李碧芳， 王韋達， 劉奕雄， 李 意，程 誠， 陳 序， 杜業(yè)剛*

(1.深圳市計量質量檢測研究院，國家營養(yǎng)食品質量監(jiān)督檢驗中心(廣東)，廣東深圳 518109；2.鄭州大學公共衛(wèi)生學院，河南鄭州 450001)

肉類含人體所需的蛋白質、脂肪和維生素等營養(yǎng)成分，是人們必需的主要副食品之一。從波及歐盟多國的“馬肉風波”到國內的“老鼠肉、狐貍肉和水貂肉冒充羊肉”等事件[1]，不僅嚴重損害了消費者的權益，同時也帶來了諸多食品安全隱患，還可能涉及宗教信仰問題，引發(fā)社會的不安定因素。近年來，用于物種鑒別和食品鑒定的方法在食品工業(yè)領域和監(jiān)管機構中得到越來越多的關注[2]。肉類真實性鑒別最常用的檢測方法主要有聚合酶鏈式反應(PCR)[3 - 6]和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)[7 - 8]技術。但這兩種方法都存在一定的弊端，核酸的降解和肉品的復雜基質會影響PCR檢測結果的準確性，而ELISA易發(fā)生物種間的交叉反應產(chǎn)生假陽性結果[9]，而且無法實現(xiàn)多個物種的同時檢測。

伴隨著生物質譜技術的飛速發(fā)展，基于質譜的蛋白質組學研究日漸成熟，以肽生物標志物為基礎的蛋白質組學技術為肉類物種鑒定提供了一種新思路。通過高分辨質譜對蛋白質的酶解肽段進行分離鑒定，尋找不同物種的專屬特征肽，再利用高效液相色譜-串聯(lián)質譜提取特征肽的離子對信息進行定性和定量，從而實現(xiàn)對肉類物種的真實性鑒定。這種方法具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、高準確性和高通量等其它方法無可比擬的優(yōu)越性[10]，已成功應用于雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉和馬肉等成分的鑒別[11 - 16]。相比之下，有關鵝肉成分鑒定的研究卻極少[17]。本研究基于蛋白質組學，建立了鵝源性成分鑒別的高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

EkspertTM nanoLC 400納升液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用儀(TripleTOF?6600，美國AB SCIEX公司)；Acquity UPLC?超高效液相色譜儀(美國，Waters公司)；QTRAP?6500+三重四極桿-線性離子阱復合質譜儀(美國，AB SCIEX公司)；Heraeus Fresco 21型冷凍離心機(美國，Thermo Scientific公司)；3-30 K型高速冷凍離心機(德國，Sigma公司)；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)；BC-1000渦旋振蕩器(深圳逗點生物技術有限公司)；CPA224S型分析天平(德國，Sartorius公司)；低蛋白吸附離心管(1.5 mL，德國Eppendorf公司)；刻度離心管(10 mL，美國Axygen Scientific公司)；超濾離心管(Membrane:10,000 MWCO HY，德國Sartorius公司)。

1.2 材料與試劑

碳酸氫銨(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；硫脲(Reagent Plus?≥99.0%，美國Sigma-Aldrich公司)；3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPS)(Ultra Pure，VWR Life Science)、尿素(VWR Life Science)、二硫蘇糖醇(DTT，Biotechnology)、碘乙酰胺(IAA，Proteomics)(美國Amresco公司)；測序級修飾胰蛋白酶(Porcine，美國Promega公司)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)；乙腈、水(質譜純，德國Merck公司)；甲酸(質譜純，美國Thermo Fisher公司)。實驗前處理用水均為超純水。

雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品均為市售。

1.3 樣品處理

1.3.1 蛋白質提取稱取1 g切碎后的肉類樣品于10 mL離心管中，加入5 mL蛋白裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS)，渦旋振蕩過夜，以14 000 r/min離心20 min，取上清液至低蛋白吸附離心管中備用。采用Bradford法測定上清液蛋白濃度。

