陳磊，田芳，毛穎異，蔡小堃，楊穎，莊柯瑾，馮曉涵，趙艷榮，張微

（1.雅培營養(yǎng)品上海研發(fā)中心，上海200233；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱

150030）

0 引言

配方乳粉的基質(zhì)大部分由乳蛋白構(gòu)成，而乳蛋白的形式多種多樣，如全脂液乳，脫脂液乳，乳粉等。這些乳制品均是新鮮牛乳通過不同熱處理工藝加工而成。這些工藝以及存儲(chǔ)的時(shí)間導(dǎo)致生產(chǎn)的乳制品中各營養(yǎng)成分降低與降解產(chǎn)物增加，即新鮮度的降低[1]。同時(shí)，這些工藝會(huì)不同程度地影響乳制品中美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致氨基酸等小分子營養(yǎng)物質(zhì)的損失以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量的升高。因此，評(píng)估乳品中可利用氨基酸及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的水平對(duì)于評(píng)價(jià)乳制品的新鮮度具有重要意義。

美拉德反應(yīng)是氨基酸和還原糖之間發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)[2-3]。美拉德反應(yīng)會(huì)造成氨基酸（賴氨酸、精氨酸、蛋氨酸等）利用率的降低及不可消化利用的氨基酸封閉產(chǎn)物（呋喃素，羧甲基賴氨酸（CM L）等）的生成[4-5]。美拉德反應(yīng)主要分為三個(gè)階段：初級(jí)、高級(jí)和終級(jí)階段。初級(jí)階段主要生成Am adori重排產(chǎn)物，高級(jí)階段主要生成糖基化最終產(chǎn)物，終級(jí)階段則會(huì)聚合產(chǎn)生類黑精大分子[6-7]。呋喃素是Am adori重排化合物的降解產(chǎn)物[8]，常被作為檢測(cè)美拉德反應(yīng)初級(jí)階段的指針化合物[9]。而CM L是美拉德反應(yīng)高級(jí)階段的主要產(chǎn)物之一，在該階段更能代表蛋白的破壞程度[10]。美拉德反應(yīng)終級(jí)階段產(chǎn)物一般不會(huì)在乳品中出現(xiàn)，因此這里沒有對(duì)該階段進(jìn)行評(píng)估。蛋白質(zhì)中氨基酸組分會(huì)隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行逐漸損失，可利用賴氨酸由于在乳蛋白產(chǎn)品中含量較高，并且與還原糖類反應(yīng)活性較強(qiáng)，常被用作評(píng)價(jià)牛乳制品新鮮程度及營養(yǎng)損失的指標(biāo)[11-12]。所以，同時(shí)檢測(cè)可利用賴氨酸，呋喃素及CM L的含量能夠更準(zhǔn)確的評(píng)估乳制品的新鮮度。對(duì)于乳及乳制品中呋喃素的檢測(cè)，反相高效液相色譜紫外檢測(cè)（RP-HPLC-UV）方法為最常見的方法之一[13-15]。Kulm yrzaev等也使用表面熒光光譜法對(duì)牛奶中的呋喃素的含量進(jìn)行快速無損檢測(cè)[16]。乳及乳制品中CM L的檢測(cè)國外研究也多見報(bào)道[7,10,17-18]，分析方法包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）、HPLC、氣相色譜法（GC）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-M S）及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-M S/M S）等。對(duì)于乳及乳制品中可利用賴氨酸含量的監(jiān)測(cè)，使用鄰苯二甲醛（OPA）或氯甲酸芴甲酯（FMOC）衍生后進(jìn)行HPLC分析是常用的分析檢測(cè)方法[19]。同時(shí)檢測(cè)CM L及可利用賴氨酸含量的方法國內(nèi)外還未見報(bào)道。

本研究的目的是建立一套全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)乳制品中可利用賴氨酸保留程度與美拉德反應(yīng)水平的方法。使用RP-HPLC-UV建立了美拉德反應(yīng)早期產(chǎn)物呋喃素的檢測(cè)方法；使用FMOC衍生后經(jīng)反相高效液相色譜熒光檢測(cè)（RP-HPLC-FLD）建立同時(shí)檢測(cè)美拉德反應(yīng)高級(jí)產(chǎn)物CM L及可利用賴氨酸含量的方法。

