李鈺瑩 崔孟超

摘?要?β?淀粉樣蛋白（β?Amyloid， Aβ）作為阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）的一個重要病理學(xué)特征，被認(rèn)為是實現(xiàn)AD早期診斷的重要靶點。近年來，熒光成像技術(shù)，尤其是近紅外熒光成像技術(shù)（Near?infrared imaging）得到了快速發(fā)展。由于其靈敏度高，操作簡便，能夠避免生物組織自發(fā)熒光干擾，已成為體外生物樣本分析和小動物活體成像的重要手段。因此，靶向于腦內(nèi)Aβ斑塊的近紅外熒光探針，對于AD的臨床前研究、組織病理學(xué)檢查、治療藥物的篩選和小動物模型的構(gòu)建具有重要的意義。本文主要對基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（Intramolecular charge transfer， ICT）機(jī)理的近紅外Aβ熒光探針進(jìn)行歸納和總結(jié)，分析分子結(jié)構(gòu)對于探針光學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的影響，為開發(fā)新型高靈敏度的近紅外Aβ熒光探針提供了思路。

關(guān)鍵詞?阿爾茨海默病; Aβ斑塊; 近紅外熒光成像; 分子探針; 評述

1?引 言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）作為一種嚴(yán)重威脅老年人健康的神經(jīng)退行性疾病受到了廣泛關(guān)注。然而，AD的致病機(jī)理仍不明確，發(fā)病過程緩慢且不易察覺，患者之間也存在較大的個體差異，使得目前臨床上很難在疾病可控期（即不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷出現(xiàn)之前）對AD進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和有效的治療[1]。

目前關(guān)于AD的致病機(jī)理主要存在以下假說：β?淀粉樣蛋白級聯(lián)假說[2]; Tau蛋白異常磷酸化假說[3]; 膽堿能假說[4， 5]; 氧化應(yīng)激假說[6]等。其中，β?淀粉樣蛋白級聯(lián)假說和Tau蛋白異常磷酸化假說得到了研究者的廣泛認(rèn)可。這兩種假說都認(rèn)為，在病理狀態(tài)下，大腦中的β?淀粉樣蛋白（β?Amyloid， Aβ）和Tau蛋白發(fā)生了錯誤的折疊，進(jìn)一步促進(jìn)了這兩種蛋白在腦內(nèi)的不斷積累，逐漸影響腦內(nèi)細(xì)胞（主要是神經(jīng)元細(xì)胞）的正常生理功能，最終導(dǎo)致大腦的功能性損傷，直至死亡。這兩種蛋白作為與AD高度相關(guān)的生物標(biāo)志物在2018年被納入了AD診斷的研究框架（A/T/N）[7]。該研究框架將AD認(rèn)定為一個連續(xù)發(fā)展的過程，利用3種生物標(biāo)記物的變化對AD進(jìn)行疾病分期或區(qū)分AD及非AD型癡呆：“A”指聚集的Aβ或相關(guān)的病理學(xué)狀態(tài); “T”指聚集的Tau蛋白或相關(guān)的病理學(xué)狀態(tài); “N”是神經(jīng)退行性變或神經(jīng)元損傷。這3種生物標(biāo)記物中，Aβ作為一種AD的特異性靶點，對實現(xiàn)AD的早期精確診斷至關(guān)重要。

1992年， Hardy和Higgins提出了Aβ級聯(lián)假說[2]，提出了AD的發(fā)病機(jī)理主要是腦內(nèi)Aβ多肽片段產(chǎn)生與清除的失衡導(dǎo)致其在腦內(nèi)不斷聚集最終產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)元損傷。正常情況下，大腦內(nèi)由神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生的淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein， APP）存在淀粉樣化水解和非淀粉樣化水解兩種途徑。非淀粉樣化水解主要是α分泌酶對APP進(jìn)行剪切，形成sAPPα、 p3和α?C多肽片段，而淀粉樣化水解是APP經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶的連續(xù)剪切，最終形成Aβ多肽片段[8]。經(jīng)過兩種水解途徑所產(chǎn)生的肽段主要通過酶降解或腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫吞噬的方法被清除，也可以通過血液被轉(zhuǎn)運(yùn)出血腦屏障（blood?brain barrier， BBB）。然而，當(dāng)這種產(chǎn)生與清除的平衡被打破，腦內(nèi)肽段數(shù)目激增，這其中具有神經(jīng)毒性的Aβ肽段在細(xì)胞外不斷聚集沉淀，從單體變?yōu)楣丫垠w最終生成Aβ斑塊，致使突觸功能障礙和神經(jīng)元細(xì)胞死亡（圖1A和1B）[9，10]。此外，Aβ斑塊又會刺激神經(jīng)元分泌更多的Aβ肽段，并且促進(jìn)Aβ肽段的聚集沉淀，這種級聯(lián)式的放大效果最終導(dǎo)致大腦發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的功能性損傷。

2017年，德國和荷蘭的科學(xué)家利用冷凍電鏡技術(shù)和固態(tài)核磁共振實驗對由兩條纖維原絲纏繞形成的Aβ1?42樣品進(jìn)行了分辨率為0.4 nm的結(jié)構(gòu)解析（圖1C～1F）[11]。多個Aβ蛋白分子有序的交錯排列形成了原纖維絲，兩條原纖維絲互相纏繞形成具有“LS”形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的Aβ纖維，多個Aβ纖維聚集最終形成Aβ斑塊。其中，Aβ肽鏈的C?端被包裹在纖維結(jié)構(gòu)的內(nèi)部使其無法接觸外界的溶劑環(huán)境，而N?端則幫助形成β?折疊結(jié)構(gòu)。

