鄭國華　代云　楊光明　楊列　蔣麗

[摘要] 目的 探討大腸癌患者檢測Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變的臨床價值。 方法 以2014年2月—2018年11月為時限，方便擇取該院65例大腸癌患者，取術(shù)后新鮮腫瘤組織樣本進(jìn)行基因突變檢測，觀察其與大腸癌病理特征及生存率間的關(guān)系。 結(jié)果 結(jié)腸癌Braf突變率（11.11%）高于直腸癌，腫瘤直徑3 cm以上患者Kras突變率（50.00%）高于3 cm以下患者，腫瘤低分化Braf突變率（21.05%）高于中高分化，腸癌復(fù)發(fā)Kras突變率（51.35%）高于未復(fù)發(fā)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.715、7.651、6.843、5.680，P<0.05），Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變患者3年生存率分別為0.00%、20.00%、67.86%、33.33%，均低于野生型基因，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.972、8.631、5.740、6.533，P<0.05）。 結(jié)論 Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變檢測能夠?yàn)榇竽c癌靶向治療及預(yù)后評估提供有價值的依據(jù)和指導(dǎo)，值得推廣使用。

[關(guān)鍵詞] 大腸癌;基因突變;基因檢測;治療;預(yù)后

[中圖分類號] R735? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）08（b）-0029-04

[Abstract] Objective To investigate the clinical value of detecting Nras， Braf， Kras and Pik3ca gene mutations in patients with colorectal cancer. Methods From February 2014 to November 2018，convenient 65 patients with colorectal cancer were enrolled in our hospital. The fresh tumor tissue samples were taken for gene mutation detection to observe the relationship between pathological features and survival rate of colorectal cancer. Results The Braf mutation rate of colon cancer （11.11%） was higher than that of rectal cancer. The mutation rate of Kras mutation （50.00%） was higher than that of patients with tumor diameter above 3cm. The rate of poorly differentiated Braf mutation （21.05%） was higher than that of moderately differentiated colon cancer. The recurrent Kras mutation rate （51.35%） was higher than that without recurrence，the difference? wasstatistically significant（χ2=3.715、7.651、6.843、5.680， P<0.05）. The 3-year survival rates of patients with Nras， Braf， Kras and Pik3ca mutations were 0.00%， 20.00%， 67.86%， 33.33%， all lower than the wild type gene，the difference? wasstatistically significant（χ2=10.972、8.631、5.740、6.533， P<0.05）. Conclusion The detection of Nras， Braf， Kras and Pik3ca gene mutations can provide valuable evidence and guidance for targeted therapy and prognosis evaluation of colorectal cancer. It is worthy of popularization.

[Key words] Colorectal cancer; Gene mutation; Gene detection; Treatment; Prognosis

大腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，2017中國癌癥流行病學(xué)數(shù)據(jù)報告顯示，發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第3位和第4位[1]，嚴(yán)重威脅人群健康。靶向治療指對已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)展開細(xì)胞分子水平上的精準(zhǔn)治療，它開創(chuàng)了腫瘤化療新領(lǐng)域，近年在大腸癌臨床治療中引起廣泛重視[2]。有研究表明，RAS野生型基因患者抗表皮生長因子受體（EGFR）治療客觀有效率高于抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），能夠?yàn)榛颊郀幦「L的疾病控制時間[3]，因此，靶向治療前開展基因檢測十分必要。該文現(xiàn)以2014年2月—2018年11月該院65例大腸癌患者為例，分析探討基因突變在大腸癌治療及預(yù)后評估中的作用，現(xiàn)報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便擇取該院收治的65例大腸癌患者，全部患者均行外科手術(shù)治療，術(shù)后組織學(xué)檢查明確病理診斷及特征，同時接受基因突變檢測，排除臨床資料不全者。入選病例中，男36例，女29例，年齡47～81歲，平均（66.2±9.4）歲。該研究獲倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2? 方法

全部患者術(shù)后石蠟組織。石蠟組織：白片置于切片盒中或組織切片轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mL 離心管，常溫環(huán)境下運(yùn)輸即可。樣本要求樣本需要滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，否則要求重新采樣：

