侯愛香，李珂，肖愈，李宗軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學a.食品科學技術學院；b.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室；c.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，長沙410128)

0 引言

OPO被作為一種顯著有效的功能成分被廣泛添加到嬰幼兒配方乳粉中，通常以OPO乳脂粉的形式添加，用棕櫚油和酶制成富含OPO（40%）的植物乳脂油，然后加入乳糖等成分，經(jīng)乳化、干燥，制成粉劑，即富含OPO的植物乳脂粉（簡稱OPO乳脂粉）。對照國家食品安全標準GB1488-2012年食品營養(yǎng)補充使用標準，嬰幼兒配方奶粉OPO的添加量為24～96 g/kg，在此范圍內，多少濃度的OPO能更好的促進益生菌的生長并未明確。本研究以24月齡幼兒的糞便為菌源，研究不同濃度OPO乳脂粉24 h體外發(fā)酵過程中主要腸道微生物的變化情況，對雙歧桿菌、總厭氧菌、擬桿菌、梭狀芽孢桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌和總需氧菌進行計數(shù)，并計算對應的益生元指數(shù)PI和B/E值，評價不同濃度OPO-P的益生效果。

1 實驗

1.1 材料

OPO乳脂粉（OPO-P）：又稱富含OPO的植物乳脂粉，其中有質量分數(shù)50%植物精煉油（該植物精煉油為含有質量分數(shù)40%的OPO棕櫚油）；乳糖質量分數(shù)為41.63%；蛋白質質量分數(shù)為4.21%；水份質量分數(shù)3.72%；穩(wěn)定劑、乳化劑、維生素、和礦物質等成分合計為0.44%。

糞便樣選擇主要參考文獻[1-2]中方法。選擇斷奶半年，均未食用OPO配方奶粉的24月齡3名幼兒為志愿者，幼兒2月內未服用抗生素，無腸道病史，采集3名志愿者的新鮮糞便。

含氮基礎發(fā)酵液為空白對照的基礎發(fā)酵液，其配方如下[3]：1 L水中含2 g酵母粉，2 g蛋白胨，2 g NaHCO3，4 m L質量濃度為0.025 g/100 m L的刃天青，2 m L吐溫-80，0.5 g膽汁酸鹽，0.5 g L-半胱氨酸，0.l g N aC l，0.05 g氯化血紅素，0.04 g K2HPO4，0.01 g M g-SO4-7H2O，0.01 g CaC l2.7H2O，10μL VK。

傳統(tǒng)培養(yǎng)技術采用的選擇性培養(yǎng)基：計數(shù)總厭氧菌的培養(yǎng)基為W ilkins and Chalgren瓊脂[4]；計數(shù)雙歧桿菌的培養(yǎng)基為BBL培養(yǎng)基[5]；計數(shù)乳桿菌的培養(yǎng)基為R ogosa培養(yǎng)基[6]；計數(shù)梭狀芽孢桿菌的培養(yǎng)基為Sulfite-polym yxin-milk瓊脂[7]；擬桿菌用擬桿菌礦物鹽瓊脂計數(shù)[8]；腸桿菌用紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂計數(shù)[9]；總需氧菌用營養(yǎng)瓊脂計數(shù)[10]。

1.2 儀器與設備

TP-213分析天平，SP500高壓蒸氣滅菌鍋，SW-CJ-2D超凈工作臺，YQX-I厭氧培養(yǎng)箱，SPX-250B-Z恒溫生化培養(yǎng)箱，C-1厭氧產(chǎn)氣袋，C-43圓底立式培養(yǎng)袋，旋渦振蕩器，XK 97-A菌落計數(shù)器。

1.3 方法

1.3.1 菌源處理

將所取糞便樣在厭氧操作箱中迅速解凍，將baby1，baby2和baby3糞樣各取10 g混勻，記為mixbaby，將mixbaby加入90 m L PBS緩沖液(pH=7.0)中稀釋，加無菌玻璃珠渦旋振蕩，使糞便充分分散。稀釋后的糞液用4層無菌紗布過濾，除去濾渣，取稀釋后的濾液為菌源，整個處理過程在1 h內完成。

