劉亞令，耿雅萍，解瀟冬，王 芳，張鵬飛

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷，030801； 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷，030801)

藥用黃芪(AstragaliRadix)為豆科植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Beg.) Hsiao)與膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.)的干燥根[1]。其中野生蒙古黃芪主要分布于山西、內(nèi)蒙古、甘肅、青海等高海拔、半干旱地區(qū)，道地藥材產(chǎn)區(qū)以山西渾源、天鎮(zhèn)等北部地區(qū)產(chǎn)的蒙古黃芪為優(yōu)，其次是內(nèi)蒙古的固陽縣、武川縣等地的蒙古黃芪[2]。野生膜莢黃芪不為主流商品，在中國西南、西北地區(qū)以及東北地區(qū)的黑龍江、遼寧、吉林地區(qū)均有分布[3]。黃芪味甘、性溫，具有補(bǔ)氣、利水、排毒等功效，為常用大宗藥材之一，已擁有2000多年的藥用歷史，是中醫(yī)方劑中常用的補(bǔ)氣藥物[4]。目前黃芪不僅用于藥用，還在食療及保健的開發(fā)和利用方面也得到了廣泛應(yīng)用[5]。但隨著黃芪資源市場(chǎng)需求量的增大，造成近幾年野生黃芪的過度采挖，野生黃芪資源幾近枯竭，大面積的成規(guī)模的野生黃芪分布已十分少見，大多只是零星分布[2]，人工栽培黃芪成為了市場(chǎng)上的主力軍，但人工栽培黃芪種質(zhì)資源混雜，規(guī)范化種植管理和生產(chǎn)水平較低，常會(huì)造成其質(zhì)量及藥用療效的不穩(wěn)定，因此亟需進(jìn)行規(guī)范化育種以保護(hù)黃芪種質(zhì)資源。研究遺傳多樣性有助于人們更清楚地理解生物多樣性的起源和進(jìn)化，并為植物分類提供一定的理論依據(jù)，進(jìn)而為植物育種和保護(hù)策略的制定奠定基礎(chǔ)[6-7]。

目前，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，多種分子標(biāo)記已被廣泛的用于植物遺傳多樣性分析[8-9]、親緣關(guān)系鑒定[10]、核心種質(zhì)構(gòu)建[11]、遺傳圖譜的構(gòu)建[12]等，其中簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，因其具有操作方便、重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[13]，成為理想有效的分子標(biāo)記之一，現(xiàn)已經(jīng)成功應(yīng)用在甘草(GlycyrrhizaL.)[14-15]、黨參(Codonopsis)[16]、黃芩(Scutellariabaicalensis)[17]等多種藥用植物的遺傳多樣性研究及育種中。

因此，本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記對(duì)黃芪主產(chǎn)區(qū)山西、內(nèi)蒙、吉林不同產(chǎn)地的兩種藥用黃芪進(jìn)行遺傳多樣性及居群遺傳結(jié)構(gòu)分析，了解不同居群不同物種藥用黃芪的遺傳多樣性水平、遺傳分化、變異程度以及居群結(jié)構(gòu)組成，為今后黃芪種質(zhì)選育利用及保護(hù)策略的制定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料的收集

本試驗(yàn)共采集了380份藥用黃芪材料，其中蒙古黃芪285份，膜莢黃芪85份，涵蓋山西(A)、內(nèi)蒙古(B)、遼寧(C)、吉林(D)、黑龍江(E)5個(gè)省份17個(gè)產(chǎn)地共22個(gè)自然居群，每個(gè)居群進(jìn)行GPS定位，并對(duì)收集到的每個(gè)樣本嫩葉保存于裝有硅膠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA提取。地理分布圖及采樣詳細(xì)信息見圖1及表1。

圖1 黃芪采樣地理分布圖

1.2 基因組總DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)法[18]對(duì)所有居群中的每個(gè)單株樣本材料分別進(jìn)行基因組總DNA的提取，利用核酸蛋白檢測(cè)儀及瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取的DNA濃度及質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，將DNA終濃度為調(diào)至50 ng·ul-1，并置于—20℃保存以備后用。

表1 黃芪材料來源信息

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)SSR通用性特征，選用本實(shí)驗(yàn)組所開發(fā)的同科植物甘草的64對(duì)SSR引物[19]，進(jìn)行多態(tài)性的篩選，最終確定10對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好的SSR引物用于試驗(yàn)(表2)，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。PCR擴(kuò)增體系參照劉亞令前期研究[20]，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Fragment AnalyzerTM全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

