陳仲輝　陳宇　翁愛彬　羅芳　郭隆華　邱彬　林振宇　陳國(guó)南

摘?要?腦神經(jīng)相關(guān)的各種生理和病理過(guò)程需在眾多生理活性物質(zhì)的共同參與下完成。硫化氫（H2S）作為第三類內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理機(jī)能方面起重要的調(diào)節(jié)作用。因此，在活體層次實(shí)現(xiàn)H2S的精準(zhǔn)定量分析，將極大推動(dòng)人類揭秘腦神經(jīng)過(guò)程中的分子機(jī)制的研究進(jìn)程。 然而，H2S具有較強(qiáng)的還原性和易揮發(fā)性，其物理化學(xué)性質(zhì)與腦內(nèi)含巰基化合物相似，實(shí)現(xiàn)H2S的高選擇性的分離分析成為其檢測(cè)的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。本文綜述了近年來(lái)各類型H2S檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)原理及研究進(jìn)展，對(duì)相關(guān)研究的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?硫化氫; 活體檢測(cè)方法; 評(píng)述

1?引 言

腦神經(jīng)系統(tǒng)在進(jìn)行信息傳遞時(shí)，需要諸多化學(xué)物質(zhì)參與。氣體信號(hào)分子是生命體中具有重要生理功能的內(nèi)源性氣體小分子的統(tǒng)稱，其分子量小、持續(xù)產(chǎn)生，且產(chǎn)生和代謝過(guò)程均由酶進(jìn)行調(diào)節(jié)。該類物質(zhì)主要以自由擴(kuò)散的形式進(jìn)出細(xì)胞膜，且擴(kuò)散速度快、無(wú)需特異性受體轉(zhuǎn)運(yùn)。H2S作為氣體信號(hào)分子，在胞內(nèi)合成并參與細(xì)胞間的信息傳遞[1]。內(nèi)源性H2S主要通過(guò)以下3種酶催化產(chǎn)生： 胱硫醚?β?合酶（CBS）、胱硫醚?γ?裂解酶（CSE）和3?巰基?硫酸轉(zhuǎn)移酶（3?MST）[2]。內(nèi)源性H2S在腦神經(jīng)的生理和病理過(guò)程中具有極其重要作用。 首先，H2S作為神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞和心血管系統(tǒng)的平滑肌松弛等過(guò)程[3～7]; 其次，H2S可作為神經(jīng)保護(hù)劑，清除體內(nèi)過(guò)量的活性氧物質(zhì)，減弱對(duì)機(jī)體的氧化損傷，以及神經(jīng)退行性病變和心肌損傷過(guò)程而引發(fā)的細(xì)胞凋亡[8～10]。因此，開展面向活體的H2S檢測(cè)對(duì)于深入理解生命體的生理功能及疾病的致病機(jī)理具有重要意義。本文對(duì)近年來(lái)H2S檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)原理及研究的進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)該領(lǐng)域未來(lái)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

2?H2S檢測(cè)方法

由于腦神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境極其復(fù)雜，含有神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、能量代謝物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)和大分子蛋白質(zhì)等，探究腦內(nèi)內(nèi)源性H2S的生理和病理作用很大程度依賴于H2S檢測(cè)方法的適用性。H2S的檢測(cè)方法在近十年來(lái)取得了極大進(jìn)展。 本文對(duì)可視化分析、熒光分析、電化學(xué)分析及化學(xué)發(fā)光分析4種類型的H2S檢測(cè)方法進(jìn)行歸納總結(jié)，著重概述各方法的設(shè)計(jì)理念、檢測(cè)機(jī)制及其應(yīng)用前景。

2.1?基于可視化分析的H2S檢測(cè)方法

以光學(xué)響應(yīng)信號(hào)為基礎(chǔ)的可視化檢測(cè)方法通過(guò)裸眼辨識(shí)反應(yīng)前后溶液顏色＼，種類的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)H2S的半定量檢測(cè)，可進(jìn)一步采用光度計(jì)讀取溶液吸光度的變化情況對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。該方法具有操作簡(jiǎn)單快捷、檢測(cè)成本相對(duì)較低和信號(hào)輸出可視化等特點(diǎn)。目前，根據(jù)溶液的顏色變化情況大致可分為單色、雙色和多色變化3種類型。