1.3.2 OPO乳脂粉的厭氧發(fā)酵

通過查閱喬來艷[11]和XinZhang[2]等人做體外發(fā)酵研究的文獻，將他們所用的體外發(fā)酵方法進行改進，用于OPO乳脂粉對人體腸道微生物的影響研究。在37℃條件下，模擬人體腸道環(huán)境，配置對照組基礎發(fā)酵液和實驗組OPO乳脂粉發(fā)酵液，加入采集處理好的菌源，進行間歇式靜態(tài)厭氧發(fā)酵24 h，監(jiān)測各發(fā)酵階段（0，4，8，12，24 h）微生物指標，對總厭氧菌、擬桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌和總需氧菌進行計數(shù)。

將菌源按接種量10%的量，分別加入空白組發(fā)酵液和實驗組發(fā)酵液中。研究以含氮基礎發(fā)酵液為空白組，以添加了不同濃度OPO-P的發(fā)酵液為實驗組。其中實驗組OPO的添加量參考國家食品安全標準GB1488-2012年食品營養(yǎng)補充使用標準“嬰幼兒配方奶粉OPO的添加量為24～96 g/kg”的要求，再結合實際沖泡奶粉時，一般常用的稀釋比為4.5 g奶粉兌30 m L水，分別以國標上限96 g/kg，中間質量分數(shù)50 g/kg和下限24 g/kg的添加量，在含氮基礎發(fā)酵液中加入OPO植物乳脂粉為實驗組，結合稀釋比在發(fā)酵液中折算成OPO的質量濃度，分別為3.6，7.5，14.4 m g/m L，分別記為3.6 m g/m L組，7.5 m g/m L組，14.4 m g/m L組。將空白組和各濃度實驗組發(fā)酵液分別分裝在Hungate厭氧滾管，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中發(fā)酵，所有試驗都進行3次生物學重復。

1.3.3 微生物檢測計數(shù)

參考Palfram an等人[12]和江南大學趙蘭濤[13]所用的腸道微生物計數(shù)方法，用傳統(tǒng)的稀釋平板法，選取合適梯度稀釋液100μL均勻涂布在7種選擇性培養(yǎng)基上。涂布后總厭氧菌、擬桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌在37℃厭氧培養(yǎng)48～96 h后分別計數(shù)；乳酸桿菌、腸桿菌和總需氧菌在37℃,培養(yǎng)48 h后分別計數(shù)。

1.3.4 益生元指數(shù)計算

評價腸道菌群是否正常、平衡的重要指標有益生元指數(shù)，眾多研究者采納Palfram an等人的計算方法[12]，其計算公式如下：

式中：T，Bif，L，Bac，C分別指取樣時發(fā)酵液中總菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)、擬桿菌數(shù)、梭狀芽孢桿菌數(shù)量和接種時發(fā)酵液中總菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)、乳酸桿菌屬、擬桿菌數(shù)、梭狀芽孢桿菌數(shù)量的比值。

1.3.5 B/E值的計算

B/E值為腸道內雙歧桿菌和腸桿菌數(shù)量之比，計算公式為B/E=Bif/Ent。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

研究所有試驗均進行3次生物學重復，每個樣品進行了3次測定，數(shù)據(jù)通過Excel 2013軟件完成統(tǒng)理，結果以SPSS.21.0軟件的單因素分析方法（ANOVA）進行顯著性分析，兩兩比較采用最小差異法（LSD）,檢驗性水準a=0.05。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌和乳桿菌變化結果

雙歧桿菌和乳酸桿菌通常作為腸道微生物有益菌的代表，通過添加不同質量濃度的OPO-P進行24 h體外發(fā)酵，將兩類菌的計數(shù)結果列表，如表1所示。

表1 體外發(fā)酵過程中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量統(tǒng)計結果 cfu·m L-1

