阮廣欣，周 蕾

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 腫瘤科，上海 200030)

原發(fā)性支氣管肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，近年來成為因癌癥死亡率最高的腫瘤[1]。中醫(yī)益氣養(yǎng)陰法是國醫(yī)大師劉嘉湘教授以“扶正治癌”學(xué)術(shù)思想為指導(dǎo)的核心治則。多項臨床研究表明，應(yīng)用益氣養(yǎng)陰法及其核心藥物在縮小穩(wěn)定病灶、抗肺癌轉(zhuǎn)移、延長生存期及提高生存率等方面均顯示出良好的療效，同時在改善癥狀、提高生存質(zhì)量、改善免疫功能等方面亦有良好的作用[2-5]。在藥物作用機(jī)制方面，應(yīng)用益氣養(yǎng)陰法及其核心藥物具有抑制肺癌細(xì)胞及干細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[6-8]。本研究擬結(jié)合中醫(yī)藥治療肺癌具有綜合調(diào)節(jié)、多靶點的作用特點，對益氣養(yǎng)陰法核心處方益氣養(yǎng)陰方如何影響肺癌細(xì)胞增殖及存活的分子機(jī)制展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞系 人肺癌細(xì)胞株A549(p53野生型)、H1299(p53缺失型)，均購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。A549及H1299細(xì)胞培養(yǎng)液含有RPMI-1640(Gibco公司)，10%小牛血清和1%兩性霉素，同時孵育于5% CO2，溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中。

1.1.2 實驗藥物 益氣養(yǎng)陰方由黃芪等12味中藥配方(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司)組成，其中黃芪14.6 g、北沙參14.6 g、天冬4.9 g、麥冬4.9 g、石上柏14.6 g、石見穿14.6 g、重樓7.3 g、女貞子4.9 g、山茱萸4.9 g、仙靈脾4.9 g、葫蘆巴4.9 g、絞股藍(lán)4.9 g。

1.1.3 主要試劑 MTS試劑盒：CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)(普洛麥格公司，美國)；單克隆抗體：NFκB P65、Phospho-NFκB (Ser 536)、IKKα、 Phospho-IKKα/β、AKT、Phospho-AKT (Ser 473)、p53，(Cell signal公司，美國)；β-Actin(Novus公司，美國)；抗體稀釋度為1∶1 000；Trizol試劑，Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen公司，美國)；SYBR Green PCR Master Mix(Bestar公司，德國)。

1.1.4 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(BioTek，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc)(Bio-Rad，美國)；Nanodrop 2000核酸定量儀(Thermo，美國)；ABI Step One Real-time PCR儀(ABI，美國)；熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(TECAN，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 益氣養(yǎng)陰復(fù)方顆粒以80 ℃蒸餾水100 mL震蕩溶解60 min，冷卻后用濾膜孔徑為0.22 μm的Millex針頭式過濾器，對益氣養(yǎng)陰方溶液進(jìn)行滅菌后裝入無菌管，再用PBS稀釋成梯度濃度以備用。

1.2.2 抑制細(xì)胞增殖研究 采用MTS法觀察不同濃度益氣養(yǎng)陰方對A549及H1299肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞及H1299細(xì)胞，以每孔3 000個細(xì)胞/100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，孵育24 h后分別加入梯度濃度的益氣養(yǎng)陰方，以及空白對照組；37 ℃溫箱中再培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTS試劑(2 mg/mL)20 μL，孵育4 h后，用酶標(biāo)儀以490 nm波長測定吸光度(OD)。計算出各組細(xì)胞增殖抑制率，并計算出益氣養(yǎng)陰方作用于A549及H1299細(xì)胞的半抑制濃度數(shù)值(IC50)。細(xì)胞生長率計算公式：抑制率(%)= (對照組A490值-實驗組A490值)/(對照組A490值-空白對照組A490值)×100%。

1.2.3 通過AKT/NF-κB信號通路抑制細(xì)胞存活研究 采用Western Blotting法檢測：根據(jù)益氣養(yǎng)陰方抑制肺癌細(xì)胞增殖IC50劑量，分別于不同時間點收集細(xì)胞(1×107)，用細(xì)胞裂解液(RIPA Buffer)收集細(xì)胞沉淀，于冰上提取細(xì)胞總蛋白，Brandford法測定蛋白含量。100 ℃變性5min，等量蛋白上樣。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜。5%BSA室溫封閉2h，經(jīng)與一抗NF-κB P65，Phospho-NF-κB(Ser 536)、IKKα、Phospho-IKKα/β、AKT、Phospho-AKT (Ser 473)、P53及β-tublin在4 ℃孵育過夜、二抗孵育后，加DAB顯色，在凝膠成像儀上觀察并進(jìn)行光密度分析。

