馬彥軍，祝小娟，何瑞雪

(甘肅農業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070)

植物生長發(fā)育過程中會受到鹽、干旱、高溫、低溫、強光照等不良環(huán)境的影響[1]。在我國干旱和半干旱地區(qū)，干旱脅迫與鹽脅迫是植物生長過程中最常見的逆境因子[2]，這些不利環(huán)境因子通常會抑制植物的正常生命活動，是植物正常生長發(fā)育受到影響的主要因素，而種子萌發(fā)作為植物生長的關鍵時期[3]，能否在鹽堿環(huán)境條件下萌發(fā)出苗及幼苗正常生長發(fā)育，是植物在鹽堿環(huán)境條件下生長發(fā)育的前提以及植物群落更新的關鍵階段[4]。中國鹽漬土面積約有20多萬km2，約占國土總面積的2.1%[5]。這些鹽漬土地是可利用土地資源的一部分，尤其是在北方地區(qū)如何改造和合理開發(fā)利用這些鹽漬土地，成為一個重要課題和研究方向。耐鹽植物的選育與利用是提高鹽漬土壤生產力和利用率直接而有力的措施[6,7]。因此，研究鹽脅迫對植物種子萌發(fā)以及鹽脅迫對植物幼苗生理生化的影響，對中國北方鹽堿地改良和生態(tài)環(huán)境建設中植物材料的選擇具有現實意義。

鹽爪爪(Kalidiumfoliatum)為黎科(Chenopdiaceae)鹽爪爪屬(KalidiumMiq)多年生鹽生植物，具有防風固沙的作用[8]。鹽爪爪不僅能在鹽堿地生長，而且能從鹽堿土壤中吸收大量的Na+以降低土壤鹽含量，改良土壤理化性質和增加土壤有機質[9]。鹽爪爪為肉質多汁含鹽飼草，是駱駝等家畜的主要飼草；種子可磨成粉，人可食用，也可飼喂牲畜[10]。因此在鹽堿荒地種植鹽爪爪，不僅能改良鹽堿地，而且也能為當地群眾提供一定量的飼草，具有生態(tài)效益和經濟效益雙重作用。目前關于鹽爪爪研究主要有耐鹽性生理特性[11]、根系適鹽特性[12]以及鹽爪爪種植對土壤鹽分影響[13]等方面。曾幼玲等[14]研究結果表明低濃度的NaCl脅迫處理對鹽爪爪和鹽穗木(Halostachyscaspica)種子萌發(fā)有促進作用，在100 mmol·L-1鹽溶液中，鹽爪爪和鹽穗木種子萌發(fā)狀況最佳，無鹽或高濃度的鹽不利于種子萌發(fā)。何芳蘭等[15]研究結果表明鹽爪爪種子萌發(fā)的最低滲透勢閥值為—1.5 MPa。鹽堿脅迫可對植物產生氧化脅迫，造成活性氧傷害，這是植物在鹽堿逆境中受到傷害的一個重要原因[16]，同時植物體內也有超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)等內源活性氧清除劑，能把植物在逆境脅迫過程中產生的過量活性氧清除，維持細胞膜的穩(wěn)定性，進而增強植物的抗逆性[17]。本試驗擬以甘肅民勤野生鹽爪爪種子為材料，研究不同種類和濃度的鹽脅迫對其種子萌發(fā)、幼苗生長及幼苗抗氧化酶活性的影響，探索不同種類鹽脅迫下鹽爪爪種子出苗和幼苗生長情況，以及幼苗在鹽脅迫下生理反應，以期為鹽爪爪在甘肅鹽堿土地的引種、馴化和大面積種植提供參考，同時也為進一步深入研究鹽爪爪耐鹽機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為鹽爪爪種子，成熟飽滿且無病蟲害，2018年10月采自甘肅省武威市民勤縣西渠鎮(zhèn)(103°32′ E，38°54′ N，海拔1 309 m)，種子用0.1%的HgCl2溶液消毒3 min，再用無菌蒸餾水反復沖洗3～4次，用無菌濾紙吸干備用。