1 材料與方法

1.1 樣品

巴氏殺菌全脂牛奶（3.4%蛋白，5.2%乳糖）、巴氏殺菌脫脂牛奶（3.4%蛋白，5.2%乳糖）、超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）全脂牛奶（3.2%蛋白，4.7%乳糖）、超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）脫脂牛奶（3.6%蛋白，5.1%乳糖）為市售產(chǎn)品；低熱脫脂乳粉（LH-SM P，34%蛋白，52%乳糖）、中熱脫脂乳粉（MH-SM P，34%蛋白，52%乳糖）購自蛋白原料供應(yīng)商。

1.2 試劑耗材與儀器

濃鹽酸（37%）、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸、硼酸鈉、硼氫化鈉及檸檬酸鈉均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；50 w t%NaOH溶液及FMOC購于Sigm a-Aldrich；戊烷、乙酸乙酯、異丙醇及乙腈均為色譜純，購于賽默飛世爾科技公司；L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司；呋喃素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品購于IR ISBIOTECH GmbH（Marktredwitz,Germ any）；CM L標(biāo)準(zhǔn)品購于TRC Canada(Toronto,Canada)。

1260 HPLC高效液相色譜儀，配置紫外可見及熒光檢測(cè)器，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 呋喃素的分析測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2 g左右（精確至0.0001 g）乳粉樣品于燒杯中，加水至約25 g，充分混勻。準(zhǔn)確稱取2 g左右（精確至0.0001 g）復(fù)溶乳粉樣品（液態(tài)乳樣品直接稱取2 g左右）于55 m LPTFE微波消解管中，加入8 m L鹽酸溶液（6 N），渦旋混勻后，充氮5 m in后立刻旋緊蓋子，于110℃烘箱中加熱20 h。取出冷卻至室溫后，混勻。量取2 m L于15 m L離心管中，加入5 m L檸檬酸鈉溶液（0.7 M），混勻后經(jīng)0.45μm尼龍濾膜過濾進(jìn)行HPLC分析。使用呋喃素鹽酸鹽為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。使用安捷倫1260 HPLC配置紫外可見檢測(cè)器進(jìn)行分析。色譜柱為YMC-Pack ODS-AQ(250 mm×4.6 mm I.D.,5μm)，柱溫20℃,進(jìn)樣量5μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。流動(dòng)相A為0.02 m o l/L磷酸二氫鉀磷酸緩沖液，p H 2.9；流動(dòng)相B為磷酸二氫鉀磷酸緩沖液（0.02 m ol/L,pH 2.9）∶異丙醇∶乙腈=26∶7∶7。梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC分析呋喃素梯度洗脫程序

1.3.2 CM L和賴氨酸的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.2 g左右（精確至0.0001 g）乳粉樣品或0.5 g左右（精確至0.0001 g）液態(tài)乳于50 m L PTFE微波消解管中，加入3.5 m L硼酸鈉緩沖液（0.2 mol/L,p H 9.5），混勻，再加入2 m L硼氫化鈉溶液（1 m o l/L溶于0.1 mol/L NaOH），室溫下靜置反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入10 m L濃鹽酸（37%）及5 m L水，渦旋混勻。充氮5 m in后立刻旋緊蓋子，于110℃烘箱中加熱20 h。取出冷卻至室溫后，使用50 w t%NaOH溶液調(diào)p H至8-9之間，加水至30 m L，樣液經(jīng)0.45μm尼龍濾膜過濾后以進(jìn)行下述衍生反應(yīng)。測(cè)定賴氨酸時(shí)，消解液需根據(jù)樣品中氨基酸的含量進(jìn)行適應(yīng)倍數(shù)的稀釋以確保賴氨酸的衍生完全。加入250μL硼酸鈉緩沖液（0.2 m ol/L，p H 9.5）于玻璃試管中，再加入50μL上述經(jīng)過濾的樣品溶液（或CM L及賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液），渦旋混勻。加入250μL FMOC衍生試劑溶液（10 mg/m L溶于乙腈中，現(xiàn)用現(xiàn)配），渦旋混勻后，于室溫下靜置反應(yīng)10 m in。反應(yīng)液經(jīng)0.45μm尼龍濾膜過濾于進(jìn)樣小瓶中，加入500μL戊烷/乙酸乙酯（v戊烷∶v乙酸乙酯=9∶1），渦旋2次，每次10 s，以將過量的FMOC衍生試劑萃取至上層有機(jī)相，下層水相則含有經(jīng)衍生的CM L和賴氨酸。此進(jìn)樣小瓶直接進(jìn)行HPLC分析。CM L及賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過與樣品相同的衍生步驟，進(jìn)行HPLC分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用安捷倫1260 HPLC配置熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析。色譜柱為Zorbax SB C 18(250 mm×4.6 mm I.D.,5μm)，柱溫20℃,進(jìn)樣量5μL，激發(fā)波長(zhǎng)為262 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為310 nm。流動(dòng)相A為0.05 m o l/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.0）∶乙腈=825∶175；流動(dòng)相B為水∶乙腈=1∶4。梯度洗脫程序見表2。