1.3.2 蛋白質酶解根據(jù)測定的蛋白濃度，移取適量上清液到低吸附離心管中，加入尿素水溶液(8 mol/L)至200 μL，加入4 μL DTT水溶液(1 mol/L)，置于37 ℃恒溫反應1 h。冷卻至室溫后加入20 μL IAA水溶液(1 mol/L)，避光反應1 h。將上述反應液轉移至超濾離心管中，于8 ℃、14 000 r/min離心40 min，除去多余的IAA和鹽類等小分子成分，并用碳酸氫銨溶液(100 mmol/L)洗滌超濾膜上的蛋白3次(100 μL×3)。向超濾管中加入100 μL碳酸氫銨溶液(100 mmol/L)和10 μL胰蛋白酶溶液(1∶40)，輕輕搖勻，置于37 ℃恒溫酶解5 h，8 ℃、14 000 r/min離心40 min，加入90 μL碳酸氫銨溶液(100 mmol/L)洗滌一次，收集濾液，待質譜分析。

1.4 NanoLC-TOF MS條件

色譜條件:Eksigent NanoLC trap C18色譜柱(0.5 mm×350 μm，3 μm)，Eksigent C18色譜柱(150 mm×75 μm，3 μm)。流動相A為含0.1%甲酸水溶液-乙腈(98∶2，V/V)，B為乙腈-含0.1%甲酸水溶液(98∶2，V/V)。梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%～92%A；0.5～50 min，92%～76%A；50～65 min，76%～68%A；65～74 min，68%～50% A；74～75 min，50%～20% A；75～80 min，20% A；80～81 min，20%～95% A；81～90 min，95% A。流速：300 nL/min；進樣體積：2 μL。

質譜條件：采用納升電噴霧離子源(NanoESI)，正離子掃描模式，噴霧電壓2.3 kV；加熱溫度150 ℃；氣簾氣壓力206.84 kPa，霧化氣壓力41.37 kPa；質譜數(shù)據(jù)采集使用信息依賴的工作模式(Information Dependent Analysis，IDA)同時進行動態(tài)背景扣除。一級TOF-MS單張圖譜掃描時間為250 ms，掃描范圍：m/z350～1 500；每次IDA循環(huán)最多采集30張電荷為2+～5+且單秒計數(shù)大于150的二級質譜，每張二級質譜的累積時間為50 ms，每次循環(huán)時間為1.8 s。

1.5 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫：35 ℃。流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%A；0.5～4 min，95%～65% A；4～7 min，65%～50%A；7～8 min，50%～10%A；8～10 min，10%A；10～10.5 min，10%～95%A；10.5～12 min，95%A。流速：0.3 mL/min；進樣體積：4 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)源，正離子掃描以多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測；噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：276 kPa；霧化氣壓力：379 kPa；輔助氣壓力：379 kPa。

2 結果與討論

2.1 酶解時間優(yōu)化

胰蛋白酶在pH為8.0、溫度為37 ℃時的作用能力最強，因此酶解反應在pH相近的碳酸氫銨溶液中進行，溫度控制在37±0.5 ℃左右。在上述實驗條件下，酶解的時間是影響蛋白質水解程度的重要因素，實驗考察了酶解2、4、6、8、15 h(過夜)后質譜記錄的各特征肽段的檢測濃度。結果表明，鵝肉樣品的酶解時間為4 h時，各肽段的檢測濃度達最高值且隨后趨于平衡。為了充分水解蛋白質并縮短實驗前處理時間，酶解的反應時間選為5 h。

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 特征肽段的篩選特征肽段是指某一個蛋白質所特有的肽段序列[18]，在蛋白質組學研究中可作為區(qū)分物種屬性的生物標志物。特征肽段的選擇一般遵循以下原則[19 - 20]：以含7～25個氨基酸長度的肽為宜；不含錯切或漏切的酶切位點，對于豐度較高的肽段可接受一個漏切位點；要具有穩(wěn)定的物理化學性質；質譜檢測分析時具有較好的靈敏度和峰形。借助于納升液相色譜-串聯(lián)飛行時間質譜儀對酶解后的多肽溶液進行Full MS-IDA掃描，得到高準確質量數(shù)的質譜數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導入蛋白質搜索軟件ProteinPilotTM，參數(shù)設置為：Sample Type:Identification；Cys Alkylation:Iodoacetamide；Digestion:Trypsin；Instrument:TripleTOF 6600；ID Focus:Biological modifications；Unused ProtScore(Conf)>0.05(10.0%)；Run False Discovery Rate Analysis，并在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中進行比對檢索。本文詳細比較了雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉這些常見物種的多肽序列，找到60條只存在于鵝肉樣品中的備選特征肽段，然后在NCBI網(wǎng)站上進行blast分析，去掉非特異性的肽段，最后留下7條特異性肽段。利用Skyline軟件導出上述7條異性肽段的MRM離子對信息，并對離子對的碰撞能量進行優(yōu)化，建立UPLC-MS/MS方法。肽段序列和MRM參數(shù)見表1。

表1 鵝肉的特征肽段及MRM離子對信息

*Quantitative ion.DP:declustering potential.CE:collision energy.