基于亞甲基藍(lán)顯色反應(yīng)檢測(cè)的H2S方法具有悠久歷史。 該方法首先在樣品中加入硫化物的捕獲劑乙酸鋅，隨后，在上述提取物中加入N，N?二甲基對(duì)苯二胺硫酸鹽，并在FeCl3的作用下生成亞甲基藍(lán); 通過(guò)測(cè)量亞甲基藍(lán)的吸光度，實(shí)現(xiàn)對(duì)H2S的定量檢測(cè)。該方法檢測(cè)H2S或者硫化物的濃度范圍約1～1000 μmol/L，且偏差小于3%[11]。為進(jìn)一步提高H2S可視化檢測(cè)方法的靈敏度，Tang等[12]利用鋱離子?G四鏈體?血紅素（Tb/G4?hemin）與具有催化活性的脫氧核酶（DNAzyme）形成過(guò)氧化物模擬酶，可催化H2O2氧化2，2'?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸（ABTS）產(chǎn)生綠色oxABTS的性質(zhì)，開發(fā)了一種檢測(cè)H2S的比色傳感器。由于Ag+可改變Tb/G4?hemin DNAzyme模擬酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其催化活性降低。而H2S能與Ag+競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使得Tb/G4?hemin DNAzyme催化ABTS的活性逐漸增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)oxABTS的可見光吸收峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)H2S的定量檢測(cè)。該方法對(duì)H2S濃度響應(yīng)的線性范圍為20 nmol/L～2 μmol/L，檢出限為13 nmol/L; 與其它的單色H2S可視化分析檢測(cè)方法相比，具有較高的靈敏度。

近年來(lái)，貴金屬納米粒子常被用于可視化檢測(cè)方法中?；谫F金屬納米粒子的可視化檢測(cè)方法是根據(jù)其聚集或解聚集程度不同導(dǎo)致溶液產(chǎn)生明顯的顏色差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的可視化分析檢測(cè)。Yuan等[13]構(gòu)建了一種硫代疊氮衍生物和活性酯功能化的金納米粒子（AE?Au NPs）化學(xué)傳感器。如圖1A所示，該傳感器利用金納米顆粒（Au NPs）局域表面等離子體共振（LSPR）的特性，其在均相溶液中呈現(xiàn)出紅色，在聚集態(tài)時(shí)，溶液的顏色變?yōu)樗{(lán)色，即顏色變化鮮明，可通過(guò)裸眼區(qū)分4 μmol/L H2S，初步實(shí)現(xiàn)對(duì)H2S的半定量檢測(cè)。Zhang等[14]基于Au NPs反聚集原理構(gòu)建了一種可視化快速檢測(cè)H2S氣體的方法。Au NPs在高鹽緩沖液中容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶液變成藍(lán)色。該傳感器采用鼓泡的方式將H2S與Au NPs通過(guò)AuS鍵的形式結(jié)合，保證Au NPs均勻、穩(wěn)定地分散在含有80 mmol/L NaCl的Tris緩沖液。該方法靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了H2S的雙色可視化檢測(cè)。

