高靜 閻建俠 劉博雅 李正 羅天俠 紀(jì)穎

1 天津市武清區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 （天津 301700）

2 天津市武清區(qū)人民醫(yī)院兒科 （天津 301700）

內(nèi)容提要： 目的：分析肺炎支原體檢測(cè)試劑盒快速培養(yǎng)法與LAMP法用于肺炎支原體檢測(cè)的價(jià)值。方法：選取本院兒科2017年1月～2018年6月收治的疑似肺炎支原體肺炎患兒100例作為研究對(duì)象，分別給予肺炎支原體檢測(cè)試劑盒快速培養(yǎng)法與LAMP法檢測(cè)肺炎支原體，同時(shí)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法做比對(duì)，分析兩種檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間與陽(yáng)性率。結(jié)果：LAMP法檢測(cè)肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間短于肺炎支原體檢測(cè)試劑盒快速培養(yǎng)法，陽(yáng)性率高于快速培養(yǎng)法，P＜0.05。結(jié)論：LAMP法用于肺炎支原體檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間較短、陽(yáng)性率較高，有很好的應(yīng)用前景。未來(lái)應(yīng)加深對(duì)LAMP法檢測(cè)肺炎支原體的研究，克服檢測(cè)中的困難，擴(kuò)大LAMP法檢測(cè)肺炎支原體的應(yīng)用范圍。

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是人肺炎支原體肺炎的病原體。有研究表明，肺炎支原體有一定的傳染性，是引起兒童呼吸道感染的常見(jiàn)病原體之一。臨床表現(xiàn)具有多樣性，多為劇烈咳嗽、發(fā)熱、畏寒、頭痛、咽痛，以上呼吸道感染、支氣管肺炎最為常見(jiàn)，一些患者由上呼吸道感染可發(fā)展至重癥肺炎[1]。肺炎支原體感染是支原體肺炎的重要表現(xiàn)因素，是急性呼吸道感染的常見(jiàn)病原體。近年來(lái)，肺炎支原體感染的發(fā)病率呈增高趨勢(shì)，因其臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，易與細(xì)菌性和病毒性感冒混淆，故早期的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)臨床診治具有重要意義[2]。本研究納入2017年1月～2018年6月本院兒科收治的疑似肺炎支原體患兒100例作為研究對(duì)象，同時(shí)給予肺炎支原體檢測(cè)試劑盒快速培養(yǎng)法、LAMP法進(jìn)行檢測(cè)，并與實(shí)時(shí)熒光PCR法比對(duì)，現(xiàn)將具體資料及研究結(jié)果報(bào)告如下。

1.資料和與方法

1.1 臨床資料

病歷來(lái)源為本院兒科2017年1月～2018年6月收治的疑似肺炎支原體肺炎患兒100例，其中男童62例，女童38例，年齡4個(gè)月～11歲，平均（5.04±1.44）歲。所有患兒家長(zhǎng)對(duì)本研究知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：具有發(fā)熱（體溫≥38°C），伴咳嗽或咽痛等呼吸道感染癥狀，病程在7d以內(nèi)，以社區(qū)獲得性肺炎或肺炎支原體肺炎為主。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：患有肺結(jié)核、肺部腫瘤、非感染性肺間質(zhì)性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)癥及免疫功能低下等患兒。

1.3 材料

1.3.1 樣品與試劑

MP陽(yáng)性質(zhì)粒、100例臨床標(biāo)本；

DNA提取試劑盒（德國(guó)凱杰生物公司）；

FLUO-LAMP反應(yīng)液（Master Mix，弗羅朗生物科技有限公司）；

MP引物（英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成）；

肺炎支原體（MP）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法，上海復(fù)興長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司）；

肺炎支原體快速培養(yǎng)法試劑盒（武漢菁華時(shí)間科技有限公司）。

1.3.2 儀器

恒溫?cái)U(kuò)增熒光PCR儀（FLUO-GENE，弗羅朗生物科技有限公司）；

小型離心機(jī)（弗羅朗生物科技有限公司）；

實(shí)時(shí)熒光PCR儀（LC480，羅氏）。

1.4 方法

1.4.1 快速培養(yǎng)法。棉拭子吸附生理水在患兒喉深部捻轉(zhuǎn)數(shù)次，肺炎支原體對(duì)細(xì)菌表面有很強(qiáng)的親和力，應(yīng)盡可能收集到更多樣本。采用肺炎支原體的檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書將呼吸道咽拭子放置于培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)攪動(dòng)，靠瓶壁擠盡殘液，旋緊瓶蓋后放置于37°C溫箱培養(yǎng)，6～12h內(nèi)觀察結(jié)果，試劑顏色由紅色變?yōu)榍辶咙S色則為陽(yáng)性，試劑顏色為紅色、淡紅色則為陰性[3]。