表2 SSR引物序列信息

1.4 SSR數(shù)據(jù)分析

對(duì)毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增片段大小的判讀并記錄。利用PowerMarker V3.25軟件[21]計(jì)算SSR位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)，利用GenAlEx 6.503軟件[22]進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳分化分析：主要參數(shù)有等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳多樣性(H)、居群內(nèi)近交系數(shù)(Fis)、總居群近交系數(shù)(Fit)、遺傳分化系數(shù)(Fst)、基因流(Nm)、期望雜合度(He)、觀測(cè)雜合度(Ho)；利用GenAlEx 6.503對(duì)居群內(nèi)及居群間分子方差檢驗(yàn)(AMOVA)及主坐標(biāo)分析(PCoA)；利用MEGA 7.0軟件[23]基于居群間Nei’s遺傳距離[24]構(gòu)建UPGMA聚類樹；使用Structure V2.3.4[25]軟件分析居群的遺傳結(jié)構(gòu)，其中群體數(shù)目(K)設(shè)為2～10，對(duì)每個(gè)K值模擬運(yùn)算10次，設(shè)不作數(shù)迭代(length of burn-in period)開始時(shí)的馬爾科夫鏈蒙特卡洛(markov chain monte carlo，MCMC)為10 000次，不作數(shù)迭代后的MCMC為100 000次，將Structure的運(yùn)行結(jié)果導(dǎo)入在線程序STRUCTURE HARVESTER(http://taylor0.biology.ucla.edu/structureharvest/)進(jìn)行最佳群體數(shù)的預(yù)測(cè)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

本試驗(yàn)利用篩選出的10對(duì)SSR引物對(duì)380個(gè)黃芪樣本的基因組DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果在150～500 bp之間(圖2)。對(duì)黃芪10對(duì)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，其結(jié)果如表3所示：10對(duì)引物均具有較高的多態(tài)性，其多態(tài)信息含量范圍(PIC)為0.698(SSR4)～0.930(SSR6)，平均為0.827；等位基因數(shù)(Na)為5.455(SSR1)～11.182(SSR6，SSR9)，平均為7.818；有效等位基因數(shù)(Ne)為3.063～6.527，平均為4.153；Shannon’s信息指數(shù)(I)為1.262(SSR2)～2.040(SSR9)，平均值為1.573；Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.622(SSR2)～0.820(SSR9)，均值為0.706，以上結(jié)果均表明篩選的10對(duì)SSR引物具有較高的多態(tài)信息含量。

2.2 物種遺傳多樣性分析

在物種水平上，分別對(duì)蒙古黃芪與膜莢黃芪進(jìn)行遺傳多樣性分析(表4)，結(jié)果顯示：蒙古黃芪與膜莢黃芪Shannon’s信息指數(shù)(I)分別為I=2.241，I=1.982，平均為2.112；Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)分別為H=0.804，H=0.757，均值為0.781，總體來說兩種黃芪具有較高的遺傳多樣性，其中蒙古黃芪的遺傳多樣性高于膜莢黃芪的遺傳多樣性。此外蒙古黃芪、膜莢黃芪的居群觀測(cè)雜合度均小于期望雜合度，且固定指數(shù)F均大于零，表明兩種黃芪居群存在一定的雜合子缺陷。

注：等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳多樣性(H)、期望雜合度(He)、觀測(cè)雜合度(Ho)、多態(tài)信息含量(PIC)

Note:Na:Average allele number,Ne:Average effective allele number,I:Average shannon′s information index,H:Average Nei′s genetic diversity index,He:Average expected heterozygosity,Ho:Average observed heterozygosity,PIC:Polymorphism information content

注：等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳多樣性(H)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、固定指數(shù)(F)

Note:Na:Average allele number,Ne:Average effective allele number,I:Average shannon's information index,H:Average Nei's genetic diversity index,Ho:Average observed heterozygosity,He:Average expected heterozygosity,F:Fixation index

2.3 物種遺傳分化分析

分別對(duì)兩種黃芪進(jìn)行遺傳分化分析(表5)，結(jié)果顯示：蒙古黃芪與膜莢黃芪居群內(nèi)近交系數(shù)(Fis)分別為0.350±0.132，0.387±0.141；總居群近交系數(shù)(Fit)分別為0.425±0.122，0.421±0.133；居群間遺傳分化系數(shù)(Fst)分別為0.134±0.016，0.058±0.006，表明蒙古黃芪居群間相比膜莢黃芪居群間具有較大程度的遺傳分化，而兩種黃芪種內(nèi)遺傳分化系數(shù)(Fst)分別為0.134±0.016，0.058±0.006，表明蒙古黃芪居群內(nèi)的遺傳分化(13.4%)高于膜莢黃芪居群內(nèi)的遺傳分化(5.8%)；此外，對(duì)兩種黃芪22個(gè)居群總的遺傳分化分析得到居群間的遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.154±0.020，表明黃芪遺傳分化有84.6%來自居群內(nèi)，有15.4%來自居群間；黃芪居群總的基因流Nm為1.719(Nm>1)，表明黃芪居群間基因流處于較高水平。

