孫立臻，別梅，馮峰，王駿，祝建華，劉艷明，張峰

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南250100；2.山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南250100；3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100176）

0 引言

L-色氨酸（L-Tryptophan）是人體必需的一種氨基酸[1]，嬰幼兒如果缺乏色氨酸，會(huì)導(dǎo)致其蛋白質(zhì)和脂肪代謝障礙，影響其正常的生長發(fā)育[2-3]。我國的標(biāo)準(zhǔn)[4-5]中，均規(guī)定嬰幼兒食品中允許添加L-色氨酸，并對(duì)含量有明確要求。但我國缺乏相關(guān)產(chǎn)品中色氨酸的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，使政府監(jiān)管和企業(yè)質(zhì)量控制難以有效開展。

目前國內(nèi)外對(duì)于乳粉中色氨酸的檢測(cè)的報(bào)道較少，對(duì)特殊醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的檢測(cè)的報(bào)道幾乎沒有。已有的色氨酸的檢測(cè)方法主要有分光光度計(jì)法[6-7]、離子交換色譜法[8]、液相色譜[9-10]和液-質(zhì)聯(lián)用法[11]等方法，前處理過程一般為堿水解法[12-14]，堿水解法水解產(chǎn)物復(fù)雜、重現(xiàn)性差、靈敏度較低[15]。本研究建立了一種準(zhǔn)確測(cè)定嬰幼兒食品中色氨酸含量的酶解-高效液相色譜法。該法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，對(duì)N IST標(biāo)準(zhǔn)乳粉（1849a）的測(cè)定結(jié)果滿意，可用于市售嬰幼兒配方乳粉及醫(yī)學(xué)食品中色氨酸含量的檢測(cè)，為乳粉和醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品Bepure；XBridge C 18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5μm)；甲醇(色譜純)；T ris堿；鹽酸；乙酸；氫氧化鋰；蛋白酶；N IST乳粉標(biāo)準(zhǔn)品（1849a）；乳粉和醫(yī)學(xué)食品。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀(配備熒光檢測(cè)器2475和二極管陣列檢測(cè)器2998)；AB204-S型電子天平；SB-800DTD型超聲波清洗器；3-18K型冷凍離心機(jī)；Milli-Q超純水制備器；渦旋混合器；DNP-9162BS-III電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 試劑的配制

1.3.1 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 m g（精確到0.1 m g）L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 m L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。然后用水逐級(jí)稀釋到質(zhì)量濃度為0.2～100μg/m L，臨用前配制。

1.4 色譜條件

W aters Xbridge C 18色譜柱(3.5μm，150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%乙酸；流速0.8 m L/m in；進(jìn)樣體積10μL；激發(fā)波長295 nm，發(fā)射波長345 nm；柱溫35℃；等度洗脫條件為：甲醇0.1%，乙酸水=10∶90。

1.5 樣品處理

1.5.1 游離色氨酸的測(cè)定

稱取混合均勻的固體試樣500 m g（精確到0.1 m g）于50 m L刻度管中，加入2 m L水，超聲溶解，加入12 m L甲醇，充分混勻沉淀蛋白，用水定容至50 m L刻度，冷凍離心，濾液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，液相色譜測(cè)定。

1.5.2 色氨酸總量的測(cè)定（酶水解法）

稱取混合均勻的固體試樣200 m g（精確到0.1 mg）于50 m L帶螺紋的離心管中，加入0.5 m L蛋白酶溶液（質(zhì)量濃度5 mg/m L），3.0 m L Tris堿緩沖液（濃度為0.1 m o l/L，p H=8.5），200μL甲醇，超聲溶解，混合均勻，于50℃恒溫培養(yǎng)箱中18 h至酶解完全待樣品冷卻至室溫，加入12 m L甲醇。用水定容至50 m L，混勻后冷凍離心，濾液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，液相色譜測(cè)定。

1.5.3 色氨酸總量的測(cè)定（堿水解法）

稱取混合均勻的固體試樣200 m g（精確到0.1 m g），置于帶螺紋的聚四氟乙烯水解管中，加5 m L濃度為4 mol/L的氫氧化鋰溶液，充氮?dú)夂螅o蓋子，放入(110±1)℃恒溫干燥箱，水解20 h。冷卻至室溫，混勻開管，用水將水解液定量地轉(zhuǎn)移到50 m L刻度管中，濃度為6 m ol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值到中性，并用水定容至刻度，混勻后冷凍離心，濾液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，液相色譜測(cè)定。

1.5.4 空白實(shí)驗(yàn)

除不加試樣外，其他操作步驟同試樣的操作步驟。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解方式的考察