表2 體外發(fā)酵過程中擬桿菌、梭狀芽孢桿菌和腸桿菌的數(shù)量統(tǒng)計結果 cfu·m L-1

由表1可以看出，所有發(fā)酵液，雙歧桿菌數(shù)都存在先上升后下降的趨勢。3個不同濃度OPO-P的添加，都能促進雙歧桿菌的生長繁殖，在發(fā)酵的前8 h內，雙歧桿菌數(shù)量與OPO-P的添加量成正比，添加的OPO-P濃度越大雙歧桿菌的數(shù)量越多，在發(fā)酵8 h的時候各組發(fā)酵液的雙歧桿菌數(shù)都達到最大值；在8～24 h的發(fā)酵階段，所有發(fā)酵液中雙歧桿菌數(shù)量都呈不同程度的下降，14.4 m g/m L濃度組發(fā)酵液中雙歧桿菌數(shù)下降幅度最大。3個不同濃度OPO-P的添加，都能大幅度的促進雙歧桿菌的生長繁殖，但促進作用與OPO-P的添加量沒有表現(xiàn)出特定的量效規(guī)律。同時，0 h的乳酸桿菌初始菌數(shù)水平較為一致，沒有顯著性差異。添加了OPO-P的3個發(fā)酵液乳酸桿菌數(shù)均呈先上升后下降趨勢，各組發(fā)酵液乳酸桿菌數(shù)均在12 h時達到最大，3個添加了OPO-P的發(fā)酵液在發(fā)酵前12 h內呈線性上升趨勢，12 h之后，均呈不同程度的下降趨勢，3.6 m g/m L組乳酸桿菌的下降幅度略大于14.4 m g/m L組和7.5 m g/m L組；但空白基礎發(fā)酵液整個發(fā)酵過程乳酸桿菌數(shù)均呈遞減趨勢。3個不同濃度OPO-P的添加，都能促進乳酸桿菌的生長繁殖，但促進作用沒有表現(xiàn)出特定的量效規(guī)律。

2.2 擬桿菌和梭狀芽孢桿菌變化結果

擬桿菌、梭狀芽孢桿菌和腸桿菌通常作為腸道菌群中無益菌群的代表，通過添加不同濃度OPO-P進行24 h體外發(fā)酵，三類菌計數(shù)結果如表2所示。

由表2可以看出，擬桿菌、梭狀芽孢桿菌和腸桿菌的菌數(shù)初始水平在各組中均無顯著性差異，擬桿菌和腸桿菌在4 h階段，各組發(fā)酵液菌數(shù)水平也無明顯差異。但后期發(fā)現(xiàn)，OPO-P對擬桿菌和梭狀芽孢桿菌均有一定的抑制作用，空白基礎發(fā)酵液這兩菌各階段的數(shù)量均高于實驗組發(fā)酵液，但抑制作用與OPO-P添加量沒有明顯的量效規(guī)律。OPO-P的添加在整個發(fā)酵過程中對腸桿菌數(shù)量沒有表現(xiàn)出一致的抑制或促進作用，在4 h和8 h階段，能促進腸桿菌的生長繁殖，之后呈現(xiàn)抑制作用，使腸桿菌數(shù)量呈不同程度的下降。

2.3 總厭氧菌與總需氧菌的變化結果

腸道微生物包括厭氧菌和需氧菌，通過添加不同質量濃度的OPO-P進行24 h體外發(fā)酵，將兩類菌的計數(shù)結果列表，如表3所示。

由表3可以看出,體外發(fā)酵24 h的過程中，所有發(fā)酵液中總厭氧菌數(shù)量與時間呈正相關，隨著時間的延續(xù)不斷遞增，且發(fā)酵前8h階段的遞增速度大于后期，添加了OPO-P的試驗組均高于空白的基礎對照組，添加量對總厭氧菌數(shù)量影響沒有明顯的量效規(guī)律。所有發(fā)酵液的總需氧菌總體呈上升趨勢，但在前8 h時呈線性上升趨勢，并在8 h時總需氧菌數(shù)量達到最大，8 h后呈不同程度的下降趨勢。

2.4 OPO-P添加量對PI值的影響

由于各個實驗組不可避免的有接種不均勻和初始菌數(shù)不一致的情況，單獨通過對各類菌群不同發(fā)酵時間段的菌落數(shù)進行比較來衡量營養(yǎng)素的益生作用存在偏差。因此，21世紀初Palframan等人提出了益生元指數(shù)PI，他們通過比較PI值的大小，定量描述試驗中各類低聚糖的益生效果。本研究借鑒使用PI指標，用以評價不同質量濃度OPO-P與嬰幼兒腸道微生物互作的益生作用。