表5 黃芪種遺傳分化分析

注：居群內(nèi)近交系數(shù)(Fis)、總居群近交系數(shù)(Fit)、遺傳分化系數(shù)(Fst)、基因流(Nm)

Note:Fis:Inbreeding coefficient within population,Fit:Inbreeding coefficient in total population,Fst:Genetic differentiation coefficient,Nm:Gene flow

2.4 居群聚類分析及Mantel檢測(cè)

利用MEGA 7.0軟件基于Nei’s遺傳距離對(duì)黃芪22個(gè)居群進(jìn)行了UPGMA聚類分析(圖3)，結(jié)果顯示：蒙古黃芪與膜莢黃芪首先按物種在0.92處分為兩大類，其中蒙古黃芪這一類中在0.65處又以地域特征分為兩組，第一組中主要是來自內(nèi)蒙古地區(qū)的樣本，第二組則主要是來自山西地區(qū)的樣本。

圖3 基于Nei’s遺傳距離的黃芪物種22個(gè)居群UPGMA聚類分析

2.3 居群主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)是基于居群間遺傳距離得到的一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，繪制的二維或三維坐標(biāo)圖，從而研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的一種可視化方法。為了進(jìn)一步了解黃芪不同居群間在遺傳上的差異及相似性，本試驗(yàn)基于Nei’s遺傳距離對(duì)黃芪22個(gè)居群進(jìn)行PCoA主坐標(biāo)分析，結(jié)果得出占總變異貢獻(xiàn)率較多的三個(gè)主坐標(biāo)特征值共為69.59%，其中第一主坐標(biāo)占總變異的36.5%，第二主坐標(biāo)解釋了總變異的22%，第三主坐標(biāo)解釋了總變異的11.09%。二維坐標(biāo)圖(圖4)結(jié)果顯示：黃芪22居群被分為兩大組，其中，膜莢黃芪5個(gè)居群分為一組，蒙古黃芪的17個(gè)居群分為另一大組，這與UPGMA聚類結(jié)果一致。對(duì)其前三個(gè)主坐標(biāo)作三維主坐標(biāo)分析圖(圖5)，可以看出其分類結(jié)果與二維主坐標(biāo)分析結(jié)果一致，但在二維的基礎(chǔ)上增加了第三主坐標(biāo)，可以從空間位置上更直觀的了解22個(gè)居群間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

圖4 黃芪22居群主坐標(biāo)分析的二維散點(diǎn)圖

圖5 黃芪22居群主坐標(biāo)分析的三維散點(diǎn)圖

2.3 居群遺傳變異分析

遺傳變異水平能夠在一定程度上反映群體在面對(duì)不同氣候及生存環(huán)境下的適應(yīng)能力。本試驗(yàn)利用GenAlEx 6.503軟件對(duì)蒙古黃芪及膜莢黃芪居群間、居群內(nèi)的遺傳變異進(jìn)行分子方差分析(Analysis of Molecular Variance，AMOVA)(表6)，結(jié)果得出：黃芪種間遺傳變異為9%，種內(nèi)居群間的遺傳變異為7%，居群內(nèi)的遺傳變異為83%，表明遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)。這與其遺傳分化分析結(jié)果一致(表4)，即居群間的遺傳分化(15.4%)小于居群內(nèi)的遺傳分化(84.6%)。

2.4 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用STRUCTURE軟件分析黃芪22個(gè)居群遺傳結(jié)構(gòu)(圖6)，其中將分組數(shù)K設(shè)為2-10，每個(gè)K值重復(fù)10次，并對(duì)其作K與Δ K的關(guān)系圖(圖6-A)，當(dāng)Δ K達(dá)到最大值時(shí)(Δ K=737.218)，K=3，表明可以將黃芪22個(gè)居群分為3個(gè)亞群(圖6-B)，其中膜莢黃芪為一個(gè)亞群(綠色)，蒙古黃芪被分為兩個(gè)亞群，一亞群主要包括內(nèi)蒙古地區(qū)的的7個(gè)居群以及山西地區(qū)的3個(gè)居群(紅色)，第二亞群為山西地區(qū)的4個(gè)居群(GPJT，GZQL，GXXT，GDXY)及內(nèi)蒙的兩個(gè)居群(GHDM，GMZL)(藍(lán)色)。此結(jié)果與UPGMA聚類及主坐標(biāo)分析PCoA結(jié)果一致。

表6 黃芪種間及居群分子方差分析(AMOVA)

