樊 靜 ，蔣曉春 ，史點順 ，洪建軍 ，湯曉晴 ，王 蓓

（1浙江省義烏復元私立醫(yī)院超聲醫(yī)學科 浙江 義烏 322000）

（2浙江省中醫(yī)院乳腺中心 浙江 杭州 310000）

血管生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展得重要機制之一，其中血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是不依賴于內皮細胞的新腫瘤供血模式，是腫瘤細胞模仿機體血管內皮細胞血管生成并通過自身基因型反轉變形和細胞外基質重塑形成瘤細胞條索樣微循環(huán)管道，為腫瘤細胞提供血液供應[1]。學者們常通過免疫組化及特殊染色的方式進行標記，新生血管管壁由CD31或CD34等內皮細胞標記物染色陽性的血管內皮細胞和PAS染色陽性的基底膜構成，而VM結構是由CD31或CD34等內皮細胞標記物染色陰性的腫瘤細胞和PAS染色陽性的基底膜構成[2]。目前在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中等多種組織中均發(fā)現(xiàn)VM的存在，且其存在與患者預后密切相關[4]。目前關于超聲造影（Contrast enhanced ultrasound，CEUS）與VM 陽性乳腺浸潤性導管癌相關性的研究比較少[4]，本研究擬通過進行CEUS時間-強度曲線（time intensity curve， TIC）觀察VM陽性乳腺浸潤性導管癌中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)特征，從而探討CEUS與腫瘤VM生成及區(qū)域分布的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取浙江省義烏復元私立醫(yī)院和浙江省中醫(yī)院2016年1月—2018年12月經(jīng)手術病理證實為乳腺浸潤性導管癌患者167例（167個病灶），均為女性，年齡（28～72）歲，平均（56.2±10.3）歲。所有患者手術前均行常規(guī)超聲及CEUS檢查，檢查前未行穿刺活檢及任何臨床治療。納入標準：①腫塊樣病灶；②病灶＜4cm；③均獲得手術病理。排除標準：①非腫塊樣病灶；②病灶≥4cm；③失訪患者。所有患者CEUS檢查前簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)超聲檢查 采用esaote MyLabClassC彩色多普勒超聲診斷儀，LA532變頻線陣探頭頻率為10～13MHz。患者取仰臥位，充分暴露雙側乳腺，在常規(guī)超聲下觀察病灶位置、大小、數(shù)目、回聲及血流特征，并根據(jù)血流分布選擇病灶的最佳切面，選定圖片切面盡量包括病灶及其周圍正常乳腺組織。

1.2.2 CEUS檢查 采用esaote MyLabClassC彩色多普勒超聲診斷儀系統(tǒng)自帶軟件超聲造影匹配成像技術（contrast-tuned imaging，CnTI）。固定探頭位置不變切換到CEUS模式，造影參數(shù)設置恒定。造影劑采用Bracco公司超聲造影劑SonoVue（Bracco，Italy）。使用前注入生理鹽水5ml，振蕩搖勻，配制成微泡懸濁液（濃度5mg/ml）。經(jīng)肘靜脈團注5ml后計時，隨即團注入5ml生理鹽水，記錄造影全過程并存盤。整個造影全過程約3分鐘。

1.2.3 CEUS圖像區(qū)域界定 由兩位有5年經(jīng)驗超聲醫(yī)生在未知患者臨床資料情況下復習所存貯圖像，并將病灶的不同區(qū)域劃分為：①中央?yún)^(qū)：病灶中央部位直徑約1cm的區(qū)域，若病灶較小可適當縮小取樣框。②邊緣區(qū)：以超聲造影后病灶增強范圍的邊界為外界的區(qū)域，取樣盡量避開腫瘤滋養(yǎng)血管。③病灶旁乳腺正常組織：正常乳腺腺體組織。所有區(qū)域ROI面積相近，取樣框盡量處于同一屏幕及深度，見圖1。用美蘭標記腫塊的研究切面，在邊緣帶的取樣區(qū)域留下美蘭，并且在研究切面的皮膚層劃線。

圖1：VM陰性乳腺浸潤性導管癌患者（a）CEUS（b）TIC。VM陽性乳腺浸潤性導管癌患者（c）CEUS和（d）TIC。

1.2.4 CEUS圖像分析 利用QontraXt軟件行定量分析。描記ROI后，生成灌注參數(shù)立體三維圖像及灌注曲線。每個ROI記錄參數(shù)包括：始增時間（initial time，IT）、峰值強度（peak intensity，PI）、達峰時間（peak time，PT）、上升斜率（rising slope，RS）[（峰值強度-始增強度）/（峰值時間-始增時間）]、消除斜率（descending slope，DS）[（峰值強度-始增強度）/（平均渡越時間-峰值時間）]、平均渡越時間（mean transit time，MTT）、曲線下面積（area under curve，AUC）。