（1）石蠟組織： 腫瘤細(xì)胞比例大于 50%且避免腫瘤組織壞死（送檢前先進(jìn)行常規(guī)病理診斷）。石蠟組織切片厚度 8～10? μm 5 張（面積約 250 mm2）。若不能按上述操作提供樣本，請?zhí)峁?10 張標(biāo)準(zhǔn)石蠟組織切片（未經(jīng)染色的白片），不接收染過色的切片。盡量送檢一年以內(nèi)的石蠟標(biāo)本。常溫環(huán)境下運(yùn)輸即可。

（2）樣本處理

石蠟組織：（脫蠟過程）

①將石蠟切片放入 1.5 mL 離心管中，加入 1 mL 二甲苯，蓋緊管蓋并劇烈震蕩混勻 10 s。

②室溫（15℃～25℃）下 13 000 rpm離心5 min，吸去上清，保留沉淀。

③重復(fù) 5.4.1～5.4.2 步驟 1～2 次

④加入 1 mL 無水乙醇，劇烈震蕩混勻，去除二甲苯

⑤室溫（15℃～25℃）下 13 000 rpm 離心 5 min

⑥吸去上清，去除殘留的乙醇，保留沉淀，重復(fù) ④-⑤步驟一次。

⑦打開離心管蓋子，室溫或 37℃晾干，約 10 min，直到乙醇完全揮發(fā)

注意：如石蠟切片上蠟過多，可將加入二甲苯后的石蠟標(biāo)本放置于 55℃水浴中 10 min 進(jìn)行脫蠟。

（3）石蠟組織 DNA 提取

核酸提取及純化（上海源奇公司， 貨號 W006）

方案1

①加入 200 μL Buffer M1 和 20 μL Proteinase K，充分混勻，56℃孵育 1 h 直至樣本完全裂解，（可以過夜消化）。

②置于 90℃孵育 1 h。

③（可選步驟）如果要去除RNA，可以向樣本中加入 2 μL RNase A（100 mg/mL）（客戶自備， TIANGEN， RT405-12），室溫孵 2 min 后，進(jìn)行下一步操作。

④在上管中加入 220 μLBuffer M2 渦旋混勻，再加入 250 μL 無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻，短暫離心使管壁上的溶液收集到管底。

⑤將上一步所得的混合液加入一個吸附柱 Spin Columns CR 中，8 000rpm（～6 000xg）室溫離心 2 min，倒掉廢液，重新將吸附柱放回收集管中。

注意：吸附柱最大容量為 700 μL，可將剩余液體重復(fù)上述步驟上柱。

⑥向吸附柱 Spin Columns CR 中加入 500 μL Buffer M3，8 000rpm（～6 000xg）室溫離心 60sec， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

⑦向吸附柱 Spin Columns CR 中加入 600 μL Buffer M4，8 000rpm（～6 000xg）室溫離心 60sec， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

⑧重復(fù)操作步驟⑦。

⑨將吸附柱 Spin Columns CR 放回收集管中，空管 12 000rpm（～13 400xg）離心 2 min，倒掉廢液，將吸附柱開蓋置于室溫放置 2～5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的 Buffer M4。

注意：乙醇?xì)埩魰种坪罄m(xù)的酶反應(yīng)，所以晾干時要確保乙醇揮發(fā)干凈。但也不要干燥太長時間， 以免難以洗脫DNA。

⑩將吸附柱 Spin Columns CR 轉(zhuǎn)入下一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 65℃預(yù)熱的 30～100 μL Buffer M5 或 ddH2O 洗脫，室溫放置 2～5 min，12 000rpm（～13 400xg）離心 2 min， 將收集有 DNA 的離心管-20℃保存。

注意：Buffer M5 體積不應(yīng)少于 30 μL，體積過小影響回收效率。為增加基因組 DNA 的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱 Spin Columns CR 中，室溫放置 2 min，12 000rpm（～13 400xg）離心 2 min。洗脫液的 pH 對于洗脫效率有很大影響。若用 ddH2O 做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 7.0～8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率;且 DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。

