彭小兵 杜吉革 彭國(guó)瑞

摘要：為確定含腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素重組蛋白的生產(chǎn)效率并評(píng)價(jià)其作為抗原的免疫效果，用生物反應(yīng)器對(duì)重組大腸桿菌DE3-pET-AE進(jìn)行高密度發(fā)酵，并將其制苗后以不同抗原劑量分別接種家兔和綿羊，間隔21 d進(jìn)行二免，分別測(cè)定一免、二免動(dòng)物混合血清的中和效價(jià)。發(fā)酵結(jié)果顯示，培養(yǎng)物菌體密度D600 nm達(dá)20.3，相對(duì)表達(dá)量為27.6%，D600 nm與相對(duì)表達(dá)量的乘積為搖瓶培養(yǎng)的6.5倍，菌體濕質(zhì)量為37.2 g/L;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，目的蛋白以可溶形式表達(dá)。動(dòng)物免疫效果評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，在家兔和綿羊上，抗原含量與免疫效果在一定的范圍內(nèi)均呈正相關(guān)，當(dāng)接種量為300 μg/只時(shí)，免疫效果均最好;對(duì)腐敗梭菌毒素與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的血清中和效價(jià)，在家兔上一免、二免分別達(dá)4與30、15與200，在綿羊上一免、二免分別達(dá)2與30、12與250。結(jié)果表明，DE3-pET-AE菌高密度發(fā)酵可獲得高產(chǎn)量蛋白抗原，且抗原的免疫效果明顯優(yōu)于《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：腐敗梭菌α毒素;產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素;大腸桿菌高密度發(fā)酵;免疫效果;抗原含量;家兔;綿羊

中圖分類號(hào)：S852.4+3 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0186-03

羊快疫和腸毒血癥是分別由腐敗梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起綿羊和山羊發(fā)生急性死亡的2種重要梭菌性疾病[1]，因發(fā)病急導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)治療，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大損失，故免疫接種是預(yù)防該病的最有效途徑。然而，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有用于預(yù)防該病的疫苗（如羊快疫、黑疫二聯(lián)滅活疫苗與羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗及羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗等）的檢驗(yàn)合格率并不高[2]。因此，一方面通過(guò)研制產(chǎn)毒培養(yǎng)基配方、改善發(fā)酵工藝進(jìn)而提高抗原含量是提高傳統(tǒng)疫苗免疫效果的有效途徑之一;另一方面，通過(guò)基因工程方法研制亞單位疫苗也成為解決現(xiàn)有疫苗質(zhì)量不高的另一重要候選途徑。腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素分別是腐敗梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌最主要的致死性毒力因子和保護(hù)性抗原，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分別獲得這2種重組毒素蛋白，經(jīng)制苗后免疫動(dòng)物均可產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)[3-5]。

鑒于此，本試驗(yàn)對(duì)已構(gòu)建的同時(shí)含有腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因的重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，以檢測(cè)重組蛋白的生產(chǎn)效率。隨后，將發(fā)酵產(chǎn)物制苗后免疫接種家兔和綿羊并檢測(cè)血清中和效價(jià)，以評(píng)價(jià)發(fā)酵抗原的免疫效果，進(jìn)而為研發(fā)亞單位疫苗積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 含腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因的重組大腸桿菌DE3-pET-AE，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 綿羊，5～6月齡，品種為小尾寒羊，購(gòu)自河北保定滿城區(qū)誠(chéng)信養(yǎng)殖場(chǎng)。CD-1（ICR）小鼠，16～20 g，SPF（無(wú)特定病原）級(jí);日本大耳白家兔，1.5～2.0 kg，清潔級(jí)。小鼠和家兔均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 主要儀器有恒溫?fù)u床（培英，THZ-D型）、電子天平（METTLER TOLEDO，PB203-N型）、紫外分光光度計(jì)（SPECTRA max，384 plus）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（KUBOTA，3500型）、生物反應(yīng)器（Applicon，ez-control & 7 L Autoclavable Bioreactor）等。

1.1.4 主要試劑 腐敗梭菌菌株C55-1株（CVCC60021）外毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-3株（CVCC82）外毒素，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備并保存。α-乳糖，SIGMA公司;酪蛋白胨、酵母浸出物，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽、甘油，北京化學(xué)試劑公司;生理鹽水、明膠緩沖液、葡萄糖溶液等參照《中國(guó)獸用生物制品規(guī)程》[6]配制。