2?光學(xué)成像

光學(xué)成像作為分子影像的一個重要分支，具有非侵入性、損傷小、靈敏度高、價格低廉和成像快速等優(yōu)點，被廣泛用于細(xì)胞或分子水平的生物過程檢測。其中，近紅外熒光成像是應(yīng)用最廣的一種熒光成像方式。

2.1?近紅外光學(xué)成像

通常情況下，光在穿透生物組織時其信號會被組織吸收或散射，造成信號大幅衰減，而且生物體內(nèi)的自發(fā)熒光（波長通常小于600 nm）也會對信號的采集產(chǎn)生干擾。當(dāng)探針的發(fā)射波長位于近紅外區(qū)域（Near?infrared， NIR， 650?900 nm）時，可以有效減少組織對光的散射和吸收作用，而且較低的激發(fā)能量對生物組織的損傷小。近紅外熒光成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

2.2?熒光探針的傳感機(jī)理

熒光探針的傳感機(jī)理主要包括：分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（Intramolecular charge transfer， ICT）、聚集誘導(dǎo)發(fā)光（Aggregation?induced emission， AIE）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photo?induced electron transfer， PeT）和激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（Excited?state intramolecular proton transfer， ESIPT）等。

研究表明，Aβ纖維內(nèi)部形成的β?折疊空腔是一個疏水的非極性環(huán)境，而外部的生理環(huán)境則呈現(xiàn)出親水的極性狀態(tài)，當(dāng)熒光探針與Aβ纖維結(jié)合進(jìn)入疏水空腔后，探針周圍的微環(huán)境發(fā)生變化。其中，具有ICT效應(yīng)的分子在激發(fā)狀態(tài)時，分子內(nèi)部的電子云從電子給體（Electron donor， D）部分轉(zhuǎn)移至電子受體（Electron acceptor， A）部分，分子內(nèi)部的偶極矩發(fā)生改變，使得其光學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化。因此，具有ICT效應(yīng)的分子探針對環(huán)境極性高度敏感，探針與Aβ蛋白結(jié)合后，在激發(fā)光的作用下，熒光發(fā)射波長和量子產(chǎn)率等光學(xué)性質(zhì)發(fā)生明顯改變，達(dá)到熒光響應(yīng)“開關(guān)”的效果，這對實現(xiàn)高靈敏度和高分辨率的成像非常有利。

2.3?基于ICT效應(yīng)的熒光探針的設(shè)計思路

根據(jù)ICT效應(yīng)的熒光發(fā)光機(jī)理，通?？赏ㄟ^增加共軛體系的電子傳輸能力、增強(qiáng)電子給體或電子受體的推拉電子能力來增強(qiáng)ICT效應(yīng)，減小HOMO?LUMO之間的能隙差，推動熒光發(fā)射波長紅移進(jìn)入近紅外區(qū)域。此外，平面剛性結(jié)構(gòu)除了有利于電子的傳輸，對Aβ的親和力也有明顯的提高。值得注意的是，較大的π?共軛體系可能導(dǎo)致分子脂溶性較高，致使體內(nèi)藥代動力學(xué)性質(zhì)變差，不適用于活體成像。此外，作為神經(jīng)中樞類的探針，能否穿過BBB是影響探針應(yīng)用的首要條件，這主要是由分子大小和脂溶性協(xié)調(diào)作用的。

3?近紅外Aβ斑塊分子探針的研究進(jìn)展

3.1?D?π?A類分子探針

2005年，Hintersteiner等[12]報道了第一個用于腦內(nèi)Aβ斑塊近紅外熒光成像的分子探針AOI?987。該探針在小鼠血清中的最大熒光發(fā)射波長為670 nm，血清中熒光量子產(chǎn)率為0.41，滿足熒光成像的要求。盡管體外的飽和結(jié)合實驗表明AOI?987對Aβ聚集體具有中等水平的親和力（Kd=220 nmol/L），Stokes位移較?。?0 nm）且分子中帶有正電荷，但是活體熒光成像結(jié)果顯示，AOI?987能夠穿過BBB并有效區(qū)分AD轉(zhuǎn)基因小鼠和正常對照小鼠（圖2A）。另外，體內(nèi)熒光染色結(jié)果也再次證實， AOI?987可以穿過BBB并與腦內(nèi)的Aβ斑塊特異性結(jié)合。

同年，Nesterov等[13]報道了基于D?π?A結(jié)構(gòu)的熒光探針NIAD?4用于腦內(nèi)Aβ斑塊的雙光子顯微成像（Two?photon microscopy， TPM）。相比AOI?987，NIAD?4具有典型的推拉電子結(jié)構(gòu)，而且選擇可旋轉(zhuǎn)的聯(lián)二噻吩作為π電子傳輸體系使得探針在不同極性的溶劑中表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)?共平面性。因此，當(dāng)NIAD?4與Aβ聚集體內(nèi)的疏水空腔結(jié)合后，分子內(nèi)聯(lián)二噻吩的旋轉(zhuǎn)受阻，形成了一個更利于電子傳輸?shù)墓财矫娼Y(jié)構(gòu)，熒光強(qiáng)度提高了400倍。這種共平面結(jié)構(gòu)還有助于提高探針對Aβ蛋白的親和力（Ki=10 nmol/L）。TPM成像結(jié)果顯示，NIAD?4能夠清晰標(biāo)記出腦實質(zhì)中和血管壁上的Aβ斑塊（圖2B、2C）。然而，較短的發(fā)射波長（約為600 nm）并不利于活體熒光成像。為了改善光學(xué)性質(zhì)，他們對電子給體進(jìn)行了修飾，得到發(fā)射波長大于650 nm的近紅外熒光探針NIAD?11和NIAD?16[14]。