1.2.4 對A549肺癌細(xì)胞P53下游基因影響研究 采用RT-PCR檢測：根據(jù)益氣養(yǎng)陰方抑制肺癌細(xì)胞增殖IC50劑量，分別于不同時間點收集細(xì)胞(1×107)：RNA提取用Invitrogen公司TRIzol TM裂解細(xì)胞，加入氯仿分離溶解蛋白有機(jī)相，收集RNA組分水相，異丙醇沉淀RNA，依次經(jīng)75%乙醇洗滌、DEPC水溶解，變性后以RNase free DNase消化可能殘存的DNA，Nanodrop 2000核酸定量儀測定獲得RNA濃度，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

RNA與Olig-dt-18在70 ℃變性5 min后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下42 ℃反應(yīng)1h，獲得cDNA。cDNA與相應(yīng)基因特異引物在dNTP、酶緩沖液、氯化鎂、Taq酶等條件下作PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件初步設(shè)為：50 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 min，55 ℃退火1 min，60 ℃延伸90 s，共40循環(huán)；最后再延伸5 min以充分反應(yīng)。具體反應(yīng)條件可逐步摸索或用梯度PCR儀進(jìn)行，并以GAPDH作為參照以ABI Step One Real-time PCR System定量分析基因的表達(dá)強(qiáng)度。實驗擴(kuò)增引物序列如下：

p53：F：5′-GTTCCGAGAGCTGAATGAGG-3′，R：5′-TTATGGCGGGAGGTAGACTG-3′；

Puma (BBC3)：F：5′-GAAGAGCAAATGAGCCAAACG-3′，R：5′-GGAGCAACCGGCAAACG-3′；

BAX：F：5′-GCCCTTTTGCTTCAGGGTTT-3′，R：5′-TCCAATGTCCAGCCCATGAT-3′；

BIM：F：5′-GATCCTTCCAGTGGGTATTTCTCTT-3′，R：5′-ACTGAGATAGTGGTTGAAGGCCTGG-3′；

GAPDH：F：5′-TCTACGAGTGGATGGTGCGTT-3′，R：5′-CGACTATGCAGTGACAGGTTGTG-3′

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果差異分析采用StudentT檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制情況

益氣養(yǎng)陰方可抑制A549及H1299肺癌細(xì)胞的增殖，且該抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。益氣養(yǎng)陰方作用于A549肺癌細(xì)胞24 h的IC50值約為0.22 g/mL，作用于H1299肺癌細(xì)胞24 h的IC50值約為0.15 g/mL。見圖1。

圖1 益氣養(yǎng)陰方對A549、H1299細(xì)胞增殖抑制作用

2.2 抑制細(xì)胞存活情況

益氣養(yǎng)陰方可通過下調(diào)A549細(xì)胞AKT及其磷酸化蛋白的表達(dá)，從而下調(diào)AKT靶蛋白IKKα/β的磷酸化表達(dá)，并終導(dǎo)致下游蛋白NF-κB磷酸化下調(diào)，抑制肺癌細(xì)胞存活，且該抑制作用在益氣養(yǎng)陰方干預(yù)24 h后最為明顯，對磷酸化AKT及NF-κB蛋白表達(dá)抑制率分別為84.9%、91.8%；而對于H1299細(xì)胞，益氣養(yǎng)陰方對于AKT及磷酸化、NF-κB及磷酸化的影響均不明顯。結(jié)果提示，益氣養(yǎng)陰方可以通過AKT/NF-κB信號通路抑制肺癌細(xì)胞存活，而這種抑制作用可能依賴于p53的表達(dá)。見圖2、圖3。

圖2 益氣養(yǎng)陰方對AKT/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 益氣養(yǎng)陰方對A549細(xì)胞磷酸化AKT及NF-κB蛋白表達(dá)的影響

2.3 增加腫瘤抑制蛋白p53表達(dá)

益氣養(yǎng)陰方可以增加A549細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)，且該作用呈現(xiàn)時間依賴性，在益氣養(yǎng)陰方干預(yù)24 h后,p53蛋白表達(dá)明顯增長率為214.8%。見圖4。

圖4 益氣養(yǎng)陰方對A549細(xì)胞P53蛋白表達(dá)的影響

2.4 上調(diào)p53及下游基因BAX、Bim、Puma的表達(dá)