1.2 方法

1.2.1 重組菌的復(fù)蘇 將重組菌DE3-pET-AE劃線接種于LB平板上[添加氨芐青霉素（簡(jiǎn)稱Amp+）]，37 ℃培養(yǎng) 12 h。

1.2.2 搖瓶振蕩培養(yǎng) 挑取重組菌單菌落，接種于2 mL MDG[7]（Amp+）非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)10 h;將全部培養(yǎng)物接種于100 mL ZYM-5052[7]（Amp+）自誘導(dǎo)培養(yǎng)中，30 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)24 h。收獲培養(yǎng)物，測(cè)定D600 nm，并進(jìn)行蛋白電泳，用Quantity One軟件分析靶蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 生物反應(yīng)器高密度發(fā)酵 挑取重組菌單菌落，接種于 4 mL MDG（Amp+）非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)16 h;將全部培養(yǎng)物接種于200 mL MDG（Amp+）非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃、260 r/min振搖培養(yǎng)10 h。將培養(yǎng)物接種于含4 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Amp+）的生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為4%，發(fā)酵溫度為30 ℃，通氣量為10 L/min，攪拌速度為500 r/min，控制pH值為7.0（補(bǔ)堿管接5 mol/L NaOH，補(bǔ)酸管接補(bǔ)料培養(yǎng)基），共培養(yǎng)24 h。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，C源組分用葡萄糖替換5052（即甘油、葡萄糖和乳糖的混合液），其他組分與ZYM-5052相同。補(bǔ)料培養(yǎng)基包括 10.0%酪蛋白胨、5.0%酵母浸出物、33.3%甘油、13.3%乳糖、0.8% MgSO4·7H2O。培養(yǎng)結(jié)束后收獲培養(yǎng)物，測(cè)定D600 nm。對(duì)發(fā)酵后菌液進(jìn)行10倍稀釋，再經(jīng)超聲波裂解處理后對(duì)全菌、菌體破碎上清和包涵體進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，用Quantity One軟件分析靶蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 制苗 取生物反應(yīng)器培養(yǎng)物，按總體積的0.4%加入甲醛溶液（含40%甲醛），37 ℃滅活48 h。經(jīng)滅活脫毒檢驗(yàn)合格后，以抗原、鋁膠比例為4 ∶ 1來(lái)制備疫苗，使靶蛋白的終濃度為300 μg/mL。

1.2.5 疫苗在家兔上的免疫效果研究 免疫前在每只家兔耳中動(dòng)脈采血5 mL，分離血清，按《中華人民共和國(guó)獸藥典》[8]的方法測(cè)定血清對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)。血清效價(jià)是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD（最小致死量）數(shù)”。將疫苗用20%鋁膠鹽水（含200 g氫氧化鋁膠和800 mL0.85%NaCl）稀釋后，分別以300、150、75、37.5 μg的劑量皮下注射家兔各5只，免疫后21 d進(jìn)行第2次免疫（免疫劑量及接種方式同首免），首免后21、35 d對(duì)每只家兔進(jìn)行耳中動(dòng)脈采血5 mL，分離血清，測(cè)定每組5只家兔混合血清分別對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)。

1.2.6 疫苗在綿羊上的免疫效果研究 免疫前在每只綿羊頸靜脈采血5 mL，分離血清，按《中華人民共和國(guó)獸藥典》[8]的方法測(cè)定血清對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)。將疫苗用20%鋁膠鹽水稀釋后，分別以300、150、75、37.5 μg的劑量皮下注射綿羊各5只，免疫后21 d進(jìn)行第2次免疫（免疫劑量及接種方式同首免），首免后21、35 d 對(duì)每只綿羊進(jìn)行頸靜脈采血5 mL，分離血清，測(cè)定每組5只綿羊混合血清分別對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶振蕩培養(yǎng)結(jié)果

采用搖瓶振蕩培養(yǎng)重組大腸桿菌DE3-pET-AE，30 ℃、260 r/min培養(yǎng)24 h，結(jié)果菌體密度D600 nm為4.81，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后用軟件測(cè)算得到目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為17.9%，C值（C=D600 nm×相對(duì)表達(dá)量）為0.86。

2.2 高密度發(fā)酵結(jié)果

采用生物反應(yīng)器高密度發(fā)酵重組大腸桿菌DE3-pET-AE，30 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果菌體密度D600 nm達(dá)20.3，相對(duì)表達(dá)量為27.6%，C值為5.60，菌體濕質(zhì)量為37.2 g/L。SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)目的蛋白以可溶形式表達(dá)。