1.4.2 LAMP法。利用MP陽(yáng)性質(zhì)粒核酸，按10倍梯度稀釋，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇可檢出的最低濃度；將引物濃度由原工作濃度逐漸增加，利用低濃度陽(yáng)性核酸重復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳引物濃度，優(yōu)化反應(yīng)效率。使用專用一次性咽拭子采集管進(jìn)行標(biāo)本收集，DNA提取采用專用MP-DNA提取試劑盒。LAMP檢測(cè)樣本，按以下條件進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：

反應(yīng)體系（25μL）：F3 1μL，B3 1μL，F(xiàn)IP 1μL，BIP 1μL，LF1μL，LB 1μL，Master Mix 15μL，模板4μL。

反應(yīng)溫度：63～65°C，退火溫度（Anneal）：98～80°C。每次反應(yīng)除檢測(cè)樣本外，同時(shí)設(shè)置質(zhì)控系統(tǒng)，進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。通過(guò)對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照、觀察溶解曲線的峰值來(lái)確定反應(yīng)的準(zhǔn)確性。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)樣本

參照MP核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

表1. 兩種方法檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)比(例)

表2. 快速培養(yǎng)法與LAMP法檢測(cè)結(jié)果(例)

肺炎支原體檢測(cè)試劑盒快速培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為6～12h，平均（7.41±0.91）h；LAMP法的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為0.25～1h，平均（0.70±0.11）h；t=9.972，P＜0.05。

使用兩種方法分別檢測(cè)100例標(biāo)本，同時(shí)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法比對(duì)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

由于方法學(xué)差異等原因，兩種檢測(cè)結(jié)果存在不一致。肺炎支原體檢測(cè)試劑盒快速培養(yǎng)法與LAMP法檢測(cè)結(jié)果差異如表2所示。

快速培養(yǎng)法檢測(cè)肺炎支原體的陽(yáng)性例數(shù)為18例，陽(yáng)性率為18%；LAMP法檢測(cè)肺炎支原體的陽(yáng)性例數(shù)為34例，陽(yáng)性率為34%；χ2=8.775，P＜0.05。

我們將實(shí)時(shí)熒光定量PCR法作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)：LAMP法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，只有一個(gè)結(jié)果出現(xiàn)偏差；快速培養(yǎng)法檢測(cè)的陽(yáng)性例數(shù)較低，且陽(yáng)性的18例標(biāo)本中只有10例與LAMP法和實(shí)時(shí)熒光PCR法結(jié)果一致，這其中真菌和耐藥菌是快速培養(yǎng)法假陽(yáng)性最主要的因素。此外，標(biāo)本的采集、口腔中食物殘?jiān)八嵝燥嬃弦矔?huì)影響快速培養(yǎng)法的結(jié)果判定。肺炎支原體檢測(cè)試劑盒快速培養(yǎng)法檢測(cè)陰性，而LAMP法和實(shí)時(shí)熒光PCR法陽(yáng)性，主要是由于PCR的檢出率相對(duì)較高，猜測(cè)可能與標(biāo)本的采集、肺炎支原體的攜帶等有關(guān)。

3.討論

肺炎支原體常存在于纖毛上皮細(xì)胞之間，不侵入肺實(shí)質(zhì)，可通過(guò)細(xì)胞膜上神經(jīng)氨酸受體點(diǎn)位吸附于機(jī)體呼吸道上皮細(xì)胞表面，抑制纖毛活動(dòng)、破壞上皮細(xì)胞，繼而引發(fā)支氣管炎、肺炎等疾病[4]。肺炎支原體感染發(fā)病初期癥狀并無(wú)顯著特異性，更多表現(xiàn)為急性呼吸道感染、氣管支氣管炎等，有時(shí)合并其他并發(fā)癥，發(fā)病初期易因用藥不當(dāng)而延誤治療。肺炎支原體常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有培養(yǎng)法、PCR檢測(cè)、肺炎支原體快速培養(yǎng)、血清抗體檢測(cè)法等?；诜窝字гw檢測(cè)試劑盒的肺炎支原體病原體培養(yǎng)檢測(cè)是目前肺炎支原體檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，其原理為在培養(yǎng)基中添加適合肺炎支原體自身的生長(zhǎng)因子刺激肺炎支原體大量增殖，對(duì)培養(yǎng)基中特異性代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步鑒別肺炎支原體。但這種方法實(shí)驗(yàn)條件苛刻、生長(zhǎng)緩慢、耗時(shí)較長(zhǎng)[5]。近年來(lái)，肺炎支原體快速培養(yǎng)法不斷發(fā)展并在臨床中獲得廣泛應(yīng)用，其原理在于利用培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)因子進(jìn)行增殖分解糖類產(chǎn)生氫離子使培養(yǎng)基中pH值下降，然后觀察培養(yǎng)基中酚紅指示劑即可判斷肺炎支原體生長(zhǎng)情況。當(dāng)患者感染肺炎支原體后會(huì)刺激機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)IgM和IgG抗體，通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)肺炎支原體一般有冷凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接免疫熒光法、被動(dòng)顆粒凝集法、金標(biāo)法等幾種方式，但在肺炎支原體感染初期一般僅發(fā)生局部免疫，不伴隨體液免疫反應(yīng)，故該方法不能在肺炎支原體感染初期起到檢測(cè)目的，在感染急性期作用較好[6]?；跓晒釶CR儀的PCR檢測(cè)即聚合酶鏈反應(yīng)，是一種分子基因檢測(cè)方法，現(xiàn)在已廣泛用于肺炎支原體的檢測(cè)。常規(guī)PCR檢測(cè)選取患者的咽拭子、痰液、肺部灌洗液等作為樣本，并在瓊脂糖凝膠電泳中直觀分析結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化的一種方法，該方法與常規(guī)PCR方法相比較檢測(cè)特異性較好，自動(dòng)化程度較高，可對(duì)微量病原體進(jìn)行檢測(cè)。但PCR檢測(cè)設(shè)備昂貴，技術(shù)要求較高。

