岳圓圓 全英杰 任鏝蓉

摘要：研究貢菊花蕾期、露白期、初花期和盛花期中木樨草苷、綠原酸和異綠原酸含量及其相關CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因相對表達量的變化，為確定貢菊最佳采收時期提供理論依據。結果表明，綠原酸、木樨草苷和異綠原酸的含量都在露白期迅速下降，初花期上升，盛花期逐漸下降，其中在初花期含量最高，分別為 0.43%、0.27%和0.33%。利用實時熒光定量PCR檢測CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因的相對表達量發(fā)現(xiàn)，這些基因表達量變化呈現(xiàn)出橫向“S”形，并在初花期達到最高值，與木樨草苷、綠原酸、異綠原酸含量的變化趨勢相似，進一步表明貢菊在初花期木樨草苷、綠原酸、異綠原酸含量最高。

關鍵詞：綠原酸;木樨草苷;異綠原酸

中圖分類號： S682.1+10.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0165-04

菊花[Chrysanthemum morifolium （Ramat） Tzvel.]為菊科多年生草本植物，具有較高的觀賞價值和藥用價值，根據菊花的用途可分為觀賞性菊和功能性菊。功能性菊包括藥用菊、茶用菊和食用菊3種[1]。貢菊是功能性菊花栽培的主要品種之一，其朵大瓣寬，中心為黃色，蒂呈綠色，生長在安徽省南部海拔較高的山區(qū)，貢菊不僅是茗飲佳品，還是名優(yōu)藥材。《中華人民共和國藥典》規(guī)定綠原酸、異綠原酸和木樨草苷為藥用菊的主要成分[2]。綠原酸、異綠原酸和木樨草苷都是通過苯丙氨酸代謝途徑合成的，木樨草苷合成的直接前體是p-香豆酸酰CoA和3-丙二酰CoA，在一系列酶的催化作用下最終合成木樨草苷，其中關鍵的合成酶是黃酮合成酶（flavone synthase，簡稱FNS）[3];香豆酸-3-羥化酶（p-coumarate-hydroxylase，簡稱C3H）和羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉移酶（hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，簡稱HQT）等為綠原酸和異綠原酸合成的關鍵酶[4]，編碼這些酶的基因表達也同樣反映物質的積累，在咖啡中HQT、C3H、HCT等基因的表達量增加，綠原酸含量也隨之增加[5]，這些編碼酶的功能基因表達主要受到植物發(fā)育期和外界環(huán)境等因素的影響。

不同的采收時間對藥用菊主要活性成分含量的影響較大，陳志蓮報道，野菊從花蕾期到盛開期黃酮含量逐漸降低[5];梁迎暖等研究顯示，隨著懷菊花期的到來，黃酮和綠原酸含量呈現(xiàn)先升高后下降的變化，最佳的采收時期為70%的花開放時期[6];楊俊等檢測了杭白菊黃酮和綠原酸含量的變化，結果發(fā)現(xiàn)，綠原酸含量未發(fā)生變化，黃酮含量隨采收期推遲呈下降趨勢[7]。由此可見，不同菊花品種在不同采收時期的活性物質含量變化不同。目前，關于貢菊采收時期與活性物質含量變化關系的研究未見報道。因此，本試驗以貢菊為材料，研究花蕾期、露白期、初開期和盛開期4個時期花序中綠原酸、木樨草苷和異綠原酸含量的變化及其關鍵基因的表達量，為確定貢菊最佳采收期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將貢菊扦插苗移栽到含腐殖土、珍珠巖（體積比為3 ∶ 1）的花盆中，移到延邊大學農學院溫室進行培養(yǎng)，溫度為（25±2） ℃，相對濕度為70%。貢菊現(xiàn)蕾后按照蕾期、露白期、初花期和盛花期選擇頂芽花進行采集（圖1），放到液氮中帶回

實驗室，于 -80 ℃ 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制備 稱取綠原酸、木樨草苷和異綠原酸各1.5 mg，分別加入1.95 mL 70%的甲醇溶液，振蕩搖勻，使其充分溶解，獲得標準對照品母液（0.769 mg/mL），再將其配制成0.25 mg/mL的混合對照標準品母液，分別將其稀釋成濃度為0.250、0.200、0.125、0.100、0.062、0.031和 0.017 mg/mL 的7種不同濃度的混合標準對照品溶液，用高效液相色譜儀（Agilent 1260）進行分析。色譜條件如下：以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗提程序為 0～11 min，10%～18% A;11～30 min，18%～20% A;30～40 min，20% A;40～45 min，20%～10% A;流速為1 mg/mL，檢測波長為350 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL。記錄峰面積，以各標準濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算綠原酸、木樨草苷和異綠原酸含量的線性關系。

1.2.2 樣品溶液的制備與測定 取不同花期的干燥樣品，分別用打碎機打碎，稱取樣品粉末0.25 g，分別置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%色譜級甲醇溶液，蓋上塞子，封閉放置。超聲處理（120 W，40 kHz）40 min，冰浴冷卻至室溫，5 000 r/min 離心30 min，上清用旋轉蒸發(fā)儀濃縮處理，冷卻至室溫，用2.5 mL 70% 色譜級甲醇溶液溶解，取溶液經微孔濾膜過濾后測定。