為了進(jìn)一步提升探針的光學(xué)性質(zhì)，同時改善生物學(xué)性質(zhì)，提高活體成像的應(yīng)用價值。自2014年起，研究者利用小分子探針與Aβ斑塊保持高親和力須具有剛性共軛結(jié)構(gòu)的特點，在共軛雙鍵的兩端分別引入電子給體和電子受體，報道了一系列具有D?π?A結(jié)構(gòu)的近紅外熒光探針，以整體分子識別Aβ斑塊（圖3）[15～17]。 這類探針結(jié)構(gòu)簡單，合成與純化非常簡便，可以通過調(diào)節(jié)共軛雙鍵長度來調(diào)節(jié)發(fā)射波長，使其處于近紅外波長范圍內(nèi)，同時滿足與Aβ斑塊的高親和力，與其它已報道的近紅外熒光分子探針相比具有明顯的優(yōu)勢。

2014年，Cui等[15]報道了D?π?A類的近紅外熒光探針DANIR 2c，與之前報道的探針相比，DANIR 2c具有最小的分子量和適宜的脂溶性，可有效穿過BBB，利于活體成像。該探針以苯環(huán)及反式多烯鍵作為π?橋連接了N，N'?二甲氨基（D）和二氰亞甲基（A），可通過調(diào)控多烯鍵長度來調(diào)節(jié)探針光學(xué)及生物性質(zhì)。DANIR 2c具有典型的ICT效應(yīng)，即探針在PBS溶液中熒光強(qiáng)度較弱，而與Aβ蛋白聚集體結(jié)合后進(jìn)入疏水空腔內(nèi)，周圍微環(huán)境極性的改變使探針的熒光強(qiáng)度增大。同時，這種剛性的平面結(jié)構(gòu)對探針和Aβ蛋白的相互作用非常有利。體外競爭結(jié)合實驗表明，DANIR 2c對Aβ聚集體具有較高的親和力（Ki=36.9 nmol/L）。近紅外熒光成像結(jié)果顯示，DANIR 2c能夠快速穿透BBB，在轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生明顯的熒光信號滯留（圖4A和4B）。體內(nèi)熒光染色的結(jié)果也進(jìn)一步證實，腦內(nèi)熒光信號的滯留主要是被DANIR 2c特異性標(biāo)記出的Aβ斑塊所造成的。但DANIR 2c自身的熒光量子產(chǎn)率較低，需要進(jìn)一步的修飾與優(yōu)化。

為了進(jìn)一步提高探針和Aβ蛋白結(jié)合后的熒光發(fā)射波長，得到更優(yōu)的成像對比度和分辨率。2014年，F(xiàn)u等[16]在DANIR 2c的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，分別嘗試了丙二酸二甲酯、氰基乙酸甲酯、米氏酸和達(dá)米酮作為電子受體，設(shè)計合成了12個具有不同長度反式多烯鍵的近紅外Aβ熒光探針。實驗結(jié)果表明，相比DANIR 2c，部分探針的發(fā)射波長紅移進(jìn)入近紅外區(qū)，并且具有明顯的ICT效應(yīng)，然而探針的熒光量子產(chǎn)率仍然較低。有趣的是，親和力實驗結(jié)果顯示具有平面結(jié)構(gòu)的電子受體（丙二酸甲酯和氰基乙酸甲酯）更有利于探針和Aβ蛋白的結(jié)合，分子對接模擬實驗也證實了這一點。其中，以氰基乙酸甲酯為電子受體的探針MCAAD?3的親和力最高（Ki=106 nmol/L），結(jié)合Aβ蛋白后熒光增強(qiáng)達(dá)到了26倍?；铙w熒光成像和體內(nèi)熒光染色結(jié)果顯示，MCAAD?3可以穿透BBB并標(biāo)記出腦內(nèi)的Aβ斑塊，實現(xiàn)AD轉(zhuǎn)基因小鼠和正常對照小鼠的區(qū)分（圖4C和4D）。然而相比DANIR 2c，較低的親和力和熒光量子產(chǎn)率仍然限制了這類D?π?A探針的進(jìn)一步應(yīng)用。

基于以上研究，2015年，Zhou等[17]在DANIR 2c的基礎(chǔ)上引入了吸電子能力更強(qiáng)同時具有平面剛性結(jié)構(gòu)的巴比妥酸衍生物作為電子受體，報道了BBTOs （巴比妥酸）、BBTSs （硫代巴比妥酸）和BBTOMs （二甲基巴比妥酸）3個系列的近紅外Aβ熒光探針。該系列探針的熒光發(fā)射波長和量子產(chǎn)率都得到了有效的提升，同時分子良好的平面性也大大提高了探針與Aβ蛋白的親和力，其中BBTOM?3的親和力最高（Ki=13.7 nmol/L）。然而，巴比妥酸的引入不僅增大了探針分子量，而且增加了形成潛在氫鍵的原子個數(shù)，導(dǎo)致探針的初始腦攝取值僅為0.83% ID/g，限制了在活體成像方面的應(yīng)用（圖4E和4F）。