為進(jìn)一步提高H2S可視化檢測(cè)的視覺(jué)靈敏度，研究人員通過(guò)調(diào)控貴金屬納米顆粒的形貌以改變其LSPR效應(yīng)，進(jìn)而使溶液產(chǎn)生更為豐富的顏色變化。3，3'，5，5'?四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色底物在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)中，具有顯色結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本課題組首次發(fā)現(xiàn)顯色反應(yīng)產(chǎn)物TMB2+可對(duì)金納米棒（Au NRs）產(chǎn)生氧化刻蝕，使Au NRs長(zhǎng)徑比發(fā)生改變，繼而溶液展現(xiàn)出豐富多彩的顏色變化[15]?；谏鲜鲈恚捎美备^(guò)氧化物酶（HRP）捕獲樣品中的H2S，引發(fā)HRP活性發(fā)生變化，導(dǎo)致HRP催化H2O2?TMB顯色液在相同的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生不同濃度的TMB2+; 當(dāng)加入Au NRs時(shí)，不同濃度的TMB2+對(duì)Au NRs可發(fā)生不同程度的刻蝕，實(shí)現(xiàn)了H2S的多色彩可視化檢測(cè)，如圖1B所示。 該方法成功應(yīng)用于鼠腦內(nèi)不同腦區(qū)微透析液中H2S濃度的可視化檢測(cè)。

2.2?基于熒光探針技術(shù)的H2S檢測(cè)方法

可視化檢測(cè)方法通常用于檢測(cè)離體的血清、組織勻漿或微透析液中的H2S濃度，檢測(cè)前需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，如血清蛋白分離、組織研磨和細(xì)胞破碎等步驟。熒光探針可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物幾乎無(wú)損且高時(shí)間分辨的檢測(cè)，為細(xì)胞或活體層次上H2S的定量分析提供了有效途徑。近年來(lái)，H2S熒光探針在設(shè)計(jì)、合成、作用機(jī)理探究以及在生命科學(xué)中的應(yīng)用等方面發(fā)展迅速。根據(jù)熒光探針與H2S識(shí)別機(jī)理大致可以分為3種：（1）基于H2S的還原性，將探針中疊氮基團(tuán)還原為氨基; （2）H2S與熒光探針發(fā)生親核加成反應(yīng); （3）H2S與熒光探針中的金屬配體的配位結(jié)合。

2.2.1?基于H2S的還原性原理構(gòu)建的熒光分析方法?有機(jī)疊氮化合物作為生物正交官能團(tuán)被廣泛用于化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。該類熒光探針可通過(guò)含胺類熒光分子上修飾疊氮基團(tuán)獲取，其合成途徑相對(duì)簡(jiǎn)單，具有良好的細(xì)胞相容性。H2S可將探針中的疊氮基團(tuán)還原成氨基，引發(fā)探針中電子密度發(fā)生變化，導(dǎo)致探針的熒光信號(hào)發(fā)生變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)H2S的定量分析。Lippert等[16]首次報(bào)道了基于羅丹明基的疊氮化合物熒光探針用于胞內(nèi)H2S的定量分析; 并進(jìn)一步對(duì)其官能團(tuán)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了血管內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子刺激靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性H2S的熒光成像。該類型的熒光探針為研究生命體系中的H2S提供了新思路?；诖?，越來(lái)越多的基于疊氮基團(tuán)的熒光探針被不斷設(shè)計(jì)合成，如香豆素類[17]、2?（2?氨基苯基）苯并噻唑類[18]、7?硝基苯并?2?氧代?1，3?二唑類[19]、二氰甲基二氫呋喃類[20]和間苯二甲酸類[21]等。