表2 HPLC分析CML及賴氨酸梯度洗脫程序 m o l/L

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)來評(píng)估兩個(gè)樣本間數(shù)據(jù)差異的顯著性，采用單因素ANOVA評(píng)估多個(gè)樣本間數(shù)據(jù)差異的顯著性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 呋喃素分析方法的驗(yàn)證

本研究對(duì)呋喃素分析方法的線性、準(zhǔn)確性、精密度及回收率進(jìn)行了全面的驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示本方法在呋喃素含量0.840μg/m L～8.16μg/m L的分析范圍內(nèi)線性良好（r＞0.999）。選用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部乳粉質(zhì)控樣品為基質(zhì)，3天6次測(cè)定結(jié)果的平均值為43.6 m g/100g。選用此本底值的50%、100%、及200%3個(gè)不同的呋喃素濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，以驗(yàn)證此方法的準(zhǔn)確性、回收率及精密度，驗(yàn)證結(jié)果見表3。3個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)回收率均在90%～110%之間，RSD%均小于5%，顯示此方法具有良好的準(zhǔn)確性、回收率及精密度。

表3 呋喃素分析方法的準(zhǔn)確性、回收率及精密度的驗(yàn)證結(jié)果

2.1.2 CM L及賴氨酸分析方法優(yōu)化及驗(yàn)證

2.1.2.1 同時(shí)檢測(cè)CM L及賴氨酸方法的優(yōu)化

為提高檢測(cè)效率，本研究在D rusch及呂瑩果等[10,19]報(bào)道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以同時(shí)檢測(cè)CM L及賴氨酸。Dunn等[20]發(fā)現(xiàn)蛋白酸水解過程中，美拉德反應(yīng)早期產(chǎn)物果糖賴氨酸等可以進(jìn)一步生成高級(jí)產(chǎn)物CM L，致使檢測(cè)結(jié)果偏高。本實(shí)驗(yàn)中，將樣品在酸水解前經(jīng)硼氫化鈉將果糖賴氨酸等還原為糖醇賴氨酸，以抑制其在之后的酸水解過程向CM L的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而確保CM L的測(cè)定值更接近真實(shí)值。OPA及FMOC是比較常用的兩種氨基衍生試劑。OPA不能與二級(jí)氨基反應(yīng)，且衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，需衍生后立即進(jìn)行樣品分析，故本研究選用FMOC做為CM L和賴氨酸的衍生試劑。FMOC能同時(shí)與一級(jí)及二級(jí)氨基反應(yīng)，所得衍生產(chǎn)物較OPA穩(wěn)定，但其試劑本身及水解產(chǎn)物有熒光，會(huì)對(duì)之后的色譜分離產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。為消除此干擾，衍生后的樣品溶液使用戊烷/乙酸乙酯（v戊烷∶v乙酸乙酯=9∶1）進(jìn)行萃取，將多余的FMOC衍生試劑萃取至上層戊烷層。將含CM L及賴氨酸FMOC衍生產(chǎn)物的下層水相進(jìn)行HPLC分析，可以得到背景清晰的圖譜。