多肽碎片離子的二級質譜是鑒定特征肽段序列的重要指標，其實際檢測結果和理論預測的斷裂方式越吻合，此肽段的可信度越高。以鵝肉的特征肽段FFEAVYPIEAR(peptide4)為例，如圖1所示，實驗獲得了7個與理論斷裂方式相符且信號響應極強(>103)的y碎片離子和2個高信號響應(>103)的b碎片離子，證明該肽段具有很高的置信度，可用于MRM的驗證分析。

圖1 Peptide 4的二級質譜圖(括號內m/z是理論值，括號外m/z是實測值)Fig.1 Diagram of MS2 fragmentation of peptide 4(theoretical ion m/z values were shown in parentheses and observed m/z values were shown outside parentheses)

2.2.2 特征肽段的特異性驗證通過高分辨質譜和數(shù)據(jù)庫檢索篩選到的特征肽段，需經(jīng)過質譜的MRM檢測來驗證其特異性。選取雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品酶解后進行測定，考察各樣品中特征肽段離子對的保留時間、子離子匹配度及響應強度，選擇僅在鵝肉樣品中存在的離子對信息，以準確說明該物種的存在性。經(jīng)過實驗確認，前述7條特征肽段在雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品均未檢出，而在鵝肉樣品中全都有質譜信號檢出，如圖2所示。結果說明所篩選的7條鵝肉特征肽段具有特異性，據(jù)此所建立的液相色譜-串聯(lián)質譜方法具有準確性和可靠性。

圖2 鵝肉特征肽段的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of marker peptides in goose

2.3 定量研究

本實驗將鵝肉和鴨肉分別提取的多肽溶液，按照質量分數(shù)5%、10%、20%、40%、60%和90%的比例依次進行混合，通過UPLC-MS/MS的MRM模式掃描，選擇無背景干擾峰且信號響應較強的離子對(表1)繪制標準曲線，考察特征肽段的信號響應與鵝肉含量的相關性。結果如表2所示，肽段peptide 6的離子對信號響應較低且線性相關性較差，不適用于定量分析，其余各特征肽段的標準曲線相關性系數(shù)均大于0.99，可用于鵝肉成分的定量分析。以10倍儀器檢測信噪比確定方法的定量限，鵝肉的定量限為5%。另外，我們以合成的特征肽段配制成不同濃度的溶液，以10倍儀器檢測信噪比測得各肽段定量限的絕對值在3.5～6.0 fmol之間。

將鵝肉和鴨肉按照質量分數(shù)30%、50%和70%的比例進行混合制備肉樣，按照1.3的實驗步驟進行前處理，以優(yōu)化色譜-質譜條件分析，將測得的數(shù)據(jù)帶入標準曲線進行計算，得出鵝肉的含量比例，以驗證方法的準確性和穩(wěn)定性。結果如表3所示，回收率在71%～121%之間，測定值與實際比例相符，精密度(RSD)小于10%，重復性較好，說明使用該方法能夠可靠地測定鵝肉成分的含量。

表2 鴨肉中鵝肉含量的線性關系、定量限及特征肽段定量限的絕對值

y:peak area.x:mass percentage,%.

表3 鴨肉中鵝肉含量的測定值、回收率和精密度

2.4 實際樣品檢測

應用建立的方法對購自不同酒店的12份鵝肉、5份鴨肉和3份雞肉樣品進行了檢測，以驗證方法的適用性。結果顯示，7條特征肽段在本次鵝肉樣品中都有檢出，而在鴨肉和雞肉樣品中并未檢出，進一步證明該方法具有特異性，適用于鵝源性成分的鑒定。

3 結論

本研究利用納升高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質譜平臺，結合蛋白質檢索軟件篩選出鵝的備選特征肽段，利用skyline軟件導出的質譜參數(shù)，建立了MRM檢測方法，并對備選特征肽段進行驗證，最終確證了7條鵝源性特征肽段。另外，所篩選的特征肽段中有6條肽的質譜信號與鵝肉含量呈線性相關，能夠準確地定量鵝肉成分。