為進(jìn)一步提高設(shè)計(jì)合成的熒光探針對(duì)H2S的特異性識(shí)別能力，減少外部環(huán)境、檢測(cè)底物和光漂白等因素的影響，研究人員基于疊氮化合物和氨基之間的電子差異，構(gòu)建了用于H2S檢測(cè)的比率型熒光探針。比率型熒光探針是以兩個(gè)不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度比值作為目標(biāo)物定量信號(hào)。光源強(qiáng)度和儀器靈敏度等相對(duì)固定的干擾因素對(duì)比率熒光探針的影響較小，使得探針檢測(cè)靈敏度、選擇性和線性范圍有所提高。比率型熒光探針包含三部分：對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)的熒光基團(tuán)、參比熒光基團(tuán)和上述二者的連接基團(tuán)。Yu等[22]構(gòu)建了一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移的比率型熒光探針用于血清中H2S檢測(cè)，該探針中的碳量子點(diǎn)既是能量的給體也是探針的定位點(diǎn)，其檢出限為10 nmol/L。Wan等[23]合成了基于甲酚紫的H2S比率型熒光探針，實(shí)現(xiàn)了MCF?7細(xì)胞和斑馬魚中的H2S熒光成像，如圖2A所示。該探針有望用于監(jiān)測(cè)腦神經(jīng)系統(tǒng)中H2S的生理作用。為進(jìn)一步解決熒光探針自淬滅現(xiàn)象，即探針聚集引發(fā)信號(hào)淬滅對(duì)檢測(cè)信號(hào)的準(zhǔn)確性帶來(lái)的影響，Zhang等[24]將兩親性嵌段聚合物和疊氮改性的聚集誘導(dǎo)熒光（AIE）材料通過(guò)共沉淀的方式得到聚集誘導(dǎo)熒光量子點(diǎn)（AIE Ds）。該聚合物量子點(diǎn)具有優(yōu)良的AIE性能和較大的Stock位移（約150 nm），大大降低了自淬滅現(xiàn)象。該量子點(diǎn)具備良好的水分散性和穩(wěn)定性（>15周），可準(zhǔn)確區(qū)分出H2S與其它硫醇化合物，并成功實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)溶酶體中內(nèi)源性H2S熒光成像（圖2B）。

2.2.2?基于H2S與探針發(fā)生親核加成反應(yīng)構(gòu)建的熒光分析方法?H2S是一種優(yōu)良的親核試劑，在生理pH條件下主要以HS的形式存在。因此，與腦神經(jīng)系統(tǒng)中的其它硫醇物質(zhì)相比，H2S具有更高的親核性。H2S參與的親核反應(yīng)主要包含兩類：芳基硝基的硫解和共軛體系的破壞; H2S解離產(chǎn)生的HS?可與探針的親電基團(tuán)發(fā)生親核加成反應(yīng)[25，26]?；谠撛恚琇i等[25]采用（2，4?二硝基苯氧基）酪氨酸（DNPTYR）功能化的石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）合成了H2S觸發(fā)的信號(hào)增強(qiáng)型熒光探針，如圖3A所示。DNPTYR中含有二硝基苯氧基，可通過(guò)光致電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)猝滅GQDs的發(fā)光信號(hào); 樣品中的H2S可引發(fā)二硝基苯氧基發(fā)生重排，破壞光致電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)，進(jìn)而恢復(fù)熒光信號(hào)。該熒光探針對(duì)H2S響應(yīng)時(shí)間短，實(shí)現(xiàn)了應(yīng)激環(huán)境下胞內(nèi)H2S含量的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。Chen等[27]將花青素和香豆素?zé)晒饣鶊F(tuán)結(jié)合，構(gòu)建了一種線粒體靶向探針CouMC，并成功用于生理病理模型下胞內(nèi)H2S的定量分析檢測(cè)，如圖3B所示。Zhang等[28]合成了基于p?硝基芐基的比率熒光探針（RHP?2），其光穩(wěn)定性好，在不同樣品中，發(fā)射峰強(qiáng)度與H2S濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該探針成功應(yīng)用于抑郁模型下小鼠腦內(nèi)海馬細(xì)胞的H2S濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。為進(jìn)一步提高熒光探針的生物相容性，Zhang等[26]基于AIE和激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）原理，將疏水的AIE染料嵌入到脂質(zhì)體中，合成了對(duì)H2S響應(yīng)的AIE納米探針。該探針具有良好的細(xì)胞膜滲透性，成功用于斑馬魚體內(nèi)的H2S成像。