1.2.3 貢菊RNA的提取及反轉錄 采用RNA提取試劑盒（RNAiso Plus）分別提取貢菊不同花期的RNA，采用NanoDrop ND-2000型微量核酸蛋白定量測定儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]測定RNA濃度和質量。利用反轉錄試劑盒（天根生化科技有限公司），按照說明書將1 000 ng RNA合成cDNA第1鏈，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 相關基因的表達分析 根據菊花轉錄組數據，分別找到CmFNS1、CmC3H、CmHQT基因的序列，并在3′端序列設計特異性引物FNS1-F、FNS1-R、C3H-F、C3H-R、HQT-F、HQT-R（表1），采用熒光定量PCR儀（Agilent 3005）進行定量分析，反應程序如下：95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。最后加入溶解曲線程序，以EF1α基因為內參，每個樣品重復3次，采用2-ΔΔCT公式計算基因相對表達量。

1.3 數據分析

每個試驗處理設3次重復，數據用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用鄧肯氏新復極差法作顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 綠原酸、木樨草苷和異綠原酸標準曲線

將綠原酸、木樨草苷和異綠原酸標準樣品配成不同濃度，分別取5 μL進樣分析，分別以峰面積、質量濃度為縱、橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程（圖2）。綠原酸的回歸方程為y=4 521.6x+3.851 5（r2=0.998 7），木樨草苷的回歸方程為y=22 136x-130.83（r2=0.992 8），異綠原酸的回歸方程為y=12 521x-50.123（r2=0.997 1），標準曲線在標準品濃度范圍內線性良好。

2.2 不同花期綠原酸、木樨草苷和異綠原酸的含量分析

貢菊在花蕾期、露白期、初花期和盛花期時綠原酸、木樨草苷和異綠原酸含量發(fā)生較大變化（圖3）。綠原酸含量在花蕾期和初花期較高，分別為0.33%和0.43%，在露白期和盛花期較低;木樨草苷在花蕾期和露白期含量較低，初花期含量達到最高值，為0.27%，在盛花期含量又下降;異綠原酸含量同樣也在初花期最大，為0.33%，其次是花蕾期和盛花期。貢菊中綠原酸、木樨草苷和異綠原酸的含量都在初花期時最高。

2.3 CmFNS1、CmHQT和CmC3H基因的相對表達量

CmFNS1是木樨草苷合成的關鍵基因，它編碼黃酮合成酶。由圖4可見，CmFNS1在貢菊花蕾期的相對表達量最高，露白期表達量降低，初花期表達量升高，盛花期表達量降低，呈現(xiàn)橫向“S”形，這與不同花期木樨草苷含量的變化相一致;CmHQT和CmC3H分別編碼羥基肉桂酰輔酶A奎尼酸轉移酶和香豆酸羥化酶，是綠原酸和異綠原酸合成的關鍵酶，CmHQT和CmC3H基的因相對表達量在花蕾期最高，露白期迅速降低，初花期相對表達量緩慢升高，盛花期逐漸降低，CmHQT和CmC3H相對表達量的變化趨勢與綠原酸和異綠原酸含量的變化趨勢相似。

3 討論與結論

3.1 綠原酸、木樨草苷和異綠原酸在不同花期含量的變化

藥用菊的主要活性物質為綠原酸、木樨草苷和異綠原酸等，影響這些活性物質含量的主要有品種、采收期、氣候條件等。劉莉等研究杭菊、貢菊和亳菊3種藥用菊花時發(fā)現(xiàn)，亳菊中木樨草素含量最高[8];魏民等研究發(fā)現(xiàn)，野菊花中的菊花苷含量在花蕾期、初花期、盛花期、末花期中逐漸下降[9];劉沁等發(fā)現(xiàn)，雪菊在采收中期時總黃酮含量最高，而在采收末期時綠原酸含量最高，總酚含量卻在采收初期最高[10]。在這些

影響因素中，采收期對活性物質影響較大而且容易調控。本研究發(fā)現(xiàn)，貢菊在不同采收期（花蕾期、露白期、初花期和盛花期）綠原酸、木樨草苷和異綠原酸活性物質含量均不同，都在初花期最高。貢菊花蕾期單花干質量低于盛花期干質量，單花木樨草苷、綠原酸含量在盛花期時分別為182、262 μg/mg，在初花期時分別為271、439 μg/mg，盛花期均小于初花期。并且盛花期的貢菊花色變淡，有些花粉散落，影響菊花品質，而初花期采摘后的貢菊，側枝萌發(fā)的花朵比盛花期采收的側枝花朵更大些，因此建議貢菊在初花期采摘。