將清洗干凈的蛭石置于立式壓力蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，于烘箱中干燥，備用。

1.2 試驗方法

2018年12月利用塑料發(fā)芽盒(15 cm×10 cm×5 cm)進行種子萌發(fā)出苗試驗。將處理好的蛭石平鋪在發(fā)芽盒內，厚3 cm。用等量的不同種類和濃度的鹽溶液將蛭石澆透作為苗床，以蒸餾水處理的蛭石苗床為對照(Control check，CK)。將種子均勻地條播在發(fā)芽盒里，覆蛭石0.5 cm左右。每個處理30粒種子，重復3次。在培養(yǎng)室進行發(fā)芽觀測。以肉眼看到種子出土為判斷標準，每24 h記錄一次種子萌發(fā)數，種子連續(xù)3 d沒有新的萌發(fā)則結束試驗。種子萌發(fā)試驗結束后從每個處理中取前3 d萌發(fā)的幼苗測定其根長以及苗長，其余幼苗用來測定可溶性蛋白含量、SOD、POD、CAT酶活性。

本試驗用于測試的鹽為NaCl和Na2SO4，根據預試驗，設置NaCl和Na2SO4的濃度均為50，100，200，300，400 mmol·L-15個濃度梯度，蒸餾水為對照(CK)，每個處理3個重復。

相關指標的計算公式及測量方法如下：

萌發(fā)率(Germination rate,GR)=GN/SN×100%，式中：GN為種子萌發(fā)總數；SN為種子總數[18]。

發(fā)芽勢(Germination potential,GP)=n1/N×100%，式中：n1為前3 d內正常發(fā)芽種子粒數；N為供試種子數[18]。

根冠比(Root-stem ratio，RSR)=根長/苗長[18]。

發(fā)芽指數(Germination index，GI)=∑Gt/Dt，式中：Gt為置床后t天的發(fā)芽數，Dt為相應的發(fā)芽天數[18]。

可溶性蛋白(Soluble protein,SP)含量：采用考馬斯亮藍法測定[19]。

過氧化物酶(POD)活性：采用愈創(chuàng)木酚比色法測定[19]。

過氧化氫酶(CAT)活性：采用紫外吸收法測定[19]。

超氧化物歧化酶(SOD)活性：采用氮藍四唑光還原法測定[19]。

1.3 數據處理

利用Excel 2013和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數據進行計算、差異顯著性分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對鹽爪爪種子萌發(fā)的影響

由圖1可看出，鹽爪爪種子萌發(fā)率隨著鹽濃度的增加呈現出先升后降趨勢，NaCl和Na2SO4濃度為50 mmol·L-1時萌發(fā)率最高，分別比CK高出13%和12%；NaCl和Na2SO4濃度為100 mmol·L-1時鹽爪爪種子萌發(fā)率雖有所下降，Na2SO4處理下與CK相比差異不顯著(P>0.05)，而NaCl處理下與CK相比差異顯著(P<0.05)；NaCl濃度在200～400 mmol·L-1范圍內，鹽爪爪種子萌發(fā)率差異不顯著(P>0.05)，Na2SO4濃度超過200 mmol·L-1時鹽爪爪種子萌發(fā)率與CK相比差異顯著(P<0.05)；從萌發(fā)率來看Na2SO4對鹽爪爪種子萌發(fā)影響大于NaCl。

圖1 鹽脅迫對鹽爪爪種子萌發(fā)的影響

鹽爪爪種子發(fā)芽勢隨鹽濃度增加而下降。NaCl濃度為50 mmol·L-1時發(fā)芽勢與CK相比差異不顯著(P>0.05)；Na2SO4濃度為50 mmol·L-1時發(fā)芽勢低于CK，但差異不顯著(P>0.05)，濃度在50～200 mmol· L-1范圍內，鹽爪爪種子發(fā)芽勢之間差異不顯著(P>0.05)。這說明在一定鹽濃度范圍內，鹽脅迫雖然延遲了鹽爪爪種子出苗時間，但出苗還是比較整齊。

2.2 鹽脅迫對鹽爪爪幼苗根莖比的影響

由圖2可看出，鹽爪爪幼苗根莖比隨鹽濃度增加呈先上升后下降的趨勢。NaCl濃度低于100 mmol·L-1時，鹽爪爪幼苗根莖比與CK相比差異不顯著(P>0.05)，當NaCl濃度為200 mmol·L-1時根莖比與CK相比差異顯著(P<0.05)。Na2SO4處理下根莖比在50 mmol·L-1時最大，與CK相比差異顯著(P<0.05)，當Na2SO4濃度大于200 mmol·L-1時根莖比小于CK，且與CK相比差異顯著(P<0.05)。不同濃度NaCl處理下根莖比均低于Na2SO4處理，說明NaCl脅迫對幼苗生長抑制作用更明顯，抑制作用NaCl>Na2SO4。