本研究選取嬰幼兒配方乳粉和醫(yī)學(xué)食品進(jìn)行了堿水解法和酶水解法的對(duì)比，表1結(jié)果表明，酶水解法的測(cè)定結(jié)果（扣除空白值）均不同程度的高于堿水解法的結(jié)果。乳粉的測(cè)定結(jié)果差異較小，在6.3%～9.0%之間；醫(yī)學(xué)食品的測(cè)定結(jié)果差異較大，在6.0%～21.2%之間，差異最大的是含有大量游離色氨酸的氨基酸配方醫(yī)學(xué)食品，其次是添加了不同程度水解乳清蛋白粉的深度水解配方醫(yī)學(xué)食品和部分水解配方醫(yī)學(xué)食品，而無乳糖配方、早產(chǎn)兒配方和全營養(yǎng)配方的醫(yī)學(xué)食品測(cè)定結(jié)果差異稍小。

根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)簽分析，氨基酸配方和部分/深度水解配方的醫(yī)學(xué)食品中添加的是游離色氨酸和經(jīng)過不同程度水解得到的小分子肽段，高濃度的堿液對(duì)其具有不同程度的破壞作用，導(dǎo)致其結(jié)果比酶水解法偏低很多；其余幾種配方的醫(yī)學(xué)食品與乳粉的基質(zhì)類似，調(diào)整的僅是維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)指標(biāo)，故其測(cè)定結(jié)果的差異程度與乳粉類似。無論是從操作的簡(jiǎn)便程度，還是結(jié)果的準(zhǔn)確度上考慮，酶水解法都更適用于乳粉和醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的測(cè)定。

表1 堿水解法與酶水解法的結(jié)果對(duì)比

2.2 酶解條件的優(yōu)化

2.2.1 酶解溫度

以標(biāo)準(zhǔn)乳粉1849a（（184±10）m g/100g）作為實(shí)驗(yàn)樣品，固定酶的加入量（0.5 m L）和酶解時(shí)間（18 h），分別考察反應(yīng)體系在40，45，50，55，60℃等不同溫度下的結(jié)果；結(jié)果表明，當(dāng)酶解溫度為50℃，達(dá)到酶解峰值，如圖1所示。

2.2.2 酶解時(shí)間

以標(biāo)準(zhǔn)乳粉1849a作為試驗(yàn)樣品，固定酶的加入量（0.5 m L）和酶解溫度（50℃），分別考察反應(yīng)體系在不同酶解時(shí)間（14，16，18，20，22，24 h）的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)酶解的時(shí)間超過16 h以后，結(jié)果趨于穩(wěn)定，證明酶解充分。綜合時(shí)間、效率、準(zhǔn)確度等因素，18 h為最佳的酶解時(shí)間，結(jié)果如圖2所示。

2.2.3 酶的用量

以標(biāo)準(zhǔn)乳粉1849a作為實(shí)驗(yàn)樣品，固定酶解溫度（50℃）和酶解時(shí)間（18 h），分別考察酶的用量對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果均為扣除試劑空白以后的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)酶的用量超過0.5 m L以后，結(jié)果趨于穩(wěn)定，綜合考慮到成本等問題，酶的最佳用量為0.5 m L，結(jié)果如圖3所示。

圖1 1849a在不同酶解溫度下的結(jié)果

圖2 1849a在不同酶解時(shí)間下的結(jié)果

圖3 1849a在不同酶用量下的結(jié)果

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱

本研究比較了Therm o Acclaim C 8（3.0 mm×150 mm，3μm），Waters Xbridge C 18（4.6 mm×150 mm，3.5μm），W aters Atlantis T 3（4.6 mm×250 mm，5μm）3種類型的色譜柱，驗(yàn)證色氨酸的色譜保留行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，色氨酸在3種色譜柱條件下均能有很好的保留，從方法的適用性及普及性上考慮，C 18色譜柱更為常規(guī)和普及，故最終選擇Waters Xbridge C 18（4.6 mm×150 mm，3.5μm）柱作為分析柱。

2.3.2 流動(dòng)相

本研究分別考察了甲醇-0.5 m o l/L磷酸二氫鈉緩沖鹽溶液（pH=2.3），甲醇-0.1%磷酸水溶液，甲醇-0.1%乙酸水溶液3種流動(dòng)相體系，在合適的有機(jī)相洗脫條件下，均能夠很好的分離目標(biāo)物，且無干擾，綜合考慮磷酸鹽容易堵塞色譜柱、不易沖洗等原因，最終選擇甲醇-0.1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相條件。

2.3.3 檢測(cè)器

L-色氨酸具有吲哚環(huán)的結(jié)構(gòu)，因此在紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器上均有較強(qiáng)的吸收。L-色氨酸在219 nm和278 nm處均有較強(qiáng)的紫外吸收，光譜圖（見圖4）。考慮到219 nm附近的干擾較多，故選擇278 nm作為紫外檢測(cè)器測(cè)定波長。本研究分別考察了乳粉1849a在278 nm處的紫外色譜圖和激發(fā)波長295 nm，發(fā)射波長345 nm處的熒光色譜圖（見圖5）。結(jié)果表明，L-色氨酸在紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器上均具有良好的響應(yīng)，目標(biāo)峰處均無干擾。通過對(duì)樣品的測(cè)試表明，兩種檢測(cè)器的定量結(jié)果無差異，結(jié)果如圖6所示。考慮到熒光檢測(cè)器具有更強(qiáng)的特異性，故選擇熒光檢測(cè)器作為主要的定量手段，紫外檢測(cè)器作為輔助定性定量的手段，本研究的方法學(xué)數(shù)據(jù)均為熒光檢測(cè)器的結(jié)果。