圖6 黃芪22個(gè)居群的遺傳結(jié)構(gòu)分析

3 討論

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性高低的較好指標(biāo)，一般來說，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，具有高度多態(tài)性；當(dāng)0.25

評(píng)價(jià)藥用黃芪種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對(duì)充分利用開發(fā)及保護(hù)黃芪種質(zhì)具有重要意義，前人曾利用不同的分子標(biāo)記進(jìn)行了不同產(chǎn)地黃芪的遺傳多樣性分析，如張茹[28]利用ISSR對(duì)14個(gè)產(chǎn)地共183個(gè)黃芪樣進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出蒙古黃芪的遺傳多樣性(H=0.336，I=0.497)略高于膜莢黃芪(H=0.311，I=0.466)；王傲[29]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)162個(gè)蒙古黃芪與186個(gè)膜莢黃芪的遺傳多樣性結(jié)果顯示：蒙古黃芪遺傳多樣性(H=0.822)高于膜莢黃芪(H=0.689)；王含彥[30]利用RAPD技術(shù)對(duì)來自四川、河北、山西、甘肅四個(gè)省份的共15份黃芪的遺傳多樣性得出平均Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.225。本試驗(yàn)對(duì)黃芪主產(chǎn)區(qū)山西、內(nèi)蒙、吉林等地區(qū)22個(gè)居群共380個(gè)樣進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果同樣得出黃芪具有豐富的遺傳多樣性(H=2.112，I=0.781)，蒙古黃芪的遺傳多樣性(I=2.241，H=0.804)要高于膜莢黃芪遺傳多樣性(I=1.982，H=0.757)，表明了蒙古黃芪作為膜莢黃芪的變種，在不斷地生長(zhǎng)進(jìn)化中，積累了豐富的等位變異基因，比膜莢黃芪有較高的環(huán)境適應(yīng)能力，具有豐富的遺傳育種資源及進(jìn)化潛力。而本試驗(yàn)得到的黃芪遺傳多樣性相比前人的研究數(shù)值都較高，可能是由于本試驗(yàn)選用的試驗(yàn)材料多，產(chǎn)地跨域廣，使其具有高的遺傳多樣性水平。

本試驗(yàn)基于Nei’s遺傳距離，采用非加權(quán)算數(shù)平均法(UPGMA法)進(jìn)行了物種(居群)間聚類分析，結(jié)果得出藥材黃芪首先是按物種明顯劃分，此聚類結(jié)果與對(duì)其表型觀測(cè)結(jié)果一致，而在同種物種中居群間的聚類較混雜，沒有完全的按地理來源進(jìn)行聚類，如蒙古黃芪中來自山西的3個(gè)居群(GSJP，GLCW，GPJY)與來自內(nèi)蒙的7個(gè)居群聚為一類，另外來自山西的4個(gè)居群(GPJT，GZQL，GXXT，GDXY)及內(nèi)蒙的2個(gè)居群(GHDM，GMZL)聚為一類?？赡苁且?yàn)閮?nèi)蒙及山西地區(qū)都是藥材黃芪的道地產(chǎn)區(qū)，由于人為原因等使兩地區(qū)種質(zhì)間會(huì)發(fā)生一定的種質(zhì)交流，且兩地間的地理環(huán)境差異較小，在生長(zhǎng)過程中可能會(huì)發(fā)生同等分化及變異。

蒙古黃芪及膜莢黃芪物種間(內(nèi))、居群間(內(nèi))進(jìn)行分子方差分析結(jié)果顯示，遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)(83%)。根據(jù)在黃芪傳粉特性的研究中表明，蒙古黃芪和膜莢黃芪均為自交不親和的異花授粉植物[31-32]，這一特性使得黃芪在生長(zhǎng)繁育的過程中，居使得群內(nèi)部發(fā)生較多的基因交流及變異，因此，這可能是導(dǎo)致黃芪遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)的主要原因。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)所選用的10對(duì)黃芪同科植物的SSR引物能夠有效的顯示黃芪基因多態(tài)性，可用于黃芪遺傳多樣性研究。對(duì)蒙古黃芪、膜莢黃芪22個(gè)居群共380個(gè)樣本進(jìn)行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果得出黃芪具有較高程度的遺傳多樣性水平，其中蒙古黃芪遺傳多樣性水平要高于膜莢黃芪，遺傳分化程度高于膜莢黃芪。兩種黃芪的遺傳背景相對(duì)單一，且遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)；UPGMA聚類分析及STRUCTURE群體遺傳分析可將其分為3組，分類結(jié)果具有一定的地域性。以上研究結(jié)果對(duì)藥用黃芪種質(zhì)資源的有效利用、遺傳多樣性的保護(hù)及育種開發(fā)優(yōu)質(zhì)黃芪種質(zhì)資源提供一定的理論基礎(chǔ)。