2.3 鹽脅迫對鹽爪爪發(fā)芽指數的影響

由圖3可知，鹽爪爪種子在鹽脅迫下，發(fā)芽指數呈現先升后降趨勢。NaCl和Na2SO4濃度小于200 mmol·L-1時，發(fā)芽指數與CK相比差異不顯著(P>0.05)，超過此濃度后發(fā)芽指數開始下降。在低濃度(≤100 mmol·L-1)下Na2SO4對鹽爪爪種子發(fā)芽指數的影響大于NaCl，而高濃度(≥200 mmol·L-1)下，Na2SO4對鹽爪爪種子發(fā)芽指數的影響小于NaCl。

圖2 鹽脅迫對鹽爪爪幼苗根莖比的影響

2.4 鹽脅迫對鹽爪爪幼苗可溶性蛋白含量的影響

圖4可知，鹽爪爪幼苗體內可溶性蛋白含量隨鹽濃度增加而上升，當鹽濃度高于50 mmol·L-1時鹽爪爪幼苗可溶性蛋白含量與CK相比差異顯著(P<0.05)；相同濃度不同鹽分脅迫下可溶性蛋白含量差異不明顯。這是由于鹽爪爪幼苗在受到鹽脅迫后會產生較多的有害物質，幼苗體內就會產生較多的可溶性蛋白質，這些蛋白質可作為各種酶物質以清除這些有害物質。

圖3 鹽脅迫對鹽爪爪發(fā)芽指數的影響

2.5 鹽脅迫對鹽爪爪幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖5可知，在鹽脅迫下，鹽爪爪幼苗體內SOD，POD酶活性呈現出先上升后下降趨勢，SOD酶活性在鹽濃度為100 mmol·L-1時大于對照；當NaCl濃度繼續(xù)增加時，SOD酶活性開始下降，Na2SO4為200 mmol·L-1時，SOD酶活性雖然下降，但與CK相比差異不顯著(P>0.05)。高濃度(≥200 mmol·L-1)下，Na2SO4脅迫下鹽爪爪幼苗體內SOD酶活性比NaCl脅迫下高。NaCl脅迫下POD酶活性變化趨勢與SOD酶活性趨勢基本一樣，在低濃度(≤100 mmol·L-1)POD酶活性與CK相比差異不顯著(P>0.05)，高濃度(≥200 mmol·L-1)下POD酶活性與CK相比差異顯著(P<0.05)。Na2SO4濃度為50 mmol·L-1時POD酶活性略高于CK，但差異不顯著(P>0.05)，Na2SO4濃度為100 mmol·L-1時POD酶活性與CK相比差異顯著(P<0.05)。CAT酶活性在這2種鹽脅迫下均呈下降趨勢。

圖4 鹽脅迫對鹽爪爪幼苗可溶性蛋白含量的影響

圖5 鹽脅迫對鹽爪爪幼苗SOD，POD，CAT酶活性的影響

3 討論

種子在鹽脅迫下的萌發(fā)情況可以反映出植物種子萌發(fā)期的耐鹽能力[20]。一般來說，鹽生植物種子發(fā)芽率隨著鹽濃度的增加而呈現出先升后降趨勢，即低濃度的鹽脅迫能促進種子萌發(fā)，而高濃度鹽脅迫抑制種子萌發(fā)[21]。鹽脅迫會延長種子的萌發(fā)時間、推遲鹽生植物種子的初始萌發(fā)時間[22]，在高濃度鹽脅迫下植物種子的萌發(fā)可能受到完全地抑制[23]。本試驗結果表明，NaCl和Na2SO4脅迫處理對鹽爪爪種子的萌發(fā)均存在高濃度(≥200 mmol·L-1)抑制、低濃度(≤100 mmol·L-1)促進現象，即呈現出隨著鹽溶液濃度升高萌發(fā)率先升后降的特征，這表明一定濃度的鹽脅迫可促進鹽爪爪種子的萌發(fā)，這與沈禹穎等[24]的研究結果一致。鹽爪爪種子在高濃度鹽(400 mmol·L-1)脅迫下種子仍然能萌發(fā)，且萌發(fā)率大于10%，這表明鹽爪爪種子在萌發(fā)期具有很強的耐鹽性，這一結果與曾幼玲等[14]的研究結果一致，其試驗發(fā)現鹽爪爪種子經500 mmol·L-1的鹽處理下仍能發(fā)芽。發(fā)芽勢是反映種子品質的重要指標之一，一般認為發(fā)芽勢高的種子播種后發(fā)芽整齊[25]。本試驗研究結果雖然是鹽爪爪種子發(fā)芽勢隨鹽濃度增大而降低，但是NaCl濃度在50～300 mmol·L-1范圍內，Na2SO4濃度在50～200 mmol·L-1范圍內，鹽爪爪種子發(fā)芽勢差異不顯著(P>0.05)，這表明在一定鹽濃度范圍內，鹽脅迫雖然延遲了鹽爪爪種子出苗時間，但出苗仍比較整齊。由于植物種類的不同，鹽脅迫下不同組織和器官的反應也不同[26]。有的植物在鹽脅迫下對地上部的抑制作用較地下部明顯[27]；也有研究結果表明根系相對比較幼嫩時地下部分對鹽分更敏感[28]，本研究得出的結果與后者更相近，在不同濃度和種類鹽脅迫下鹽爪爪的根冠比均小于1，可以看出鹽脅迫對鹽爪爪根的影響更明顯，這是由于鹽爪爪是典型的泌鹽植物，在鹽腺分泌細胞中含有許多小液泡，可將從土壤中主動吸收積累的大量鹽離子儲存在液泡中而實現區(qū)隔化，維持細胞液中正常的滲透勢，從而減少鹽對葉片造成的危害[29]。

