果漿pH值3.8為基礎(chǔ)條件，依次考察纖維素酶添加量（0、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%、2.6%、3.0%）、纖維素酶酶解時(shí)間（0、20、40、60、80、100、120 min）、纖維素酶酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃、55、60 ℃）對(duì)桑葚出汁率的影響。

1.2.3.3 復(fù)合酶解響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12-13]，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)方差分析結(jié)果，對(duì)影響桑葚出汁率的各個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。選取纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間這4個(gè)影響因素，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化復(fù)合酶解工藝，試驗(yàn)因素與水平編碼見表1。

1.2.4 酶添加量對(duì)桑葚汁品質(zhì)的影響

1.2.4.1 對(duì)花青素含量的影響 采用pH示差法進(jìn)行測(cè)定[14-17]：吸取不同酶處理后的桑葚汁， 稀釋50倍。各取1 mL稀釋后的桑葚汁加入到10 mL容量瓶中，然后分別用pH值為1.0和pH值為4.5的緩沖溶液進(jìn)行定容，在冰箱中避光靜置2 h，分別在520 nm和700 nm下測(cè)吸光度。

花青素含量的計(jì)算公式：

M（mg/L）=D×Mr×DF×1 000ε×1。

式中：M為花青素含量;D為pH值為1.0時(shí)520 nm與 700 nm 處的吸光度值差-pH值為4.5時(shí)520 nm與700 nm處的吸光度值差;DF為稀釋倍數(shù);Mr為矢車菌素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2 g/mol;ε為矢車菌素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900。

1.2.4.2 對(duì)維生素C的影響 按照抗壞血酸（維生素C）測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 濃縮溫度對(duì)抗氧化活性的影響 采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的方法，研究不同濃縮溫度對(duì)桑葚濃縮汁抗氧化性的影響差異[18]及品質(zhì)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 果膠酶添加量對(duì)出汁率的影響 由圖2可知，出汁率隨果膠酶添加量的增加而增大，當(dāng)果膠酶添加量超過1.0%后，桑葚的出汁率增加趨勢(shì)較為平緩，桑葚汁的出汁率維持在74.5%左右。這是由于底物添加量越大，果膠酶與底物反應(yīng)越完全，桑葚的出汁率越高。隨著果膠酶添加量的增大，果膠酶與底物反應(yīng)處于飽和狀態(tài)，過多酶分子無法與底物接觸，導(dǎo)致出汁率增加不明顯，過多地添加果膠酶，只能造成對(duì)果膠酶的浪費(fèi)，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，以及酶添加過多不利于桑葚汁的后續(xù)加工，故選擇果膠酶的添加量為0.8%～1.2%。

2.1.2 果膠酶酶解時(shí)間對(duì)出汁率的影響 由圖3可知，桑葚的出汁率在0～80 min內(nèi)漲幅較快，當(dāng)酶解時(shí)間超過80 min后，出汁率增加緩慢并趨于平緩。這是由于果膠酶可以水解植物細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)含物的釋放，從而使得出汁率不斷增大。當(dāng)一定量的果膠酶與桑葚漿反應(yīng)完全后，反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)對(duì)桑葚漿的水解不再起作用，從而使得出汁率增長(zhǎng)緩慢。因此，選擇酶解時(shí)間為80 min。

2.1.3 果膠酶酶解溫度對(duì)桑葚出汁率的影響 由圖4可知，果膠酶酶解溫度在30～55 ℃范圍內(nèi)時(shí)，桑葚的出汁率隨酶解溫度的升高而增大，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，桑葚的出汁率達(dá)到最大值（76.9%），隨后再增加溫度，桑葚的出汁率降低。這是由于果膠酶在一定溫度下才能發(fā)揮其活性，溫度過低其酶活性受到抑制，不利于酶與底物的接觸，從而導(dǎo)致桑葚的出汁率較低，溫度過高，果膠酶容易變性失活，反而不利于出汁率的提高。因此，在桑葚酶解的過程中，選擇55 ℃作為果膠酶酶解的最適溫度。