圖4 L-色氨酸的光譜圖

圖5 L-色氨酸的色譜圖

圖6 紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器定量結(jié)果

2.4 方法線性及檢出限

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，本研究考察了色氨酸在0.2～100μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明色氨酸在該濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為

Y=388456X+36512，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.9999。綜合考慮信噪比和儀器分析的線性范圍，確定方法的檢出限和定量限分別為1.5 m g/100g和5 mg/100g。本方法的靈敏度完全能夠滿足對(duì)乳粉和醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的檢測(cè)需求。

2.5 精密度與回收率

本研究對(duì)乳粉1849a進(jìn)行了6平行的測(cè)定實(shí)驗(yàn)，并通過向樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中色氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（284，684，1184）m g/100g，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，按上述樣品制備方法操作，分別得到精密度和回收率。結(jié)果表明，本方法色氨酸的回收率在99.0%～105.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.52%～2.01%，結(jié)果如表2所示。這說明本方法完全能夠滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需求。

3 方法應(yīng)用

本研究依照上述所建立的方法對(duì)購自市場(chǎng)和企業(yè)不同品牌、不同配方的國內(nèi)外乳粉和醫(yī)學(xué)食品進(jìn)行了測(cè)定。并分別比較了各種配方的樣品中游離色氨酸與總色氨酸的關(guān)系。

嬰幼兒配方乳粉中最常見的是牛奶粉和羊奶粉，奶粉中乳蛋白的水解是色氨酸的主要來源。本研究測(cè)定了來自不同品牌的5種牛奶粉和5種羊奶粉的色氨酸，結(jié)果如表3所示。多數(shù)奶粉中游離色氨酸的量低于定量限，說明樣品中的色氨酸來源于乳蛋白的水解。而牛奶粉5的游離色氨酸的量為25 m g/100g，樣品標(biāo)簽顯示其添加了單體色氨酸，這與本研究的結(jié)果一致。

表2 L-色氨酸的加標(biāo)回收率及精密度

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的常見配方有6種，包括氨基酸代謝障礙配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方、全營養(yǎng)配方（母乳營養(yǎng)補(bǔ)充劑）、早產(chǎn)/低出生體重兒配方和低乳糖配方。本研究對(duì)6種配方的樣品進(jìn)行了測(cè)定，并比較了游離色氨酸的比重，結(jié)果如表4所示。根據(jù)GB 25596規(guī)定，氨基酸代謝障礙配方中添加的是游離態(tài)氨基酸，包括L-色氨酸，研究結(jié)果顯示氨基酸代謝障礙配方中游離色氨酸占總色氨酸的99%以上；乳蛋白深度水解配方適用于食物蛋白過敏的嬰兒，不含有食物蛋白，添加成分為深度水解為氨基酸和肽段的乳清蛋白粉，研究結(jié)果顯示乳蛋白深度水解配方中既有游離態(tài)的色氨酸，也有水解色氨酸，游離色氨酸占總色氨酸的37.6%～61.4%；部分水解乳清蛋白粉配方添加的是經(jīng)加工分解成小分子乳蛋白、肽段和氨基酸的乳清蛋白粉，會(huì)有少量游離色氨酸的檢出，這與本研究結(jié)果相吻合，游離色氨酸占總色氨酸的6.4%～10.8%；其他配方（無/低乳糖配方、早產(chǎn)/低出生體重兒配方和全營養(yǎng)配方）的醫(yī)學(xué)食品僅在普通乳粉的基礎(chǔ)上，對(duì)能量、乳糖、某些礦物質(zhì)和維生素等的含量進(jìn)行了調(diào)整，因此總色氨酸的量均來自于蛋白水解色氨酸，這與本研究的結(jié)果一致，這幾種配方的醫(yī)學(xué)食品中游離色氨酸的量均低于定量限。

表3 乳粉中游離色氨酸及總色氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)結(jié)果

表4 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中游離色氨酸及總色氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)

4 結(jié)論

本研究通過酶水解法，建立了嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的高效液相色譜法。該方法準(zhǔn)確度好，靈敏度高。將該方法應(yīng)用于實(shí)際乳粉和醫(yī)學(xué)食品的檢測(cè)結(jié)果表明，不同基質(zhì)和配方的樣品之間，色氨酸的總量差異較大，游離色氨酸占色氨酸總量的比重也各不相同。本方法為制定嬰幼兒配方食品特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持。