2.2.3?基于H2S與金屬配體配位結(jié)合原理構(gòu)建的熒光分析方法?基于金屬配體與H2S或硫化物配位結(jié)合的分析方法，也是一種經(jīng)典的H2S定量分析方法。如Cu2+通常在熒光探針中充當(dāng)信號(hào)猝滅劑，H2S可與探針中的Cu2+形成穩(wěn)定的CuS沉淀（Ksp=8.0×1036），觸發(fā)探針的信號(hào)開關(guān)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)[29～32]。Sasakura等[33]合成了HSIP?1熒光探針，該探針利用氮雜環(huán)Cu2+對(duì)探針的熒光強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)控，當(dāng)樣品中存在H2S時(shí)，探針中的Cu2+與H2S反應(yīng)產(chǎn)生CuS，進(jìn)而增強(qiáng)熒光信號(hào)。Yue等[34]利用選擇性識(shí)別Cu2+的DNAzyme與熒光標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了一種高特異性識(shí)別H2S的熒光傳感器。DNAzyme基底鏈和DNAzyme分別用熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)標(biāo)記，當(dāng)二者通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)相互靠近時(shí)，熒光信號(hào)猝滅。當(dāng)樣品中不含有H2S時(shí)，Cu2+引發(fā)DNAzyme基底鏈裂解，并產(chǎn)生熒光信號(hào); 當(dāng)樣品中含有H2S時(shí)，Cu2+與H2S反應(yīng)產(chǎn)生CuS沉淀，觸發(fā)DNAzyme基底鏈裂解能力減弱，熒光信號(hào)逐漸減弱。 Wang等[35]合成了基于碳量子點(diǎn)（CQDs）與銀納米粒子（Ag NPs）納米復(fù)合物熒光探針用于鼠腦微透析液中H2S的定量檢測(cè)，如圖4A所示。CQDs與Ag NPs之間形成AgN鍵，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致CQDs熒光信號(hào)發(fā)生猝滅; 而樣品中的H2S則與Ag NPs形成比AgN鍵更穩(wěn)定的AgS鍵，CQDs熒光信號(hào)隨著H2S濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。該方法具有較高的靈敏度，檢出限可達(dá)0.4 nmol/L，并成功用于大鼠腦缺血過(guò)程皮層H2S的定量檢測(cè)。

此外，貴金屬納米簇（NCs）也可用于檢測(cè)H2S或硫化物。Cui等[36]以牛血清白蛋白為模板，采用“一鍋法”合成了金納米簇（Au NCs），具有良好的水溶性、穩(wěn)定性和分散性。S2?可與Au NCs以AuS形式結(jié)合，猝滅Au NCs的熒光信號(hào)，因此可用于H2S的檢測(cè)，常見的陰離子對(duì)其檢測(cè)不產(chǎn)生干擾。Zhao研究組[37，38]利用Au NPs、谷胱甘肽（GSH）和熒光素（FITC）合成了Au NP?GSH?FITC熒光探針，如圖4B所示。該探針與在線液滴微流控芯片結(jié)合，可實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)微透析液中硫化物的變化情況，檢測(cè)的線性范圍為0.1～5.0 μmol/L，檢出限為50 nmol/L，探針與目標(biāo)物反應(yīng)時(shí)間小于2 min，實(shí)現(xiàn)了病理模型下鼠腦微透析液中H2S的連續(xù)檢測(cè)。

2.3?基于電化學(xué)傳感技術(shù)的H2S檢測(cè)方法

相較于可視化和熒光檢測(cè)方法，電化學(xué)方法具有靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短、易于集成和微型化的優(yōu)點(diǎn)，H2S的電化學(xué)檢測(cè)常常通過(guò)合理調(diào)控傳感界面來(lái)實(shí)現(xiàn)。以硫化物離子選擇性電極為代表的電化學(xué)檢測(cè)方法已廣泛用于生物樣品中的硫化物的定量分析[39?41]。該方法是在堿性溶液中測(cè)定硫化物的濃度，易于操作且能夠動(dòng)態(tài)檢測(cè)樣品中硫化物的濃度[42]。值得注意的是，在檢測(cè)過(guò)程中，樣品的pH值必須保持穩(wěn)定，并以此條件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。但該離子選擇性電極在檢測(cè)硫化物時(shí)，硫醇分子亦可與電極表面的Ag+/Ag2S結(jié)合，導(dǎo)致電極活性降低，再次使用前必須重新校準(zhǔn)。