2.3 疫苗在家兔上的免疫效果

對(duì)免疫前家兔血清進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)均小于1，均為抗體陰性兔。將不同抗原劑量的疫苗分別免疫家兔后，測(cè)定每組5只家兔混合血清對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)。由表1可知，在一定范圍內(nèi)抗原劑量與免疫效果呈正相關(guān);一免、二免血清中和效價(jià)均達(dá)到或顯著高于《中華人民共和國(guó)獸藥典》相關(guān)產(chǎn)品合格的標(biāo)準(zhǔn)（即血清中和效價(jià)對(duì)腐敗梭菌毒素應(yīng)達(dá)到1 MLOs/0.1 mL，對(duì)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素應(yīng)達(dá)到3 MLOs/0.1 mL）[8]。對(duì)于腐敗梭菌毒素組分，一免血清效價(jià)為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的 1～4倍，二免血清效價(jià)大幅提高為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的3～15倍，增至一免效價(jià)的2～5倍。對(duì)于D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素組分，一免血清效價(jià)為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的10倍，二免血清效價(jià)大幅提高為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的17～67倍，增至一免效價(jià)的 1.7～6.7倍。提示免疫劑量為300 μg/只時(shí)，家兔免疫效果最好，一免血清效價(jià)對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分別可達(dá)到《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的4、10倍，而二免效價(jià)則分別可達(dá)到《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的15、67倍。

2.4 疫苗在綿羊上的免疫效果

對(duì)免疫前綿羊血清進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)均小于1，均為抗體陰性綿羊。將不同抗原劑量的疫苗分別免疫綿羊后，測(cè)定每組5只綿羊混合血清分別對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)。由表2可知，在一定范圍內(nèi)抗原劑量與免疫效果呈正相關(guān);一免、二免血清中和效價(jià)均達(dá)到或顯著高于《中華人民共和國(guó)獸藥典》相關(guān)產(chǎn)品合格的標(biāo)準(zhǔn)（即血清中和效價(jià)對(duì)腐敗梭菌毒素應(yīng)達(dá)到1 MLDs/0.1 mL，對(duì)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素應(yīng)達(dá)到3 MLDs/0.1 mL）[8]。對(duì)于腐敗梭菌毒素組分，一免血清效價(jià)為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的 1～4倍，二免血清效價(jià)大幅提高為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的2～12倍，增至一免效價(jià)的2～6倍。對(duì)于D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素組分，一免血清效價(jià)為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的1.7～10.0倍，二免血清效價(jià)大幅提高為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的16.7～83.3倍，增至一免效價(jià)的5～10倍。提示免疫劑量為300 μg/只時(shí)，綿羊免疫效果最好，一免血清效價(jià)對(duì)腐敗梭菌毒素和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分別可達(dá)到《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的2、6倍，而二免效價(jià)則分別可達(dá)到《中華人民共和國(guó)獸藥典》標(biāo)準(zhǔn)的12、83.3倍。

3 討論

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的原理在于碳源，即大腸桿菌優(yōu)先使用葡萄糖生長(zhǎng)至飽和，當(dāng)葡萄糖被消耗殆盡時(shí)開始使用乳糖（既作為碳源，又作為誘導(dǎo)劑），進(jìn)而表達(dá)目的蛋白[7]。自誘導(dǎo)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于重組菌可生長(zhǎng)至較高密度，無(wú)需人為添加誘導(dǎo)劑，并且用乳糖替代異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）具有無(wú)毒且價(jià)廉的特點(diǎn)。本研究用自誘導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，菌體密度D600 nm達(dá)到4.81時(shí)，遠(yuǎn)高于以LB培養(yǎng)至D560 nm為0.5～1.0再加入IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)方式。影響重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的主要因素包括宿主菌、接種量、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)劑的選擇、補(bǔ)料方式等[9-10]。本研究在借鑒前人經(jīng)驗(yàn)和自誘導(dǎo)原理的基礎(chǔ)上，采用生物反應(yīng)器進(jìn)行高密度發(fā)酵，即先以葡萄糖作為碳源使細(xì)菌生長(zhǎng)到高密度，再以流加含甘油和乳糖組合的方式誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，結(jié)果菌體密度D600 nm達(dá)到搖瓶培養(yǎng)的4.2倍，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到搖瓶培養(yǎng)的1.5倍，菌體密度和相對(duì)表達(dá)量的乘積達(dá)到搖瓶培養(yǎng)的6.5倍。本研究所采用的高密度發(fā)酵策略使重組蛋白產(chǎn)率大大提高，并且其后的動(dòng)物試驗(yàn)也證明發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的免疫效果，此策略可供其他研究者借鑒參考。另外，本研究的發(fā)酵產(chǎn)物以可溶性形式表達(dá)，將有利于蛋白折疊成天然構(gòu)象進(jìn)而露出抗原表位，可能有助于抗原獲得可靠的免疫效果。