除了電子受體的改變可以影響分子探針的光學(xué)性質(zhì)，減小HUMO?LUMO能量間隙也能影響分子的ICT效應(yīng)，進(jìn)而推動分子的熒光發(fā)射波長紅移。例如，共軛雙鍵長度的增加可以在一定程度上影響分子內(nèi)部的極化程度，進(jìn)而減小HUMO?LUMO的能隙，致使探針的發(fā)射波長紅移。2017年，Zhou等[18]又對苯環(huán)及反式多烯鍵的π?橋進(jìn)行修飾，系統(tǒng)地探究了不同共軛雙鍵長度（n=2～6）以及不同芳環(huán)（苯、吡啶和嘧啶）對光學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的影響。實驗結(jié)果表明，當(dāng)芳環(huán)類型相同時，隨著共軛雙鍵的增長，紫外吸收波長和熒光最大發(fā)射波長的紅移呈現(xiàn)先增加后飽和的趨勢，而熒光量子產(chǎn)率和對Aβ蛋白的親和力以及初始腦攝取值則呈現(xiàn)出先增后減的趨勢; 當(dāng)雙鍵數(shù)目相同時，芳環(huán)上N原子數(shù)目越多，其光學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)越差。最終篩選出具有苯環(huán)和4個共軛雙鍵的探針PHC?4，相比DANIR 2c熒光發(fā)射波長紅移了80 nm，活性提高了2.6倍?；铙w成像的結(jié)果表明，它能夠有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因小鼠和正常對照組，體內(nèi)熒光染色實驗也證實了這一點（圖5）。

上面介紹的探針都是以六元芳環(huán)和反式多烯鍵作為π?橋，其熒光量子產(chǎn)率普遍較低。為了進(jìn)一步提高探針量子產(chǎn)率，得到更好的靶/非靶比圖像，F(xiàn)u等 [19]在2015年設(shè)計了一系列以萘環(huán)為共軛體系的D?π?A類探針DANIR 3a?e。具有更大共軛平面萘環(huán)的引入使探針的光學(xué)性質(zhì)得到了提升，也進(jìn)一步增強(qiáng)了探針對Aβ聚集體的親和力。實驗結(jié)果表明，DANIR 3b在二氯甲烷溶液中熒光量子產(chǎn)率達(dá)到了30%，與Aβ蛋白結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加710倍，相比DANIR 2c具有更好的熒光“開關(guān)（turn?on）”效果。體外熒光染色結(jié)果顯示，DANIR 3b可以快速且清晰的標(biāo)記出人腦組織中的各種Aβ斑塊形態(tài)（血管斑，彌散斑和致密斑），而且飽和結(jié)合實驗測定的親和力常數(shù)（Kd=8.8 nmol/L）也遠(yuǎn)高于DANIR 2c。此外，DANIR 3b還表現(xiàn)出了優(yōu)異的生物性質(zhì)，其在正常小鼠腦部的2 min腦攝取值達(dá)到12.8% ID/g且腦內(nèi)清除速率為

21.3倍（brain2 min/brain60 min）（圖6A）。然而，DANIR 3b和Aβ結(jié)合后熒光發(fā)射波長藍(lán)移至615 nm，不適于近紅外活體成像，但可作為高度靈敏的體外熒光染料應(yīng)用。當(dāng)共軛雙鍵數(shù)目增加至3個時，雖然發(fā)射波長紅移至近紅外區(qū)域且與Aβ聚集體有極高的親和力（Kd=1.9 nmol/L），但DANIR 3c的脂溶性較高，初始腦攝取值低，清除速率緩慢，也不利于活體熒光成像。

為了改善探針的藥代動力學(xué)性質(zhì)，在不改變光學(xué)性質(zhì)的前提下降低脂溶性，F(xiàn)u等[20]進(jìn)一步在電子給體的末端引入了不同數(shù)量的羥基，設(shè)計合成了化合物DANIR 8a?c和DANIR 9a?c。這些探針在保持對Aβ聚集體高親和力的同時，由于羥基的引入使得脂溶性降低，使其體內(nèi)的生物學(xué)性質(zhì)得到了有效改善。其中，DANIR 8c是目前報道的探針中最適合于活體近紅外熒光成像的Aβ探針，與Aβ聚集體結(jié)合后熒光發(fā)射波長為678 nm，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)629倍，同時能快速穿過BBB （brain2 min=11.42% ID/g）。此外，由于DANIR 8c分子小，脂溶性適宜且與Aβ斑塊具有高親和力和選擇性，能夠在活體水平快速檢測Aβ斑塊，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)耗時的免疫熒光染色或選擇性較差、無法穿過BBB且發(fā)射波長較短的商品化染料（如剛果紅，硫磺素S等），目前DANIR 8c已經(jīng)應(yīng)用于體外組織切片Aβ斑塊對照染色和AD轉(zhuǎn)基因小鼠全腦Aβ斑塊三維標(biāo)記，可與Aβ蛋白特異性抗體媲美[21，22]。值得注意的是，相比DANIR 8c，具有兩個羥基的DANIR 9c的初始腦攝取值很低（圖6B），不能滿足活體腦部成像的要求。因此，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)熒光探針的開發(fā)，脂溶性和腦攝取值以及藥代動力學(xué)性質(zhì)之間并不是簡單的線性關(guān)系，它們之間存在一個巧妙的平衡點。