LAMP法，英文名為L(zhǎng)oop-mediated isothermal ampli fication，即環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR。作為一種新的基因診斷技術(shù)，LAMP法針對(duì)目標(biāo)基因DNA或cDNA在6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，利用恒溫聚合酶（BstDNA聚合酶），在60～65°C恒溫下完成擴(kuò)增。利用LAMP法1h內(nèi)即可完成擴(kuò)增109～1010個(gè)數(shù)量級(jí)。LAMP法檢測(cè)肺炎支原體的原理在于以核酸分子體外擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，該方法與PCR技術(shù)相似，但不依賴昂貴的儀器設(shè)備，因此非常適合基層實(shí)驗(yàn)室病原微生物的檢測(cè)。與PCR技術(shù)相比較，LAMP法多2條引物。引物設(shè)計(jì)方面，LAMP法需保證在不同的6個(gè)區(qū)域結(jié)合目的DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間通常為15～60min，一般30min內(nèi)即可完成，判斷結(jié)果時(shí)直接通過(guò)擴(kuò)增曲線和溶解曲線即可判斷。本組研究中快速培養(yǎng)法的平均實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間（7.41±0.91）h；LAMP法平均實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為（0.70±0.11）h，P＜0.05，表明LAMP法檢測(cè)肺炎支原體在實(shí)驗(yàn)時(shí)間方面更具優(yōu)勢(shì)。本組研究中LAMP法檢測(cè)肺炎支原體，以MP陽(yáng)性質(zhì)粒核酸為樣本，在選擇引物序列、提高引物濃度和反應(yīng)溫度等條件上進(jìn)行優(yōu)化，使反應(yīng)效率最佳。為了使檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置質(zhì)量控制、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以監(jiān)測(cè)反應(yīng)流程，避免出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果顯示，LAMP法檢測(cè)肺炎支原體陽(yáng)性率高于快速培養(yǎng)法。目前LAMP法廣泛用于人、動(dòng)物、植物的病原體檢測(cè)，如禽流感、艾滋病、SARS等，且很多公司已合成出專業(yè)的試劑盒，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出相關(guān)病原體。現(xiàn)階段在國(guó)外已有很多研究者利用LAMP法檢測(cè)肺炎支原體。盡管LAMP法檢測(cè)肺炎支原體發(fā)展時(shí)間較短，但技術(shù)特點(diǎn)鮮明，特異性高，總耗時(shí)長(zhǎng)短。

本課題所建立的方法在保證特異性強(qiáng)、靈敏度高的基礎(chǔ)上，操作更簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境要求相對(duì)較低。在經(jīng)過(guò)優(yōu)化反應(yīng)并檢測(cè)樣本核酸后，發(fā)現(xiàn)樣本中核酸濃度高時(shí)（＞=300cps/μL）本方法檢測(cè)時(shí)間只需20～30min，而樣本核酸濃度較低（＜300cps/μL）本方法檢測(cè)時(shí)間需要1h才可完成，這是近期亟待解決的問(wèn)題之一。使用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，需要從樣本中提取核酸，有效的提取才能保證之后的成功檢驗(yàn)。因此，未來(lái)希望能實(shí)現(xiàn)核酸簡(jiǎn)單高效提取方法，甚至可以和擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。相信隨著臨床研究的深入以及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，一定能夠更加準(zhǔn)確、快速地診斷并有效治療肺炎支原體感染。