2.1.2.2 分析方法的驗(yàn)證

本研究對(duì)方法分析CM L的線性、準(zhǔn)確性、精密度及回收率進(jìn)行了全面的驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示本方法在CM L含量0.0415～2.85μg/m L的分析范圍內(nèi)線性良好（r＞0.999）。選用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部乳粉質(zhì)控樣品為基質(zhì)，3天6次測(cè)定結(jié)果的平均值為8.03 m g/100g。選用此本底值的30%及60%兩個(gè)不同CM L濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，以驗(yàn)證此方法的準(zhǔn)確性、回收率、及精密度，驗(yàn)證結(jié)果見表4。兩個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)回收率均在90%～110%之間，RSD%均小于5%，顯示此方法具有良好的準(zhǔn)確性、回收率及精密度。

表4 方法分析CML的準(zhǔn)確性、回收率及精密度的驗(yàn)證結(jié)果

本研究對(duì)方法分析賴氨酸的線性、準(zhǔn)確性、精密度及回收率進(jìn)行了全面的驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示本方法在賴氨酸含量0.214μg/m L～19.2μg/m L的分析范圍內(nèi)線性良好（r＞0.999）。選用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部乳粉質(zhì)控樣品為基質(zhì)，3天6次測(cè)定結(jié)果的平均值為774 m g/100g。選用此本底值的30%及60%兩個(gè)不同的賴氨酸濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，以驗(yàn)證此方法的準(zhǔn)確性、回收率及精密度，驗(yàn)證結(jié)果見表5。兩個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)回收率均在90%～110%之間，RSD%均小于5%，顯示此方法具有良好的準(zhǔn)確性、回收率及精密度。

表5 方法分析賴氨酸的準(zhǔn)確性、回收率及精密度的驗(yàn)證結(jié)果

2.2 乳制品的測(cè)定與分析

采用所建的方法測(cè)試巴氏殺菌全脂牛奶、巴氏殺菌脫脂牛奶、UHT全脂牛奶、UHT脫脂牛奶、LH-SM P、M H-SM P這6種乳制品中呋喃素，CM L及可利用賴氨酸的含量。對(duì)各個(gè)乳制品之間呋喃素，CM L與可利用賴氨酸的含量做了單因素ANOVA多重比較分析發(fā)現(xiàn)液態(tài)牛奶與乳粉中的各分析物均存在顯著的差異（見表6），4種液態(tài)牛奶中可利用賴氨酸含量均顯著高于兩種脫脂乳粉（P＜0.01），而呋喃素與CM L含量則顯著低于脫脂乳粉（P＜0.01）；巴氏殺菌牛奶中呋喃素含量低于UHT牛奶（P＜0.01），可利用賴氨酸與CM L含量無明顯差別（P＞0.05）。兩個(gè)樣本間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)估，巴氏殺菌全脂牛奶與脫脂牛奶中可利用賴氨酸，呋喃素與CM L含量均無明顯差別（P＞0.05）；UHT脫脂牛奶中呋喃素含量比UHT全脂牛奶高（P＜0.01），可利用賴氨酸與CM L含量無明顯差別（P＞0.05）；LH-SM P中可利用賴氨酸含量高于MH-SM P（P＜0.05），呋喃素含量低于MH-SM P（P＜0.01），CM L含量無明顯差別（P＞0.05）。