理想的H2S檢測(cè)方法應(yīng)可用于生物樣品中的H2S或者硫化物的分析檢測(cè)，而不被基質(zhì)中的眾多生物鹽或其它生理活性物質(zhì)影響，同時(shí)能足夠靈敏地檢測(cè)出生理水平的H2S濃度。為克服硫離子選擇性電極在檢測(cè)生物樣品過(guò)程中頻繁校準(zhǔn)的缺點(diǎn)，研究人員開發(fā)了硫化物極譜傳感器[43，44]。該極譜傳感器的陰、陽(yáng)極及內(nèi)充液與外界待測(cè)樣品之間通過(guò)一種聚合物薄膜隔開，內(nèi)充液由K3[Fe（CN）6]和碳酸鹽緩沖液組成; 而H2S分子可自由穿過(guò)該聚合物薄膜，與內(nèi)充液作用并產(chǎn)生信號(hào)輸出。樣品中的H2S可以向聚合物膜的另一側(cè)自由擴(kuò)散，并在堿性溶液一側(cè)解離為HS或S2，同時(shí)將K3[Fe（CN）6]還原為K4[Fe（CN）6]，電子傳遞到陽(yáng)極，進(jìn)而產(chǎn)生電流信號(hào)。該傳感器背景電流低，從而具有較低的檢出限（～2 μmol/L）。

Dilgin等[45]探究了硫化物在槲皮素修飾石墨電極表面的電催化氧化行為。電化學(xué)表征結(jié)果表明，修飾電極對(duì)硫化物氧化具有明顯的電催化活性，硫化物的氧化電位由450 mV移至280 mV。Savizi等[46]采用殼聚糖/丙烯酰胺作為固定劑，將過(guò)氧化物酶固定在絲網(wǎng)印刷電極表面，制備了一種基于酶抑制的安培生物傳感器。該傳感器以氫醌作為電子傳遞介體，通過(guò)優(yōu)化基質(zhì)用量、介質(zhì)濃度和電解質(zhì)pH值等實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2S的高靈敏和高選擇性分析檢測(cè)。Qi等[47]構(gòu)建了一種通過(guò)檢測(cè)硫化物進(jìn)而檢測(cè)排硫桿菌活性的生物傳感器，并將其成功用于檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中硫化物代謝情況。Asif等[48]通過(guò)共沉淀法將碳納米管（CNT）與CuMn層狀雙氫氧化物（CuMn?LDH）進(jìn)行復(fù)合， 形成CNTs@CuMn?LDH雜化納米材料，用于H2S的直接測(cè)定。CuMn?LDH負(fù)載在CNT骨架上， 增加了界面之間的相互作用力，進(jìn)而提高電極表面的電子傳遞速率和氧化還原反應(yīng)過(guò)程。該傳感器展現(xiàn)出對(duì)H2S良好的催化氧化性能，檢出限低至0.3 nmol/L，并將其用于監(jiān)測(cè)人黑色素瘤細(xì)胞株在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激下H2S實(shí)時(shí)變化情況。Wang等[49]發(fā)現(xiàn)，在中性環(huán)境中（pH=7.4），Ru（NH3）3+6可在較低電位下催化氧化含有HS和H2S的混合物。利用該原理，與活體微透析技術(shù)連用，實(shí)現(xiàn)了腦微透析液中H2S的在線監(jiān)測(cè)（見圖5A）。相較于其它方法，該方法實(shí)現(xiàn)了活體在線檢測(cè)，且不需要調(diào)節(jié)樣品的酸堿性即可對(duì)H2S進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。此外，該課題組還設(shè)計(jì)合成了一種信號(hào)增強(qiáng)型釕銅配合物的電致化學(xué)發(fā)光（ECL）探針用于檢測(cè)鼠腦微透析液中的H2S含量[50]。釕銅配合物通過(guò)Nafion固定在玻碳電極表面，并將其置于密閉容器中與液態(tài)樣品揮發(fā)出的H2S發(fā)生反應(yīng)，配合物中的銅離子被競(jìng)爭(zhēng)出來(lái)，產(chǎn)生ECL信號(hào)，如圖5B所示。該方法首次將ECL技術(shù)用于鼠腦中H2S的檢測(cè)，并且有效地避免了腦內(nèi)抗壞血酸等還原性物質(zhì)對(duì)ECL信號(hào)的干擾。