3.2 綠原酸、木樨草苷和異綠原酸合成相關基因的表達

綠原酸、異綠原酸和木樨草苷合成都通過苯丙氨酸代謝途徑，主要受到PAL、C3H、CHS、FNS、C3H、HQT等結構基因的表達影響。FNS包括黃酮合成酶Ⅰ（FNSⅠ）和黃酮合成酶Ⅱ（FNSⅡ）。FNSⅠ是一種可溶性的2-酮戊二酸和依賴Fe2+的雙加氧酶，催化黃烷酮轉化為黃酮，主要存在于傘形科中[11]，最近也在水稻和擬南芥中發(fā)現(xiàn)[12-13]。FNSⅡ屬于細胞色素P450，它依賴于NADPH和氧分子的膜結合成單氧化酶，催化黃烷酮C-2和C-3之間形成雙健轉化為黃酮，存在于大多數植物中。在大豆[14]、水稻[15]、金銀花[16]中超表達FNS基因，可促進黃烷酮合成黃酮（5，7-二羥基黃酮、芹黃素和木樨草素）。本研究發(fā)現(xiàn)，貢菊含有FNS1和FNS2，F(xiàn)NS1在不同花期的相對表達量變化與木樨草苷含量一致，F(xiàn)NS2的相對表達量未發(fā)生變化，這可能由于FNS2不參與木樨草苷合成。張靜茹等研究發(fā)現(xiàn)，金銀花愈傷組織中綠原酸的量隨HQT基因表達量的升高而升高，C3H基因能夠催化苯丙烷類代謝產物C3位置的羥基化，是苯丙烷類代謝中的1個關鍵酶，可參與多種苯丙素類代謝產物的合成，如木質素、綠原酸、迷迭香等[17]。熒光定量PCR檢測結果顯示，C3H和HQT相對表達量變化趨勢與綠原酸和異綠原酸含量相似，這表明C3H和HQT參與綠原酸和異綠原酸合成。此外，還發(fā)現(xiàn)FNS1、C3H和HQT的相對表達量在花蕾期最高，而相應的木樨草苷、綠原酸和異綠原酸含量在初花期最高，這還需要進一步研究。

參考文獻：

[1]戴思蘭，溫小蕙. 菊花的藥食同源功效[J]. 生命科學，2015，27（8）：1083-1090.

[2]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2005.

[3]Yun C S，Nozawa T Y. Expression of parsley flavone synththase Ⅰ setablishes the flavone biosynthetic pathway in Arabidopsis thaliana[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2008，72（4）：968-973.

[4]代麗麗. 轉AtMYB12基因提高馬鈴薯中綠原酸含量的研究[D]. 泰安：山東農業(yè)大學，2013.

[5]陳志蓮. 不同貯藏期、不同品種菊花中總黃酮的含量比較[J]. 基層中藥雜志，2001，15（5）：18-19.

[6]梁迎暖，郭巧生，張重義，等. 懷菊花期次生代謝物含量及同功酶活性動態(tài)變化研究[J]. 中國中藥雜志，2007，32（3）：199-202.

[7]楊 俊，蔣惠娣，戈 震，等. 杭白菊綠原酸及其他成分的含量在采摘期中的動態(tài)變化[J]. 中國藥學雜志，2003，38（11）：833-836.

[8]劉 莉，龍 娉，姚建忠. HPLC法測定3種常見菊花中木樨草素的含量[J]. 藥學實踐雜志，2009，27（4）：289-290，293.

[9]魏 民，韓正洲，馬 慶，等. 基于超高效液相色譜技術確定野菊花適宜采收期[J]. 廣州中醫(yī)藥大學學報，2018，35（3）：519-524.

[10]劉 沁，秦 勇，陳安新. 雪菊不同開放程度對其品質的影響[J]. 黑龍江農業(yè)科學，2016（1）：132-134.

[11]Martens S，F(xiàn)orkmann G，Matern U，et al. Cloning of parsley flavone synthase Ⅰ[J]. Phytochemistry，2001，58（1）：43-46.

[12]Falcone Ferreyra M L，Emiliani J，Jose Rodriguez E，et al. The identification of maize and Arabidopsis type Ⅰ flavone synthases links flavones with hormones and biotic interactions[J]. Plant Physiology，2015，169（2）：1090-1107.

[13]Kim J H，Cheon Y M，Kim R G，et al. Analysis of flavonoids and characterization of the OsFNS gene involved in flavone biosynthesis in rice[J]. Plant Biology，2008，51：97-101.

[14]Fliegmann J，F(xiàn)urtwangler K，Malterer G，et al. Flavone synthase Ⅱ（CYP93B16） from soybean （Glycine max L.）[J]. Phytochemisty，2010，71（5/6）：508-514.

[15]Lee Y J，Kim J H，Kim B G，et al. Characterization of flavone synthase Ⅰ from rice[J]. BMB Reports，2008，41（1）：68-71.

[16]Yuan Y，Wang Z Y，Jiang C，et al. Exploiting genes and functional diversity of chlorogenic acid and luteoloside biosynthese in Lonicera japonica and their subsitutes[J]. Gene，2014，534（2）：408-416.

[17]張靜茹，吳敏琳，李衛(wèi)東，等. 金銀花HQT基因在真核植物細胞中對綠原酸生物合成的調控[J]. 中草藥，2016，47（20）：3683-3687.