益氣養(yǎng)陰方可以上調(diào)A549細(xì)胞p53及下游基因(Bcl-2家族基因)BAX、Bim、Puma表達(dá)，且該作用呈現(xiàn)時間依賴性。見圖5。

注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

3 討論

國醫(yī)大師劉嘉湘教授首倡“扶正法”治療惡性腫瘤，經(jīng)過數(shù)十年的臨床觀察及研究，形成了完善的學(xué)術(shù)思想體系，其中益氣養(yǎng)陰法是“扶正治癌”的核心治則，被廣泛地應(yīng)用于肺癌的治療。體內(nèi)外實驗研究也揭示益氣養(yǎng)陰法核心藥物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并且可能通過降低耐藥腫瘤細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)腫瘤[6-7]；最近有研究表明益氣養(yǎng)陰法可通過抑制耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制Lewis肺癌Sca-1+干細(xì)胞亞群增殖[8]；通過逆轉(zhuǎn)凋亡抵抗來逆轉(zhuǎn)吉非替尼的獲得性耐藥[9-10]。但益氣養(yǎng)陰法如何抑制肺癌細(xì)胞存活方面的研究則少有報道。

腫瘤是指細(xì)胞在致瘤因素作用下，基因發(fā)生改變，即癌基因與抑癌基因平衡被破壞，失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。因此，如何抑制細(xì)胞增殖、減少腫瘤細(xì)胞存活是腫瘤治療的關(guān)鍵。蛋白激酶AKT通過調(diào)節(jié)下游多種信號傳導(dǎo)可以影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞存活等，其中，AKT可以通過激活I(lǐng)KK及下游因子NF-κB是一條調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、影響細(xì)胞存活的關(guān)鍵通路。研究表明抑制AKT/NF-κB信號傳導(dǎo)通路能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及存活[11-12]。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制，AKT正是通過磷酸化作用影響下游效應(yīng)物如IKK、NF-κB等，最終激活腫瘤細(xì)胞存活[13]。p53是抑制腫瘤生長的關(guān)鍵因子和蛋白，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子則為細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中重要的多功能調(diào)節(jié)因子，兩者之間存在相互作用。其機(jī)理之一是NF-κB通過調(diào)控p53的E3泛素連接酶Mdm2的水平(由IKKβ介導(dǎo))，從而下調(diào)P53的穩(wěn)定性，抑制DNA損傷引起的p53活化[14-15]。另外，p53 和NF-κB通路均受到PI3K-AKT信號的調(diào)控，在增加Mdm2核轉(zhuǎn)位的同時下調(diào) p53的表達(dá)，而AKT激活被抑制可使Mdm2在胞漿滯留，同時通過AKT介導(dǎo)的IKK磷酸化激活NF-κB信號通路，影響細(xì)胞存活[16]。因此，AKT、NF-κB以及p53均是影響細(xì)胞生長及存活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化因子和蛋白，也被視作抗癌藥物作用的效應(yīng)靶點。本研究結(jié)果顯示，益氣養(yǎng)陰方可以通過下調(diào)AKT/NF-κB信號通路抑制肺癌細(xì)胞增殖與存活，且抑制作用與p53表達(dá)與否密切相關(guān)。

p53作為腫瘤抑制因子的功能，主要是通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)，從而實現(xiàn)維持基因組的穩(wěn)定、避免突變發(fā)生的功能。Bcl-2家族基因是p53下游重要的靶基因，是控制線粒體致凋亡因子釋放的主要調(diào)節(jié)因子，主要包括促凋亡因子Bax、Bim、Puma[17-20]。由于DNA受損而使腫瘤抑制基因p53活化，上調(diào)Bcl-2家族中細(xì)胞促凋亡前蛋白Bax、Bim、Puma的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體內(nèi)外膜間凋亡前物質(zhì)細(xì)胞色素C和Smac/DIABLO的釋放，從而啟動線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，即內(nèi)在途徑(線粒體途徑)[21]。

本研究結(jié)果顯示益氣養(yǎng)陰方通過上調(diào)p53及其下游基因BAX、Bim、Puma的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，從另一方面詮釋了既往研究所得到的益氣養(yǎng)陰方具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的作用及途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子p53可能是中醫(yī)益氣養(yǎng)陰法影響肺癌細(xì)胞周期變化的關(guān)鍵靶點之一，為以后開展進(jìn)一步臨床及機(jī)制研究提供了新的角度和思路。