表1 單純DCIS組與浸潤性癌組患者臨床病理特征比較

表2 VM陽性組造影參數(shù)（±s）

表2 VM陽性組造影參數(shù)（±s）

53 0.60±0.25 50.67±23.63 0.02±0.01 1.82±1.13 48.56±12.48 2642.55±136.63中心區(qū) 18.02±6.93 0.56±0.28 53.79±24.52 0.02±0.01 1.73±1.02 47.83±12.57 2503.53±128.84病灶旁乳腺組織 20.64±5.72 0.48±0.21 58.83±27.34 0.01±0.01 1.51±0.97 43.67±11.74 2378.52±128.63 VM陽性組 IT（s） PI（dB） PT（s） RS（dB/s） DS（dB/s） MTT（s） AUC（dB/s）邊緣區(qū) 15.47±8.t 11.429 4.235 12.483 3.572 6.245 3.583 23.534 P 0.024 0.368 0.001 0.249 0.074 0.534 0.000

1.2.5 乳腺癌術后病理分析 所有乳腺癌標本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，行分別HE染色和CD34/PAS雙染色，CD34/PAS雙染色步驟[5]如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，修復時選擇檸檬酸微波修復方式，隨后行CD34著色，再利用DAB顯色，利用導致相差顯微鏡觀察（×100）。觀察中一旦發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞出現(xiàn)著色情況，立即用流水清洗，時間至少在1min上，終止整個反應；第二步將切片浸于濃度0.5%的過碘酸溶液中，并氧化反應10～15min，接著利用流水沖洗2min；置于Schiff液中，避光環(huán)境下反應15～20min，再流水沖洗2min；偏重亞硫酸鈉反應2次，1min/次；流水沖洗2次，2min/次；蘇木素淺染細胞核，脫水、透明、中性樹膠封片。VM的判斷標準：①含有血細胞的管腔。②管腔壁細胞由CD31染色結果陰性的腫瘤細胞構成。③PAS染色結果陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；二分類變量和無序變量采用χ2或Fisher's確切概率法進行比較。多組間比較采用ANOVA方差進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

所有患者超聲測量腫瘤平均大?。?.74±1.03）cm。浸潤性導管癌Ⅰ級70（41.92%）例，Ⅱ級57（34.13%）例，Ⅲ級40例（23.95%）。淋巴結未發(fā)生轉移者82（49.10%）例，轉移者85（50.90%）例。VM陽性組患者病理分級以Ⅱ、Ⅲ級為主，發(fā)生淋巴結轉移更為常見，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而VM陽性和陰性組患者腫瘤大小無顯著統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1。

2.2 VM陽性和VM陰性組患者CEUS比較

CEUS TIC結果顯示VM陽性組患者PI明顯增高、PT顯著縮短、AUC明顯增大，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。兩組患者在IT、RS、DS和MTT上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 VM陽性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組織比較

VM陽性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組 織 IT分 別 為（15.47±8.53）s、（18.02±6.93）s、（20.64±5.72）s；PT分 別 為（50.67±23.63）s、（53.79±24.52）s、（58.83±27.34）s；AUC分 別 為（2642.55±136.63）dB/s、（2503.53±128.84）dB/s、（2378.52±128.63）dB/s，三組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中PI、RS、DS和MTT無顯著統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表2。

2.4 VM陰性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組織比較

VM陰性組患者腫瘤邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺病灶旁組織 PI分 別 為（0.61±0.27）dB、（0.45±0.18）dB、（0.41±0.20）dB。AUC分別為（2642.55±136.63）dB/s、（2411.46±145.76）dB/s、（2236.67±146.88）dB/s，二組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中IT、PT、RS、DS和MTT無顯著統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表3。

表3 VM陰性組造影參數(shù)（±s）

表3 VM陰性組造影參數(shù)（±s）

72 0.61±0.27 58.59±22.68 0.01±0.01 1.55±1.46 45.34±11.52 2642.55±128.65中心區(qū) 21.24±4.62 0.45±0.18 54.25±20.53 0.01±0.01 1.48±0.89 44.42±11.07 2411.46±145.76病灶旁乳腺組織 20.78±5.45 0.41±0.20 52.67±20.83 0.01±0.01 1.35±0.92 43.26±10.85 2236.67±146.88 VM陰性組 IT（s） PI（dB） PT（s） RS（dB/s） DS（dB/s） MTT（s） AUC（dB/s）邊緣區(qū) 20.67±6.t 1.035 17.235 5.768 1.214 5.458 2.558 13.548 P 0.958 0.002 0.076 0.985 0.245 0.782 0.001