植物受到不良環(huán)境影響時自身會發(fā)生一系列的生理生化反應來提高其抗逆性。在植物體內的可溶性蛋白大多都是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物體總代謝的重要指標，這在某種程度上也能反映植物抵御逆境脅迫的能力[30]。本研究中隨著鹽濃度的增加，鹽爪爪幼苗體內可溶性蛋白含量隨著鹽濃度的增加而增加，這與代莉慧等[31]在研究鹽爪爪種子在不同鹽脅迫下種子萌發(fā)過程中生理生化變化結果一致，這說明鹽爪爪幼苗在受到鹽脅迫時，幼苗體內會產生較多的可溶性蛋白質，這些蛋白質可作為各種酶來參與代謝以抵御不良環(huán)境對植物產生的危害。

植物在受到逆境脅迫時，體內會產生大量的活性氧，這些活性氧如不能被及時被清除，就會破壞細胞的完整性；在正常情況下活性氧不會對植株產生明顯毒害，這是由于植株體內活性氧的產生與清除處在動態(tài)平衡之中。一旦植物受到不良環(huán)境脅迫，這種平衡就會被破壞，積累自由基、膜通透性增加、代謝紊亂，植物便受到傷害[32]。在植物體內也有一個清除活性氧、維持自由基動態(tài)平衡的防御系統(tǒng)，細胞中的SOD，POD，CAT等保護酶是這個防御系統(tǒng)的重要組成部分[33]；SOD，POD，CAT三者協(xié)調一致，可使植物體內活性氧自由基維持在一定的水平，從而減少活性氧對細胞膜的傷害、減輕膜質過氧化和穩(wěn)定膜的透性，使植物能夠進行正常的生長和代謝[34]。研究結果表明不同植物體內清理自由基的酶并不一致[35]。本研究結果表明在鹽脅迫下，鹽爪爪幼苗體內SOD，POD酶活性呈現出先上升后下降趨勢，CAT酶活性在這2種鹽脅迫下均呈下降趨勢。這說明當鹽爪爪幼苗受到不良環(huán)境影響時，通過增加其體內SOD，POD酶活性來清除體內產生過多的活性氧，從而保護鹽爪爪免造外界不良環(huán)境對其產生的影響。

4 結論

鹽爪爪種子在NaCl和Na2SO4脅迫下萌發(fā)率隨鹽濃度的增加呈現出先上升后下降的趨勢，當NaCl和Na2SO4濃度小于50 mmol·L-1時可促進鹽爪爪種子萌發(fā)，NaCl濃度大于100 mmol·L-1，Na2SO4濃度大于200 mmol·L-1時可抑制鹽爪爪種子萌發(fā)。在鹽脅迫下鹽爪爪幼苗體內會產生較多的可溶性蛋白，這些蛋白質可作為各種酶來參與代謝以抵御鹽脅迫對其產生的危害；鹽脅迫下鹽爪爪幼苗體內SOD，POD酶活性呈現出先上升后下降趨勢，在一定濃度范圍內(NaCl≤100 mmol·L-1，Na2SO4≤50 mmol·L-1)鹽脅迫下鹽爪爪幼苗可通過提高體內SOD和POD酶活性來清除其幼苗在受到鹽脅迫時產生的過量活性氧，使活性氧自由基維持在一定水平，從而保證鹽爪爪幼苗能在一定濃度鹽脅迫下正常生長。