陳緒美，尹志勇，鄭玉琳，檀 軍，田 瑩，郭建軍

(貴州大學 昆蟲研究所 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

傳統(tǒng)中藥九香蟲AspongopuschinensisDallas，1851是昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae昆蟲，在貴州、云南、四川、廣西、廣東、臺灣、安徽等地均有該蟲分布[1]。九香蟲最早記載于《本草綱目》：“九香蟲產(chǎn)于貴州永寧赤水河中……主治膈脘滯氣，脾腎虧損，壯元陽”[2]，因其具有理氣止痛、溫中助陽等功能而備受人們的重視[3]?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究表明，九香蟲具有良好的抗癌功效，其可用于治療食管癌和胃癌等，對乳腺癌、子宮頸癌、喉癌也有一定的療效[4-6]。

九香蟲含豐富的抗癌、抗菌、抗凝血等活性成分[3]，從九香蟲中提取高質(zhì)量RNA是對其藥用活性物質(zhì)相關基因進行深層次研究的重要基礎。然而，九香蟲屬節(jié)肢動物，體壁及腹腔中富含大量的幾丁質(zhì)、脂類、蛋白等物質(zhì)[7]，其對總RNA的提取質(zhì)量影響較大，進而影響相關功能基因的克隆及表達分析，故篩選高效的總RNA提取方法將有利于九香蟲的深層次開發(fā)利用。

目前，分離提取總RNA的方法較多，如胍/熱酚法[8]、氯化胍法[9]、異硫氰酸胍法[10]、TRIzol法、CTAB 法、SOS-Phenol 法、酶解法等[11]，各生物公司也研發(fā)出多種RNA分離提取的試劑盒。但很多RNA提取方法常存在干擾RNA完整性、純度及濃度的各類酶和色素等物質(zhì)，直接或間接地影響RNA的提取質(zhì)量[12]。本研究采用3種RNA分離提取方法：TRIzol法、RNAeasy動物RNA抽提試劑盒法、HP Total RNA Kit試劑盒法進行九香蟲總RNA的提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測所提取的九香蟲總RNA的完整性、濃度、純度，并對其結果進行分析比較，以期篩選到一種能夠獲得高質(zhì)量九香蟲RNA的提取方法，為其后續(xù)功能基因篩選研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九香蟲采自遵義習水(東經(jīng)106°22′、北緯22°32′)，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。焦碳酸二乙酯(DEPC)、75%乙醇、氯仿、異丙醇、2-巰基乙醇、無水乙醇，RNAeasy動物RNA抽提試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)、HP Total RNA Kit試劑盒(OMEGA Bio-tek)。

1.2 RNA提取

1.2.1 TRIzol法 取185 mg九香蟲于液氮充分研磨，轉移至1.5 mL離心管中，加入600 μL TRIzol，振蕩30 s，室溫放置5 min；加入160 μL氯仿，振蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃，10 000 g 離心20 min；取上層無色水相于RNAse-free離心管中，于離心管加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置30 min；4 ℃，10 000 g 離心20 min，棄上清；加入600 μL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃，10 000 g離心3 min，棄上清；室溫放置3 min，晾干，加入50 μL DEPC水，-80 ℃保存。

1.2.2 RNAeasy動物RNA抽提試劑盒法 取185 mg九香蟲組織，置于液氮中研磨成粉末，立刻加入600 μL裂解液，輕輕吹打10次，室溫放置5 min；14 000 g離心2 min，取上清；加入等體積結合液，輕輕顛倒混勻5次，移至純化柱中，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物；加入600 μL洗滌液Ⅰ，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物；加入600 μL洗滌液Ⅱ，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物；再加入600 μL洗滌液Ⅱ，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物，14 000 g離心2 min，去除殘留的液體；將RNA純化柱置于RNA洗脫管中，加入50 μL洗脫液，室溫放置3 min，14 000 g離心30 s；重復洗脫一次，-80 ℃保存。

1.2.3 HP Total RNA Kit試劑盒法 取185 mg九香蟲組織于2 mL離心管中，加入500 μL Buffer GTC溶解；在室溫條件下，12 000 g離心5 min；轉移上清液至gDNA離心柱中，25 ℃，12 000 g離心2 min；加入250 μL無水乙醇，吹打混勻；向套有2 mL收集管的HiBind ? RNA Mini離心柱中加入500 μL樣本，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；加入300 μL RNA Wash BufferⅠ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；再加入400 μL RNA Wash BufferⅠ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；加入500 μL RNA Wash BufferⅡ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；再次向離心柱中加入500 μL RNA Wash BufferⅡ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；加入30 μL的DEPC水，靜置2 min，10 000 g，離心1 min；重復洗脫一次，-80 ℃保存。

1.3 RNA檢測

1.3.1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 配制1% 瓊脂糖凝膠；取3 μL九香蟲RNA和2 μL上樣緩沖液混合，上樣；1% 瓊脂糖凝膠中130 V電壓下電泳15或20 min，用Bio-Rad凝膠成像儀拍照。三次重復。