在DANIR 8c的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，F(xiàn)u等[23]又將F原子引入到探針的給電子結(jié)構(gòu)中，嘗試探究近紅外和切倫科夫雙模態(tài)成像在活體Aβ斑塊顯像中的應(yīng)用前景。在活體近紅外成像實驗中，F(xiàn)DANIR 4c可以明顯區(qū)分轉(zhuǎn)基因小鼠和正常對照小鼠（圖6D和6E）。體外放射性自顯影的結(jié)果顯示[18F]FDANIR 4c可以特異性地標(biāo)記出轉(zhuǎn)基因小鼠和AD病人腦切片上的Aβ斑塊。然而，由于18F核素的切倫科夫信號較弱且集中于藍(lán)綠光區(qū)域，嚴(yán)重影響了組織穿透能力和信號采集，因此，基于切倫科夫光的活體成像無法完全區(qū)分轉(zhuǎn)基因小鼠和對照組。

上述研究發(fā)現(xiàn)，靶向于Aβ的近紅外熒光探針為了優(yōu)化光學(xué)性質(zhì)、提升親和力，都使探針形成了一個較大的剛性共軛結(jié)構(gòu)。然而， 這種大的疏水共軛體系會造成探針脂溶性偏高，影響探針在活體內(nèi)的性質(zhì)。為了詳細(xì)探究分子脂溶性和剛性骨架結(jié)構(gòu)對其光學(xué)和生物性質(zhì)的影響，Zhou等[24]在DANIR 3b的基礎(chǔ)上對電子受體部分進(jìn)行修飾，通過形成羧酸酯引入末端具有羥基和甲氧基的不同長度寡聚乙二醇鏈（Polyethylene glycol， PEG），制備了一系列新型的近紅外Aβ熒光探針。研究發(fā)現(xiàn)柔性PEG鏈的引入并不會對探針的光學(xué)性質(zhì)和對Aβ蛋白的親和力造成太大的影響，卻實現(xiàn)了對探針脂溶性的快速調(diào)節(jié)，有效改善了分子的藥代動力學(xué)性質(zhì)。其中，探針6d具有4個共軛雙鍵，含有2個PEG鏈且末端為羥基，其在正常小鼠腦內(nèi)的藥代動力學(xué)性質(zhì) （brain2 min=11.42% ID/g，brain2 min/brain60 min=10.1）相比其它具有相同共軛雙鍵數(shù)目的萘環(huán)衍生物得到了顯著改善; 而光學(xué)性質(zhì)和對Aβ聚集體的親和性仍主要由共軛體系部分決定。同時，活體熒光成像實驗再次證明探針6d可以有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因小鼠和正常對照組，是一個理想的近紅外Aβ熒光探針（圖6C）。

除了Aβ蛋白，腦內(nèi)由Tau蛋白構(gòu)成的神經(jīng)纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles， NFTs）也是AD重要的生物標(biāo)志物，在病理狀態(tài)下這兩種蛋白共享一個類似的β?折疊結(jié)構(gòu)。目前已報道的ICT類分子探針，都是基于結(jié)合到β?折疊形成的疏水腔中使探針的微環(huán)境發(fā)生變化，進(jìn)而產(chǎn)生熒光“開關(guān)”效果來實現(xiàn)蛋白檢測的，這也使得探針特異性不高， 提高探針對兩種蛋白的特異性和選擇性是設(shè)計的關(guān)鍵。大量研究表明，兩種蛋白β?折疊內(nèi)部氨基酸殘基的排列及折疊方式并不完全相同，使得內(nèi)部微環(huán)境存在一定的差異。因此，利用ICT類分子對周圍溶劑環(huán)境的高度敏感性，有可能實現(xiàn)針對不同蛋白有差異的熒光響應(yīng)，從而利用多光譜成像技術(shù)實現(xiàn)同一探針對不同蛋白的分別檢測。2019年，Zhou等[25]采用對NFTs有一定熒光信號響應(yīng)的喹喔啉環(huán)替換原本的萘環(huán)， 實現(xiàn)了對Aβ斑塊和NFTs的光譜分離檢測。喹喔啉環(huán)的引入不僅使探針可以高親和力的結(jié)合Aβ和Tau蛋白，同時也優(yōu)化了探針的光學(xué)性質(zhì)、降低了分子的脂溶性。他們根據(jù)Ooshika?Lippert?Mataga方程計算發(fā)現(xiàn)，周圍環(huán)境介電常數(shù)（ε0）不同時， 探針具有不同的熒光響應(yīng)波長。通過實驗數(shù)據(jù)對方程進(jìn)行簡化，最終計算發(fā)現(xiàn)Aβ斑塊和NFTs內(nèi)部的介電常數(shù)存在顯著差異，因此當(dāng)探針與它們結(jié)合后產(chǎn)生的熒光響應(yīng)波長不同，從而實現(xiàn)對它們的光譜分離檢測。并且對于Tau蛋白來說，肝素鈉誘導(dǎo)聚合的Tau蛋白（K18，大腸桿菌表達(dá)），AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Tau蛋白和AD病人腦內(nèi)Tau蛋白這3種來源內(nèi)部的介電常數(shù)也不同，這也再次證實了Tau蛋白的復(fù)雜性， 且在體外難以實現(xiàn)模擬和重現(xiàn)。其中，探針17分別在人工聚合蛋白水平和組織切片水平上實現(xiàn)了對兩種靶點的光譜分離檢測（圖7A～7C）。此外，活體近紅外熒光成像表明探針17能夠穿過BBB并實現(xiàn)對AD轉(zhuǎn)基因小鼠和正常對照組的區(qū)分（圖7D和7E）。