本研究首次報(bào)道了同時(shí)含有腐敗梭菌α毒素和產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵工藝，及其產(chǎn)物在家兔和綿羊上的免疫效果。同時(shí)表達(dá)2種毒素蛋白的優(yōu)勢(shì)在于僅發(fā)酵1株大腸桿菌即可達(dá)到預(yù)防2種疾病的目的。家兔和綿羊試驗(yàn)結(jié)果也表明，重組蛋白免疫效果良好，其誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的較好的血清中和效價(jià)顯著高于現(xiàn)有《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)[8]，即使低至“每只動(dòng)物予37.5 μg”的抗原免疫量仍可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。筆者曾報(bào)道現(xiàn)有疫苗檢驗(yàn)合格率不高[2]，并且田間綿羊效價(jià)檢測(cè)合格率也偏低（數(shù)據(jù)未報(bào)道）。由此推知，靶動(dòng)物免疫持續(xù)期的抗體效價(jià)將更難達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。值得一提的是，國(guó)際上羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥類疫苗無(wú)論在田間使用還是在替代動(dòng)物效力檢驗(yàn)[11-12]上均采用2次免疫。故本研究對(duì)二免家兔和綿羊的血清效價(jià)均進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示2種組分的二免效價(jià)均獲得大幅增長(zhǎng)，分別提升為《中華人民共和國(guó)獸藥典》合格標(biāo)準(zhǔn)的至少12倍和67倍，此結(jié)果為我國(guó)此類疫病的防控及制品質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與方法的改進(jìn)提供了參考依據(jù)。綜合一免、二免數(shù)據(jù)來(lái)看，家兔和綿羊獲得最佳效價(jià)的抗原劑量相同，且各劑量的家兔效果普遍好于綿羊，推測(cè)其原因可能是綿羊體質(zhì)量相對(duì)較大，故需要接種的抗原量更多。

隨著基因工程技術(shù)的日益成熟，亞單位疫苗的發(fā)展速度也越來(lái)越快，本研究結(jié)果為羊快疫和腸毒血癥的預(yù)防提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。此外，國(guó)內(nèi)外常將不同的梭菌組分相互聯(lián)合或與其他非梭菌組分相聯(lián)合制備多聯(lián)苗，以達(dá)到“一針多防”的目的[8，11-12]。本研究所制備的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明，可用于同時(shí)預(yù)防羊快疫和腸毒血癥，至于將其進(jìn)一步聯(lián)合其他組分制備更多聯(lián)疫苗的可行性及組分間的兼容性，仍有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳溥言. 獸醫(yī)傳染性學(xué)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：194-196.

[2]彭小兵，李旭妮，蔣玉文，等. 腐敗梭菌類毒素抗原含量與免疫效果之間的關(guān)系研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2016，52（4）：6-8.

[3]Amimoto K，Ohgitani T，Sasaki O，et al. Protective effect of Clostridium septicum alpha-toxoid vaccine against challenge with spores in Guinea pigs[J]. Journal of Veterinary Medical Science，2002，64（1）：67-69.

[4]Lancto C A，F(xiàn)oster L K，Kromm M M，et al. A noncytolytic alpha toxin recombinant protein protects turkeys against Clostridium septicum challenge[J]. Avian Diseases，2014，58（4）：566-571.

[5]Ferreira M R，Moreira G M，Da Cunha C E，et al. Recombinant alpha，beta，and epsilon toxins of Clostridium perfringens：production strategies and applications as veterinary vaccines[J]. Toxins，2016，8（11）：1-24.

[6]農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：41-51.

[7]Studier F W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures[J]. Protein Expression and Purification，2005，41（1）：207-234.

[8]中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典（三部）[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2016：44-49.

[9]陳 理，俞昌喜. 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝進(jìn)展[J]. 海峽藥學(xué)，2011，23（3）：15-18.

[10]張建新，張 噸，胡文波，等. 重組大腸桿菌高細(xì)胞密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造，2011，227（2）：5-8.

[11]Animal and plant health inspection service，USDA. 9 CFR Ch.I（1-1-07 Edition）[M]. Washington：U.S.Government Printing Office，2007：688-698.

[12]British pharmacopoeia（Veterinary）[M]. London：the Stationery Office，2005：192-199.