3 討論

VM屬于腫瘤組織內的功能性微循環(huán)的一種，其發(fā)現(xiàn)源于Maniots等[6]研究葡萄膜黑色素瘤時發(fā)現(xiàn)直徑＞1cm的瘤體中央未見血管內皮依賴的血管，以及未見壞死區(qū)域，但可見大量PAS染色陽性。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)將活性炭注入惡性黑色素瘤小鼠模型時可見活性炭顆粒分布于VM結構和內皮依賴性血管中央[7]，證實VM是腫瘤組織內的功能性微循環(huán)，該發(fā)現(xiàn)為VM的影像學檢查提供了組織學依據(jù)。

影像學是活體狀態(tài)下量化評估VM是否存在及其密度的重要方法，其可作為瘤體內微循環(huán)的評價指標之一，為術前分級、預測靶向治療療效及預后提供重要依據(jù)。目前研究報道采用DCE-MRI評估乳腺癌模型VM生成實驗發(fā)現(xiàn)VM陽性組腫瘤由周邊至中央呈均勻性逐漸增強，而VM陰性組腫瘤表現(xiàn)為中央無明顯強化，該結果經(jīng)病理、電鏡及免疫組化證實VM陽性組瘤體中央無血管內皮樣結構及明顯壞死及纖維化，并可見VM血管通路[8]。而經(jīng)過抗血管生成治療后的腫瘤，DCE-MRI可發(fā)現(xiàn)VM陽性腫瘤治療后其外周和中心區(qū)域的VEGF表達、VM表達與Ktrans值間均具有正相關關系[9]。研究還采用CEUS對裸鼠卵巢癌移植瘤模型研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤VM密度、微血管密度與PI、MTT呈正相關[10]。故以上研究表明DCE-MRI、CEUS可檢測腫瘤VM血管的存在及其密度。然而，其用于患者臨床評估VM的存在及其數(shù)量尚未見報道。

本研究利用CEUS定量參數(shù)評估CEUS與VM生成及其分布的相關性，結果表明VM陽性組患者PI增加，PT延長，AUC增加，與以往卵巢癌研究一致[10]，認為VM陽性腫瘤具有更高更快的造影劑充盈特性，分析原因可能為VM管道內部很少具有微血栓形成，其通過表達血管內皮鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶等改變腫瘤細胞之間的粘附方式，影響腫瘤細胞微環(huán)境，調節(jié)凝血功能等機制有關[11]。此外，VM管道形成還受到腫瘤細胞的牽張力、細胞外基質生成等因素影響，使得VM管網(wǎng)狀結構具有更好的血液循環(huán)功

能[12]。

此外，本研究將VM陽性及陰性病灶分別從邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)和乳腺正常組織進行分析，結果發(fā)現(xiàn)VM陽性腫瘤邊緣區(qū)IT和PT縮短，AUC增加，三者顯著高于腫瘤中央?yún)^(qū)和乳腺正常組織，而VM陰性腫瘤則出現(xiàn)邊緣區(qū)PI和AUC增加現(xiàn)象，該研究結果與MRI及病理研究結果一致[8,13,14]，認為VM更多存在于病灶邊緣區(qū)，并且附近無壞死或周圍炎性細胞，故其整體瘤體增強為均勻性高增強，其PI在中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū)無顯著差異。反之VM陰性組瘤體周邊PI高于中央?yún)^(qū)，其中央?yún)^(qū)出現(xiàn)出血壞死，從而導致造影劑呈充盈缺損征象。其原因可能為腫瘤細胞排列在VM通道的內表面上，這些細胞可通過分泌蛋白酶降解相鄰的結締組織并滲入血管的基底膜，直接暴露于血流從而使造影劑更易于進入腫瘤內部，并使腫瘤更容易發(fā)生血液轉移到其他區(qū)域[4]。該現(xiàn)象反之也證明了VM陽性腫瘤具有高度惡性、可塑性和低分化的特性，而本研究結果認為乳腺癌 VM陽性腫瘤患者病理分級更高，且發(fā)生淋巴結轉移的現(xiàn)象更為常見也揭示了VM與乳腺癌的高侵襲性、不良預后密切相關。

綜上所述，VM陽性乳腺癌惡性程度更高，發(fā)生淋巴結轉移更為常見。VM陽性乳腺癌PI明顯增高、PT顯著縮短、AUC明顯增大。其中VM陽性乳腺癌邊緣區(qū)CEUS TIC顯示IT和PT較中央?yún)^(qū)顯著縮短，AUC明顯增大，而VM陰性乳腺癌邊緣區(qū)PI和AUC較中央?yún)^(qū)增高。CEUS可作為VM生成和分布的有效評估方法。