2.1.4 纖維素酶添加量對(duì)出汁率的影響 如圖5所示，隨著纖維素酶添加量的增加，桑葚出汁率逐漸增大，當(dāng)纖維素酶添加量達(dá)到2.5%時(shí)，繼續(xù)增加纖維素酶的用量，出汁率增加不明顯，這是由于植物細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素和果膠等組成，在用纖維素酶處理桑葚漿的過程中，適量的纖維素酶可以使得桑葚漿水解加快，從而提高出汁率，但是過量的纖維素酶不能與足夠的底物相互反應(yīng)，從而使得桑葚漿的出汁率增加不明顯，因此選擇纖維素酶的添加量為2.0%～2.5%。

2.1.5 纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)出汁率的影響 由圖6可知，桑葚的出汁率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但是在酶解時(shí)間超過100 min后，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，桑葚的出汁率增加緩慢。這是由于在適宜的溫度下，一定的反應(yīng)時(shí)間會(huì)促進(jìn)纖維素酶和底物的反應(yīng)達(dá)到完全。當(dāng)酶解完全時(shí)，再增加反應(yīng)時(shí)間，對(duì)提高桑葚的出汁率并無太大影響。因此，選擇纖維素酶酶解的適宜時(shí)間為100 min。

2.1.6 纖維素酶酶解溫度對(duì)桑葚出汁率的影響 由圖7可知，隨著纖維素酶酶解溫度的升高，桑葚的出汁率在不斷增大，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，桑葚的出汁率達(dá)到最大，為73.3%。隨后再增加溫度，桑葚的出汁率下降。這是由于溫度過高或者過低都會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響，溫度過低，酶的活性會(huì)受到抑制，不能與底物充分結(jié)合;溫度過高，會(huì)使酶失活，這2種情況都會(huì)導(dǎo)致桑葚的出汁率降低。因此，酶解溫度應(yīng)保持在適宜的條件下，選擇50 ℃作為桑葚酶解的最適溫度。

2.2 復(fù)合酶解響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以桑葚出汁率為響應(yīng)值，優(yōu)化桑葚出汁率的工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

2.2.1 響應(yīng)面分析 圖8至圖10反映了不同因素間交互作用對(duì)桑葚汁出汁率的影響。響應(yīng)曲面圖中的曲面的陡峭程度可以表明變量對(duì)桑葚出汁率的影響程度，曲面較陡峭表明影響較大，反之則較小;等高線圖反映了因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用明顯，圓形表示交互作用不明顯[19-21]。由圖8至圖10可知，纖維素酶添加量與果膠酶添加量、纖維素酶添加量與酶解時(shí)間等高線均呈現(xiàn)橢圓、扁平狀，由此可知上述因素之間的相互作用， 明顯;而果膠酶添加量與酶解時(shí)間的等高線呈圓形，說明兩者的交互作用不明顯。

2.2.2 最優(yōu)工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)過分析得到桑葚汁最佳提取工藝為纖維素酶用量2.57%、果膠酶用量1.06%、酶解時(shí)間42.19 min、酶解溫度49.56 ℃，為了操作方便，修正最佳的提取條件為纖維素酶用量2.6%、果膠酶用量1.0%、酶解時(shí)間40 min、酶解溫度50 ℃，在此條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得桑葚出汁率平均值為81.1%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差僅為0.707%，說明該優(yōu)化設(shè)計(jì)方案可較好地預(yù)測(cè)桑葚汁的提取情況。

2.3 不同酶對(duì)桑葚汁品質(zhì)的影響

2.3.1 纖維素酶添加量對(duì)花青素和維生素C含量的影響 如表3所示，當(dāng)酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為40 min，隨著纖維素酶添加量的增加，桑葚汁中花青素和維生素C的含量先逐漸增大，當(dāng)纖維素酶添加量為2.5%，花青素和維生素C含量均達(dá)到最大值，分別為85.999 g/L和 957.416 mg/L，之后開始下降，因?yàn)檩^高濃度的纖維素酶會(huì)破壞花青素的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成花青素含量的下降，因此，當(dāng)纖維素酶添加量為2-5%時(shí)，花青素的提取效果較好。