3.2?D?π?A?π?D類分子探針

和D?π?A類分子探針相比，D?π?A?π?D形成的共平面結(jié)構(gòu)更有利于電子的傳輸，光學(xué)性質(zhì)更優(yōu)。此外，這種更大的剛性平面結(jié)構(gòu)，對提高探針與β?折疊的親和力有顯著的作用（圖9）。

2009年，Ran等[26]報道了可作為近紅外熒光Aβ探針姜黃素類衍生物CRANAD?2。該探針利用姜黃素中的β?二酮結(jié)構(gòu)與二氟化硼形成電子受體，通過苯乙烯π橋?qū)ΨQ連接N，N'?二甲氨基構(gòu)成電子給體，形成D?π?A?π?D結(jié)構(gòu)。CRANAD?2在PBS溶液中的發(fā)射波長達(dá)到了805 nm，而且具有較高的熒光量子產(chǎn)率和較大的Stokes位移。CRANAD?2對Aβ聚集體有明顯的熒光響應(yīng)效果，和Aβ聚集體結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加70倍，發(fā)射波長藍(lán)移至715 nm。體外和體內(nèi)的生物評價均表明，CRANAD?2對Aβ斑塊有很高的親和力，且能夠穿過BBB特異性地標(biāo)記出轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊。隨后，該課題組對這類探針的電子給體部分進(jìn)行了廣泛修飾，報道了一系列姜黃素類近紅外熒光Aβ探針[27～29]。其中，通過對探針與蛋白的結(jié)合模式進(jìn)行模擬計算和實驗驗證，篩選得到的CRANAD?3[30]和CRANAD?58[31]不僅可以識別不溶性的Aβ聚集體，也對可溶性的Aβ寡聚體（包括單體）產(chǎn)生了明顯的熒光響應(yīng)（圖8C～E）。定量的親和力測定結(jié)果表明，這兩個探針都對可溶性的Aβ蛋白具有較高的親和力（Kd<50 nmol/L），這對AD早期病理學(xué)研究和抗Aβ治療藥物的篩選有重要的指導(dǎo)意義。但是，該系列探針由于脂溶性較高導(dǎo)致藥代動力學(xué)性質(zhì)不夠理想，腦內(nèi)清除速率緩慢，在活體成像中難以獲得良好的靶與非靶比。此外，CRANAD?3和CRANAD?58還無法對不同形態(tài)的Aβ聚集體進(jìn)行區(qū)分，仍需要進(jìn)一步的修飾與優(yōu)化。

此外，Zhang等[31]還利用二價銅離子可以與Aβ肽鏈上兩個咪唑類的組氨酸位點配位， 誘導(dǎo)肽鏈之間纏繞聚集形成Aβ纖維這一理論基礎(chǔ)，在姜黃素類衍生物的電子給體上引入兩個咪唑環(huán)， 設(shè)計合成了CRANAD?17。借助姜黃素類衍生物對Aβ的良好靶向性，使探針可以通過與Cu2+配位，特異性的阻止其參與誘導(dǎo)Aβ蛋白聚集的過程。初步的體外生物評價證實，CRANAD?17可以快速“鎖定”Aβ纖維的位置，然后通過競爭的方式將與Cu2+配位的Aβ肽鏈釋放出來，進(jìn)而有效的阻止Aβ聚集體的形成。

在CRANADs的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，Zhu等[32]用吡喃腈作為電子受體，報道了系列具有D?π?A?π?D結(jié)構(gòu)的熒光探針，但PAD?5和PAD?6對Aβ纖維的親和力較差（Kd>104 nmol/L），無法進(jìn)行活體熒光成像。2017年，Yang等[33]將羥基引入到電子給體上，合成了探針YHY?2，從活體成像結(jié)果表明，YHY?2可以快速穿過BBB，相比正常對照小鼠，在轉(zhuǎn)基因小鼠腦中有一定時間的滯留。盡管探針的親和力得到了明顯提升（Kd=23.5 nmol/L），然而，發(fā)射波長（640 nm）未達(dá)到近紅外區(qū)，仍是限制活體成像的關(guān)鍵。

為了優(yōu)化分子的光學(xué)性質(zhì)和對Aβ纖維的親和力，Li等[34]將氰基?2?丁烯作為電子受體設(shè)計合成了一系列具有對稱D?π?A?π?D類結(jié)構(gòu)的近紅外熒光探針DADNIRs。該系列探針合成與純化十分簡單，可以快速實現(xiàn)反式共軛雙鍵的延長，有效推動探針發(fā)射波長的紅移。同時這種良好的剛性共平面結(jié)構(gòu)保證了它們對Aβ良好的親和性。其中，DADNIR?2的光學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)最優(yōu)，與Aβ聚集體的親和力達(dá)到了1.04 nmol/L。體外熒光染色結(jié)果表明，探針可以清晰的標(biāo)記出轉(zhuǎn)基因小鼠和AD人腦切片上的Aβ斑塊。此外，體內(nèi)熒光染色結(jié)果表明DADNIR?2可以快速穿過BBB并特異性的標(biāo)記出轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊。值得注意的是，該系列探針利用D?π?A?π?D結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢可將分子的骨架長度快速調(diào)節(jié)在1.5～1.9 nm，實現(xiàn)了對NFTs的選擇性檢測（2.5倍）。