表3 體外發(fā)酵過程中總厭氧菌、總需氧菌的數(shù)量統(tǒng)計結果 m L-1

由圖1可以看出，基礎發(fā)酵液空白組的PI值為負，不呈現(xiàn)益生作用。添加了不同濃度OPO-P的試驗組的益生元指數(shù)PI，都呈先上升后下降趨勢，且均在8 h階段達到最大值，說明3個質量濃度OPO-P的添加，都有明顯的益生作用，分批一次培養(yǎng)過程中，都在8 h階段益生效果最好。綜合比較，發(fā)現(xiàn)各時間段益生元指數(shù)最高的一組均為7.5 m g/m L組，以此評判該組益生效果最好，并在8 h階段PI值最大，達到2.73。研究中，益生效果與OPO-P的添加量不成嚴格的正比關系。這結果與微生物計數(shù)中雙歧桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)的結果并不完全一致。在雙歧桿菌計數(shù)過程中，由表1可以看出，發(fā)酵8 h階段，14.4 m g/m L組的雙歧桿菌數(shù)量最多，發(fā)酵12 h和24 h階段，14.4 m g/m L組的乳酸桿菌數(shù)量最多，但在圖1中PI在8,12 h和24 h階段都是7.5 m g/m L組最大，因為PI值還與這些時間段的擬桿菌數(shù)和梭狀芽孢桿菌數(shù)相關。

圖1 不同質量濃度OPO-P的益生元指數(shù)（PI）

圖2 不同質量濃度OPO-P的B/E值

2.5 OPO-P添加量對B/E值的影響

借鑒Van Der W aaij等以將B/E值作為腸道菌群定殖抗力指標的研究，本研究用B/E值反映幼兒腸道菌群結構，作為益生效果評價的補充指標。將表1中雙歧桿菌數(shù)量和表2中腸桿菌數(shù)量帶入計算公式，得B/E值如圖2所示。

若B/E＞1，表示腸道菌群中雙歧桿菌的水平高于腸桿菌科的水平；若B/E≤1，則表示腸道菌群中雙歧桿菌的水平低于腸桿菌科的水平，B/E越大說明腸道菌群越平衡，定殖能力越強，相應的益生效果越好。由圖2可以看出，空白組的B/E值在發(fā)酵的各個階段都小于添加了OPO-P的試驗組，說明沒有添加OPO-P的基礎發(fā)酵液體系中雙歧桿菌沒能迅速形成優(yōu)勢菌。但在添加了OPO-P的所有實驗組中，B/E值都遠遠大于1，說明糞便樣品作為菌源，在發(fā)酵過程中雙歧桿菌迅速成為優(yōu)勢菌，占有明顯的優(yōu)勢地位，均顯示出明顯的改善腸道菌群的作用。但這種益生效果與OPO-P濃度的量效關系不固定，在0～8 h階段14.4 m g/m L組的B/E值最大，表現(xiàn)的益生效果最好，而最后12～24 h的階段7.5 m g/m L組的B/E值最大，表現(xiàn)出最好的益生效果。

3 討論

3.1 腸道微生物的檢測

本研究采用的傳統(tǒng)培養(yǎng)技術對腸道微生物中典型的有益菌、無益菌進行培養(yǎng)計數(shù)。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，設備要求簡單，實驗操作技術要求不高，試驗成本不貴，試驗周期也不長，數(shù)據(jù)直觀，數(shù)據(jù)處理簡單，是很多研究腸道微生物的學者經(jīng)常采用的方法[14]。趙敏[15]、李艷莉[16]和曾艷華[17]等人先后用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術研究了山萊英-熟地黃藥對與腸道菌群的相互作用、低聚糖對嬰兒腸道菌群的益生功能和中性大蒜果聚糖調節(jié)腸道菌群功能。但是這種方法也有很多局限，一是能培養(yǎng)的微生物種類有限，腸道微生物的類群多樣，不能準確的反映腸道菌群的真實情況；二是只能對樣品體系中的活菌進行計數(shù)，數(shù)據(jù)有所遺漏。因此，本研究中厭氧培養(yǎng)的擬桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌的總數(shù)并不等于測得的總厭氧菌數(shù)，需氧培養(yǎng)的乳酸桿菌和腸桿菌之和也不等于測得的總需氧菌數(shù)。再此基礎上，為克服傳統(tǒng)培養(yǎng)技術的缺陷，有研究者改良腸道微生物計數(shù)的方法，如謝旻皓[18],張鑫[19]Vernazza[20]和Sánchez-Patán[21]等人采用FISH(fluorescence in situ hybridization)計數(shù)技術，來檢測腸道菌群的變化情況。隨著微生物檢測技術的發(fā)展，越來越多的研究者采用高通量測序的方法研究腸道微生物[22-23]。吳根梁[24]等人采用Illum ina M iSeq平臺高通量測序研究茶多酚對腸道微生物的組成、多樣性的影響，M inhao X ie等人[25]，利用16S rRNA高通量測序研究苦丁茶的有效成分二咖啡?？鼘幩狍w外發(fā)酵對腸道微生物的影響；陳蕾[26]等人通過傳統(tǒng)培養(yǎng)技術之后進一步采用PCR-TGGE技術檢測苦蕎對腸道微生物多樣性的影響。因此，可以借鑒現(xiàn)代測序技術進一步研究OPO-P或OPO對幼兒腸道微生物的影響作用。