表6 乳制品中呋喃素，CML及可利用賴氨酸的含量

新鮮牛乳中含有大量的蛋白與還原糖（主要為乳糖），加熱過程中易發(fā)生美拉德反應(yīng)，且美拉德反應(yīng)的程度隨著熱處理溫度的升高而加劇[21]。同時(shí)，乳粉的生產(chǎn)往往會(huì)經(jīng)過加熱濃縮，噴霧干燥等高溫工藝，從而導(dǎo)致美拉德反應(yīng)程度的劇烈增加，對(duì)于牛乳的新鮮度和營養(yǎng)價(jià)值造成不利的影響。另外，乳粉原料的貨架期通常為兩年，液態(tài)牛奶原料通常在一個(gè)月內(nèi)，而美拉德反應(yīng)與存儲(chǔ)條件及存儲(chǔ)時(shí)間密切相關(guān)，較高的溫度與濕度，較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間均會(huì)導(dǎo)致可利用氨基酸的損失，并產(chǎn)生較多的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[22]。因此對(duì)于乳粉原料，為期兩年的儲(chǔ)存條件的控制尤為重要，恰當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)條件才能有效避免可利用氨基酸的損失及大量氨基酸封閉產(chǎn)物的生成。研究發(fā)現(xiàn)，呋喃素、CM L等賴氨酸封閉產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致許多健康問題[3]，而生產(chǎn)過程中不可避免地會(huì)產(chǎn)生的少量呋喃素與CM L，但是由于其含量很低，我國國家標(biāo)準(zhǔn)中并沒有給出它們的限量要求，而歐洲兒科胃腸病學(xué)和營養(yǎng)學(xué)會(huì)則強(qiáng)烈建議盡可能控制賴氨酸封閉產(chǎn)物的產(chǎn)生[23]。所以優(yōu)質(zhì)的原料應(yīng)含有較高可利用賴氨酸，同時(shí)含有較少的呋喃素與CM L。表6的數(shù)據(jù)指出相比于乳粉，巴氏殺菌全脂和脫脂液態(tài)鮮奶能夠鎖留更多可利用賴氨酸和保留更多蛋白質(zhì)的天然營養(yǎng)價(jià)值，具有更高的新鮮度。巴氏殺菌與UHT滅菌處理方式相比，其受熱時(shí)間雖然較長(zhǎng)，但是巴氏殺菌處理的溫度低于UHT滅菌處理，因此巴氏殺菌處理方式有利于減少美拉德反應(yīng)初級(jí)階段的發(fā)生，導(dǎo)致產(chǎn)生較少的呋喃素，另外由于兩種處理方式溫度與時(shí)間都有良好的控制，不影響美拉德反應(yīng)高級(jí)階段的發(fā)生，并都有效鎖留了可利用氨基酸。同理，相比中熱處理的脫脂乳粉，低熱處理的脫脂乳粉中可利用賴氨酸含量損失較少，呋喃素含量也較低。另外，同種殺菌方式的全脂牛奶與脫脂牛奶中可利用賴氨酸無明顯差別說明脂肪不影響乳蛋白體系中可利用賴氨酸的損失，但是UHT脫脂牛奶相比UHT全脂牛奶含有更高的蛋白與乳糖，這導(dǎo)致其生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生較多的呋喃素。

3 結(jié)論

建立了高效準(zhǔn)確測(cè)定乳制品中可利用賴氨酸，呋喃素以及CM L的檢測(cè)方法，并采用所建檢測(cè)方法評(píng)估了6種市面常見的乳制品及乳蛋白原料。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)液態(tài)奶由于比乳粉具有較少的工藝環(huán)節(jié)，較低溫度及較短時(shí)間的工藝參數(shù)，能夠更為有效鎖留其中的可利用賴氨酸，并控制美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，是一種用于生產(chǎn)配方乳粉的更為優(yōu)質(zhì)新鮮的原料。不同生產(chǎn)工藝的液態(tài)奶中，巴氏殺菌液態(tài)奶由于其較低的殺菌處理溫度，其氨基酸封閉產(chǎn)物的產(chǎn)生較UHT液態(tài)奶更少。另外，盡管生產(chǎn)乳粉過程中會(huì)有部分可利用賴氨酸的損失，但采用較低的工藝溫度可以有效控制損失的程度，并減少美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)，在投入生產(chǎn)之前需要控制乳粉儲(chǔ)存條件（溫度，濕度，等）與儲(chǔ)存時(shí)間，以保證其新鮮度。本研究可以為乳制品的新鮮度研究提供高效準(zhǔn)確的方法，并對(duì)乳制品原料的選擇及儲(chǔ)存提供指導(dǎo)。