1.3.2 紫外分光光度計檢測 取九香蟲RNA 1μL，用NanoDrop 2000/2000C分光光度計檢測九香蟲總RNA 的濃度、OD260/280，并計算九香蟲總RNA含量，九香蟲總RNA含量=RNA濃度×RNA溶液體積/九香蟲組織質(zhì)量。三次重復。

2 結果與分析

2.1 1%瓊脂糖凝膠電泳結果

1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，可見用TRIzol法和HP Total RNA Kit試劑盒法提取出的九香蟲總RNA有兩條清晰可見的條帶，使用TRIzol法提取的九香蟲總RNA電泳圖中28S條帶比18S條帶的亮度強，用HP Total RNA Kit試劑盒法提取獲得的九香蟲總RNA的18S條帶比28S條帶的亮度強，而使用RNAeasy動物RNA抽提試劑盒法提取的RNA未見到清晰的條帶。

注：A：TRIzol法(電泳20 min)；B：RNAeasy動物RNA抽提試劑盒(電泳20 min)；C：HP Total RNA Kit試劑盒(電泳15 min)

圖1 三種方式提取九香蟲總RNA電泳

2.2 紫外分光光度計檢測結果

紫外分光光度計檢測結果見表1，九香蟲RNA的含量以TRIzol法提取的最高(432.856±54.560 ng/mg)，HP Total RNA Kit試劑盒法提取的次之(40.104±19.386 ng/mg)，RNAeasy動物RNA抽提試劑盒法提取的最低(12.879±1.051 ng/mg)；3種方法提取的九香蟲RNA的OD260/280都在1.9～2.1，表明被蛋白質(zhì)和DNA等其他物質(zhì)污染較少[13]，其中，TRIzol法提取RNA的OD260/280為1.910±0.180，純度最高。

表1 3種方法提取九香蟲RNA的含量、純度及耗時

綜合1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測結果可知，用TRIzol法提取獲得的九香蟲RNA完整性、純度、濃度均最好。

3 討論

cDNA文庫的構建、基因克隆和RT-PCR等實驗均需要高質(zhì)量的RNA[14]，但RNA極容易降解，提取過程中存在的各種核糖核酸酶及理化因子都可能引起RNA的降解，從而影響后續(xù)的cDNA合成、基因克隆或表達分析[15-16]。理想的RNA提取方法應能夠在復雜環(huán)境條件下從不同的樣本中提取到高質(zhì)量的RNA，本實驗的研究對象九香蟲屬于昆蟲綱半翅目兜蝽科昆蟲，是《本草綱目》記載的一味傳統(tǒng)中藥，其體壁及腹腔中富含大量的幾丁質(zhì)、脂類、蛋白等物質(zhì)[7]，嚴重影響了RNA的提取質(zhì)量及相關功能基因克隆。因此，篩選合適的RNA提取方法對后續(xù)九香蟲功能基因的克隆、表達等研究至關重要。

近年來，研究人員對提取昆蟲總RNA的方法不斷進行比較和優(yōu)化，王鵬等[17]在提取荒漠甲蟲總RNA時比較了TRIzol、CTAB、熱酚法以及BioTeke Kit 和TianGen Kit 試劑盒法，發(fā)現(xiàn)TRIzol 法提取的總RNA的效率較另3種方法都高；徐文凱等[18]對TRIzol法優(yōu)化后對意大利蜜蜂的總RNA進行了提取，得到了質(zhì)量高、完整性好的RNA；高陽等[19]用改進的硅粒吸附法和TRIzol法提取小型昆蟲的總RNA。在眾多研究報道中發(fā)現(xiàn)，TRIzol法是一種提取昆蟲總RNA較常用且效果較好的方法。

本研究中的九香蟲樣本均在相同條件下處理獲得，避免了樣本差異對提取結果帶來的影響。九香蟲組織的研磨在離心管中用去酶小研磨棒研磨，此過程避免了在研磨過程中九香蟲組織的損失及各種酶類對九香蟲RNA的降解。TRIzol法提取RNA是較常規(guī)的一種方法，所用的實驗試劑都是實驗室里的常規(guī)試劑，價格都比較低廉，操作方法也比較簡便。除了九香蟲組織的研磨及離心沒有在生物安全柜里操作外，其余步驟均在生物安全柜中操作，這也是本次實驗改進點之一。采用TRIzol法提取九香蟲RNA耗時較長(耗時約100 min)，RNAeasy動物RNA抽提試劑盒法和HP Total RNA Kit試劑盒法較簡便(耗時約40 min)，前者提取RNA的純度較高、濃度較低，但二者所提取的RNA完整性、濃度、純度均較TRIzol法差。

綜上所述，3種方法中TRIzol法提取九香蟲RNA的完整性、純度、濃度最好，可為后續(xù)九香蟲功能基因的克隆及基因表達分析提供實驗基礎。