4?總結(jié)與展望

Aβ斑塊作為AD的特異性生物標(biāo)記物，聯(lián)合A/T/N診斷研究框架，是實現(xiàn)臨床精確診斷的重點，同時也是AD治療藥物的一個主要靶點和藥效評價標(biāo)準(zhǔn)。因此，開發(fā)靶向于腦內(nèi)Aβ斑塊的熒光分子探針并探究其結(jié)合模式具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。此外，大量的研究結(jié)果表明，處于疾病進(jìn)程早期的Aβ寡聚體（Oligomer）具有更高的神經(jīng)毒性，因此靶向于Aβ?oligomer的熒光探針的研發(fā)對AD的早期診斷和探究其病理學(xué)機(jī)制具有更重要的意義。

目前，靶向于Aβ的近紅外探針大部分都是基于ICT的發(fā)光機(jī)理，自身的發(fā)射光背景信號高，使得圖片的對比度不高。因此，開發(fā)基于其它發(fā)光機(jī)理的探針，例如PeT效應(yīng)、AIE效應(yīng)、FRET效應(yīng)等，有可能避免探針自身熒光信號的干擾，獲得對比度和分辨率都更好的圖像。

生物組織穿透能力差和空間分辨率不足也是熒光成像面臨的重要問題，開發(fā)可用于多光子成像或具有更長發(fā)射波長的探針是克服這類問題的關(guān)鍵。多光子成像技術(shù)采用紅外或近紅外光作為激發(fā)光源，在避免紫外光對生物樣品損傷的同時提高了穿透深度，更有利于獲取深層次生物組織的圖像。此外，熒光信號采集效率高，得到的圖片對比度會明顯優(yōu)于單光子成像結(jié)果，并且可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析。近年來，多光子成像技術(shù)，尤其是雙光子成像技術(shù)廣被泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中。然而，雙光子成像發(fā)射光波長較短，生物組織穿透能力較差，并不適用于活體動物模型。

具有更長發(fā)射波長的近紅外二區(qū)熒光探針的開發(fā)有助于克服生物組織穿透力弱這一問題。近紅外二區(qū)探針的發(fā)射波長普遍在1000～1700 nm，其穿透深度相比于近紅外一區(qū)探針提高了50倍，達(dá)到了3 mm。 此外，它的激發(fā)光也多在800 nm以上，對深層生物組織的成像具有無法比擬的優(yōu)勢。因此，近紅外二區(qū)的Aβ熒光探針的開發(fā)對小動物模型的無損傷深度檢測具有重要價值。

值得注意的是，研發(fā)探針，都需要綜合衡量光學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)，找到合適的平衡點。而對于靶向中樞神經(jīng)類系統(tǒng)的熒光探針，除了考慮分子結(jié)構(gòu)對親和力和藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響，還要特別注意分子大小、脂溶性等因素對于穿透BBB和細(xì)胞膜的影響。

References

1?Boyle P A， Wilson R S， Yu L， Barr A M， Honer W G， Schneider J A， Bennett D A. Ann. Neurol.， 2013， 74（3）： 478-489

2?Hardy J A， Higgins G A. Science， ?1992， ?256（5054）： 184-185

3?Lace G L， Wharton S B， Ince P G. Clin. Neuropathol.， ?2007， ?26（2）： 43-58

4?Olney J W， Wozniak D F， Farber N B. JAMA Neurol.， ?1997， ?54（10）： 1234-1240

5?Blockland A. Brain Res.， ?1996， ?21： 285-300

6?Zimmer E R， Leuzy A， Benedet A L， Breitner J， Gauthier S， Rosa?Neto P. J. Neuroinflamm.， ?2014， ?11（1）： 120

7?Silverberg N， Elliott C， Ryan L， Masliah E， Hodes R. Alzheimer's Dementia， ?2018， ?14（4）： 576-578

8?O'Brien R J， Wong P C. Annu. Rev. Neurosci.， ?2011， ?34（1）： 185-204

9?Gtz J， Ittner L M. Nat. Rev. Neurosci.， ?2008， ?9： 532

10?Kikuchi K， Kidana K， Tatebe T， Tomita T. J. Cell. Biochem.， ?2017， ?118（12）： 4183-4190

11?Gremer L， Schlzel D， Schenk C， Reinartz E， Labahn J， Ravelli R B G， Tusche M， Lopez?Iglesias C， Hoyer W， Heise H.Science， ?2017， ?358（6359）： 116-119

12?Hintersteiner M， Enz A， Frey P， Jaton A L， Kinzy W， Kneuer R， Neumann U， Rudin M， Staufenbiel M， Stoeckli M， Wiederhold K H， Gremlich H U. Nat. Biotechnol.， ?2005， ?23（5）： 577-583

13?Nesterov E E， Skoch J， Hyman B T， Klunk W E， Bacskai B J， Swager T M. Angew. Chem.， ?2005， ?117（34）： 5588-5592