3.2 益生效果的評價

雙歧桿菌，乳酸桿菌通常作為腸道微生物中的有益菌，腸桿菌、梭狀芽胞桿菌和擬桿菌通常會被認為是無益菌，某種物質若能促進雙歧桿菌或乳酸桿菌的大量生長，或能抑制腸桿菌、梭狀芽胞桿菌和擬桿菌的生長，通常會被認為具有益生效果，能夠調節(jié)腸道微生物，促進腸道菌群平衡，彭春喜[27]，張寧[28]等人先后采用這種方法評價膳食纖維和大蒜果聚糖的益生功效。但這種方法無法避免接種不均勻、初始菌數(shù)不一致和體系中總菌數(shù)存在差異的實際問題，且無法確定營養(yǎng)素對有益菌的促進作用是否大于對無益菌的抑制作用，有益菌是否形成優(yōu)勢菌定殖于腸道。因此，研究者們以B/E值、PI值等指數(shù)來評價益生效果，如Palfram an等人[12],用PI值評價低聚果糖的益生效果，趙蘭濤等人[13],以PI值評價全谷物對腸道菌群的益生作用，Van Der W aaij等人[29],用B/E值衡量益生效果。此外，曾艷華[17],改良Palfram an等人的計算方法，利用益生元活性分數(shù)來衡量益生效果，其計算公式如下：“益生元活性分數(shù)=[(24 h益生元培養(yǎng)基中的益生菌-0h益生元培養(yǎng)基中的益生菌)/(24 h葡萄糖基礎培養(yǎng)基中的益生菌-0h葡萄糖基礎培養(yǎng)基中的益生菌)]-[(24 h益生元培養(yǎng)基中的腸桿菌-0h益生元培養(yǎng)基中的腸桿菌)/(24 h葡萄糖基礎培養(yǎng)基中的腸桿菌-0h葡萄糖基礎培養(yǎng)基中的腸桿菌]”。其計算公式中的益生菌以雙歧桿菌和乳酸桿菌來計算，腸桿菌以大腸桿菌和腸球菌來計算。

此外，大量腸道微生物與膳食因子互作的研究通常還以代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸以及乳酸作為衡量膳食因子益生效果的指標之一。以增加短鏈脂肪酸產(chǎn)量特別是丁酸、乳酸產(chǎn)量，改變腸道p H值，作為益生指標，如Jelena Vu levic等人[30]，則將代謝產(chǎn)物乳酸納入影響因素，以益生元效果指數(shù)（M easurement of prebiotic effect M PE）來計算益生效果。本研究雖然結合了微生物計數(shù)、PI值和B/E值進行益生效果評價，還可以結合更多合適的指標進行進一步評價。

4 結論

本研究通過對腸道微生物中傳統(tǒng)的有益菌和無益菌進行分別計數(shù)，并結合益生元評價指標PI值和B/E值評估了國標范圍內不同質量濃度OPO-P的益生效果，兩者結合，比采用單一評價方式得出的結論更準確。研究發(fā)現(xiàn)不同質量濃度OPO-P都能有效調節(jié)腸道菌群，但7.5 m g/m L組益生效果最好，為嬰幼兒配方奶粉中OPO-P的高效添加提供了基礎研究數(shù)據(jù)。但本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術對微生物進行計數(shù)有一定的局限性，益生效果評價的指標也有限，要獲得OPO-P或OPO益生效果更全面的評價，一方面可以采用高通量測序技術對微生物數(shù)量變化進行監(jiān)測分析，另一方面還可以結合腸道微生物的p H值環(huán)境，短鏈脂肪酸、有機酸等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和種類等指標進行更全面的評價。