2.4?基于化學(xué)發(fā)光探針技術(shù)的H2S檢測(cè)方法

化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的光發(fā)射的現(xiàn)象。發(fā)光探針吸收反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使探針?lè)肿踊蛑虚g態(tài)分子的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形態(tài)釋放出能量。Bailey等[51]首次開發(fā)了一種基于魯米諾的疊氮衍生物的化學(xué)發(fā)光探針用于檢測(cè)H2S，（圖6A），并將其用于監(jiān)測(cè)CSE酶促反應(yīng)過(guò)程中H2S濃度的變化。Ke等[52]合成了一種生物化學(xué)發(fā)光探針，以疊氮基團(tuán)與H2S互相作用為基礎(chǔ)，探針對(duì)H2S表現(xiàn)出明顯的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)的效果，具有較高的靈敏度和選擇性（圖6B）。該生物發(fā)光探針成功應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物成像，為了解各種生理和病理過(guò)程H2S的變化提供了新的策略。本課題組采用傳統(tǒng)的HRP催化魯米諾?H2O2化學(xué)發(fā)光體系構(gòu)建了H2S化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新方法[53]。由于H2S可抑制HRP的活性，降低催化魯米諾?H2O2的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，基于此實(shí)現(xiàn)H2S的定量檢測(cè)，并成功用于鼠腦微透析液中H2S濃度的測(cè)定。

3?總結(jié)與展望

發(fā)展H2S檢測(cè)方法對(duì)進(jìn)一步揭開其生理學(xué)、病理學(xué)和治療學(xué)等方面的功能具有重要意義。本文對(duì)多種類型的H2S活體檢測(cè)新方法進(jìn)行分析和總結(jié)，如可視化、熒光、電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光等，其在實(shí)際應(yīng)用中均展現(xiàn)出良好的潛力。然而， H2S檢測(cè)新方法也面臨著一些挑戰(zhàn)?？傊?，H2S檢測(cè)新方法研究需要在檢測(cè)的新原理構(gòu)建方面繼續(xù)深入，以滿足日益增長(zhǎng)的腦神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)研究和相關(guān)疾病的診斷與治療的需求。

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Research Progress of in Vivo Detection Methods

for Gasotransmitter Hydrogen Sulfide

CHEN Zhong?Hui1，2， CHEN Yu1， WENG Ai?Bin1， LUO Fang2， GUO Long?Hua2，

QIU Bin2， LIN Zhen?Yu*2， CHEN Guo?Nan2

1（The Affiliated Hospital of Putian University， Putian University， Putian 351100， China）

2（Ministry of Education Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety，

Department of Chemistry， Fuzhou University， Fuzhou 350116， China）

Abstract?The quantitative analysis for neurochemistry in living biosystems has drawn extensive attention， because the physiological active substance participates in the transmission of information and relates to physiology and pathology in the brain. Hydrogen sulfide （H2S）， as the third gasotransmitter， plays a significant role in the neurophysiology and neuropathology in brain. In vivo detection of H2S will greatly promote the molecular mechanism in the physiology and pathology process. However， H2S have strong reducibility and volatility， and its properties are similar to those of sulfhydryl compounds in the brain. Therefore， selective separation and recognition of H2S from sulfhydryl compounds in the brain is the key scientific issue in the detection of H2S. Herein， the design principle and research progress of various types of H2S detection methods in recent year were reviewed， and an outlook for the future of H2S detection method was propected.

Keywords?Hydrogen sulfide; In vivo detection methods; Review