14?Raymond S B， Skoch J， Hills I D， Nesterov E E， Swager T M， Bacskai B J. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging， ?2008， ?35（1）： 93-98

15?Cui M C， Ono M， Watanabe H， Kimura H， Liu B L， Saji H. J. Am. Chem. Soc.， ?2014， ?136（9）： 3388-3394

16?Fu H L， Cui M C， Tu P Y， Pan Z W， Liu B L. Chem. Commun.， ?2014， ?50（80）： 11875-11878

17?Zhou K X， Fu H L， Feng L， Cui M C， Dai J P， Liu B L. Chem. Commun.， ?2015， ?51（58）： 11665-11668

18?Zhou K X， Bai H C， Feng L， Dai J P， Cui M C. Anal. Chem.， ?2017， ?89（17）： 9432-9437

19?Fu H L， Cui M C， Liu Z， Tu P Y， Zhou K X， Dai J P， Liu B L. J. Med. Chem.， ?2015， ?58（17）： 6972-6983

20?Fu H L， Tu PY， Liu Z， Dai J P， Liu B L， Cui M C. Anal. Chem.， ?2016， ?88（3）： 1944-1950

21?Wang Y L， Fan C， Xin B， Zhang J P， Luo T， Chen Z Q， Zhou Q Y， Yu Q， Li X N， Huang Z L， Li C， Zhu M Q， Tang B Z. Mater. Chem. Front.， ?2018， ?2（8）： 1554-1562

22?LONG Ben， LI Xiang?Ning， ZHANG Jian?Ping， CHEN Si?Qi， LI Wen?Wei， ZHONG Qiu?Yuan， LI An?An， GONG Hui， LUO Qing?Ming. Scientia Sinica（Vitae）， ?2019， ?49（2）： 46-56

龍 犇， 李向?qū)帲?張建平， 陳思琦， 李文偉， 鐘秋園， 李安安， 龔 輝， 駱清銘. 中國科學(xué)： 生命科學(xué)， 2019， ?49（2）： 46-56

23?Fu H L， Peng C， Liang Z G， Dai J P， Liu B L， Cui M C. Chem. Commun.， ?2016， ?52（86）： 12745-12748

24?Zhou K X， Li Y Y， Peng Y， Cui X M， Dai J P， Cui M C. Anal. Chem.， ?2018， ?90（14）： 8576-8582

25?Zhou K X， Yuan C， Dai B， Wang K， Chen Y M， Ma D L， Dai J P， Liang Y， Tan H W， Cui M C. J. Med. Chem.， ?2019， ?62（14）： 6694-6704

26?Ran C Z， Xu X Y， Raymond S B， Ferrara B J， Neal K， Bacskai B J， Medarova Z， Moore A. J. Am. Chem. Soc.， ?2009， 131（42）： 15257-15261

27?Ran C Z， Moore A. Mol. Imaging Biol.， ?2012， 14（3）： 293-300

28?Zhang X L， Tian Y L， Yuan P， Li Y Y， Yaseen M.A， Grutzendler J， Moore A， Ran C Z. Chem. Commun.， ?2014， ?50（78）：11550-11553

29?Yang J， Cheng R， Fu H L， Yang J， Kumar M， Lu J， Xu Y G， Liang S H， Cui M C， Ran C Z. Chem. Commun.， ?2019， ?55（25）： 3630-3633

30?Zhang X L， Tian Y L， Zhang G， Tian X Y， Ross A W， Moir R D， Sun H B， Tanzi R E， Moore A， Ran C Z. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2015， ?112（31）： 9734-9739

31?Zhang X L， Tian Y L， Li Z， Tian X Y， Sun H， Liu H， Moore A， Ran C Z. J. Am. Chem. Soc.， ?2013， ?135（44）： 16397-16409

32?Zhu B Y， Cheng y ， Li G B， Yang S Y， Zhang Z R. Bioorgan. Med. Chem.， ?2016， ?24（4）： 827-834

33?Yang H Y， Zhang J J， Zang Y， Zhang H Y， Li J， Chen G R， He X P. Dyes Pigments， ?2017， ?136： 224-228

34?Li Y Y， Wang K， Zhou K X， Guo W T， Dai B， Liang Y， Dai J P， Cui M C. Chem. Commun.， ?2018， ?54（63）： 8717-8720

Progress of Near?Infrared Fluorescent Probes

for β?Amyloid Plaques in the Brain

LI Yu?Ying， CUI Meng?Chao*

（Key Laboratory of Radiopharmaceuticals， Ministry of Education， College of Chemistry，

Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

Abstract?β?Amyloid （Aβ） plaques as one of the important pathological hallmarks of Alzheimer's disease （AD） are regarded as key target for diagnosis of AD in early stage. In recent years， near?infrared fluorescence （NIRF） imaging has been developed rapidly， and has become a remarkable， noninvasive and inexpensive optical imaging tool for in vitro biological analysis， in vivo diagnosis and drug screening in animal models. In this review， we summarize current NIRF Aβ probes with sensing mechanism based on the intramolecular charge transfer （ICT） and outlined the influence of chemical structures on optical and biological properties， which is important for further development of high?sensitivity NIRF Aβ probes.

Keywords?Alzheimer's disease; β?Amyloid plaques; Near?infrared fluorescence imaging; Probes; Review