2.3.2 果膠酶添加量對(duì)花青素和維生素C含量的影響 由表4可知，當(dāng)酶解溫度為 50 ℃，酶解時(shí)間為40 min，隨著果膠酶添加量的增大，桑葚汁中花青素和維生素C先增加后減少，當(dāng)果膠酶含量達(dá)到1.0%時(shí)，花青素含量為95.184 g/L，維生素C含量為1 099.412 mg/L，再增加酶的用量，花青素和維生素C含量均下降，因此再提高果膠酶的量對(duì)維生素C含量的提升不會(huì)有太大幫助。所以，當(dāng)果膠酶添加量為 1.0% 時(shí)，維生素C含量較高。

2.4 桑葚濃縮汁的抗氧化活性分析

2.4.1 羥自由基抑制能力 由圖11可知，隨著桑葚濃縮汁溫度的升高，桑葚濃縮汁的羥自由基抑制能力先增加后減小，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，其羥自由基的抑制能力達(dá)到最高值，之后再升高溫度，羥自由基抑制能力減弱。這可能是由于溫度較低時(shí)溫度升高使得酶活性增大，桑葚汁中的活性成分溶出較多，所以抑制羥自由基的能力逐漸增強(qiáng);溫度過高會(huì)使得酶活性降低或喪失，致使桑葚汁中活性成分較少，抑制羥自由基的能力也減弱。

2.4.2 抗超氧陰離子自由基能力 由圖12可知，隨著溫度的升高，桑葚濃縮汁的抗超氧陰離子自由基抑制能力逐漸提高，當(dāng)溫度在65 ℃作用時(shí)，其抗超氧陰離子自由基的抑制能力達(dá)到最高值，為31 194.21 U/L，之后再提高溫度，桑葚汁的抗超氧陰離子自由基的能力開始下降，這是因?yàn)檫^高的溫度使得桑葚汁中的活性成分含量降低，使得抗超氧陰離子的能力也降低。

2.4.3 DPPH自由基清除能力 由圖13可以看出，溫度對(duì)桑葚濃縮汁清除DPPH自由基的影響不是很大，溫度為35 ℃時(shí)，DPPH自由基的清除率為88.69%，當(dāng)溫度升高至65 ℃時(shí)，桑葚濃縮汁的DPPH自由基清除率為98.99%，隨后，再升高溫度，桑葚濃縮汁的DPPH自由基清除率有所下降。

2.5 桑葚濃縮汁的感官評(píng)定

依此配方制得的桑葚濃縮汁飲料產(chǎn)品色澤呈紫紅色，均勻一致;形態(tài)呈均勻流體，質(zhì)地均勻，無顆粒，無結(jié)塊，流動(dòng)性好;滋味酸甜可口，沒有不良異味，沖調(diào)性好，溶解快，靜置 10 min 后無明顯分層和沉淀物，感官品質(zhì)良好，而且營養(yǎng)平衡，能量較低，具有減肥、排毒、預(yù)防疾病、增強(qiáng)免疫能力等多重保健功效。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要研究了真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮桑葚汁的提取工藝，分別從酶解和抗氧化2個(gè)方面入手進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定各因素的變化范圍以及最佳條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化桑葚出汁率的最佳提取工藝條件為纖維素酶添加量2.6%、果膠酶添加量1.0%、酶解時(shí)間40 min、酶解溫度50 ℃，在此條件下，桑葚的出汁率為81.1%，提取率符合理論預(yù)測(cè)值。同時(shí)還對(duì)桑葚汁的維生素C含量以及花青素含量進(jìn)行測(cè)量，當(dāng)纖維素酶用量為2.6%、果膠酶用量為1.0%時(shí)，維生素C含量和花青素含量都較高。

溫度是影響濃縮果汁口感和營養(yǎng)物質(zhì)的重要因素，溫度對(duì)桑葚濃縮汁抗氧化活性的影響結(jié)果表明，溫度為65 ℃時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率最高可達(dá)98.99%;抗超氧陰離子自由基能力達(dá)31 194.21 U/L，對(duì)羥基自由基的抑制能力達(dá)到726.474 U/L。所以在65 ℃條件下，對(duì)桑葚汁進(jìn)行濃縮，能夠得到品質(zhì)優(yōu)異的桑葚濃縮汁，產(chǎn)品色澤、口感和營養(yǎng)能夠較好的保存。

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