操作步驟嚴(yán)格遵照腸癌6基因檢測（NGS法）標(biāo)準(zhǔn)操作流程。檢測采用儀器Ion torrent PGM 測序儀/III umina測序儀，檢測基因包括Kras 2外顯子 G12D、G12A、G12R、G12C、G12V、G12S、G13C、G13D、3外顯子Q61L、Q61R、Q61H、4外顯子、5外顯子等。同時，取樣腫瘤組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、HE染色等處理，鏡下觀察腫瘤病理學(xué)特征，術(shù)后隨訪3年統(tǒng)計(jì)生存率，觀察基因突變檢測結(jié)果與患者大腸癌臨床特征、病理特征及生存率間的關(guān)系。

1.3? 統(tǒng)計(jì)方法

以SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 基因檢測結(jié)果

65例患者中，基因突變33例（50.77%），其中5例患者2個基因合并突變，共計(jì)基因突變38例次，包括Nras突變2例（3.08%），Braf突變5例（7.69%），Kras突變28例（43.08%），Pik3ca突變3例（4.62%）。

2.2? 基因突變與大腸癌病理特征分析

結(jié)腸癌患者Braf突變、Pik3ca突變發(fā)生率高于直腸癌患者，腫瘤直徑3 cm以上患者Kras突變發(fā)生率高于3 cm以下患者，腫瘤低分化患者Braf突變發(fā)生率高于中高分化患者，術(shù)后腸癌復(fù)發(fā)患者Braf突變、Kras突變發(fā)生率高于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.715、3.286、7.651、6.843、4.305、5.680，P<0.05），余各指標(biāo)基因突變發(fā)生率相當(dāng)，見表1。

2.3? 基因突變與腸癌預(yù)后分析

隨訪顯示，65例患者3年生存54例，生存率83.08%。各基因突變型患者3年生存率均明顯低于野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3? 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，腸癌的發(fā)生與進(jìn)展同一連串癌基因與抑癌基因突變有關(guān)[4]，是一個受多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，主要包括各種RAS基因、Braf基因、Pik3ca基因、Tp53基因等，其中Kras基因突變?yōu)橹饕c癌標(biāo)記。本研究納入的65例腸癌患者中，基因檢測突變33例，構(gòu)成比50.77%，與文獻(xiàn)報道大腸癌患者基因突變48.5%檢出率的結(jié)論相近[5]。對比觀察不同基因突變患者的病理特點(diǎn)，結(jié)果顯示，不同發(fā)病部位、腫瘤直徑、腫瘤分化程度及預(yù)后的患者Braf、Kras、Pik3ca基因突變率存在明顯差異，能夠?yàn)樵摬∨R床治療提供一定參考。其中，Braf基因突變患者術(shù)后隨訪期間腫瘤均轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，考慮是影響患者預(yù)后的危險因素。Pik3ca基因突變是近年臨床關(guān)注熱點(diǎn)，有研究指出其與大腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在密切相關(guān)性，考慮可能與該突變基因引起大腸癌對抗EGRF藥物不敏感有關(guān)[6]，該次臨床研究中，3例Pik3ca基因突變患者均出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，發(fā)生率5.36%，與文獻(xiàn)報道結(jié)論（4.79%）相近[7]。Nras基因在該研究中不同病理特點(diǎn)的腸癌患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），考慮與樣本數(shù)較少、Nras基因突變檢出率過低等因素有關(guān)。另外，研究發(fā)現(xiàn)基因突變的腸癌患者生存率顯著較野生型患者下降，但目前臨床尚未完全明確其機(jī)制。國外有研究指出，基因突變可能在“畸形隱窩灶-增生性息肉-鋸齒狀瘤-癌”這一腸癌病理改變中扮演著催化角色[8]，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞增殖分化，加劇癌細(xì)胞侵襲性生長。

綜上所述，Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變檢測能夠?yàn)榇竽c癌靶向治療及預(yù)后評估提供有價值的依據(jù)和指導(dǎo)，值得推廣使用。

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（收稿日期：2019-05-17）