李 瑋*, 艾連峰, 馬育松, 陳瑞春, 郭春海

(石家莊海關(guān)，河北石家莊 050051)

真菌毒素是真菌在糧食和飼料中生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，這些毒素通過(guò)食物鏈從奶牛體內(nèi)轉(zhuǎn)移至牛奶中，受污染的牛奶經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后，真菌毒素幾乎不被破壞，長(zhǎng)期攝入后會(huì)引起人類和動(dòng)物的急性或慢性中毒，損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等，部分真菌毒素已被證實(shí)具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用[1]。

目前，關(guān)于食品尤其是谷物、堅(jiān)果等農(nóng)產(chǎn)品和飼料中真菌毒素檢測(cè)的報(bào)道較多[2 - 5]，主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[6]、薄層色譜法(TLC)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[9 - 10]。本文建立了基于超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-TOF MS)的快速、高通量分析牛奶中9種真菌毒素的方法，為牛奶樣品的高通量快速檢測(cè)提供了可靠的分析平臺(tái)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-30A超高效液相色譜儀(日本，島津公司)；AB SCIEX TripleTOF5600+高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)，AB SCIEX公司)；HITACHI離心機(jī)(日本，日立公司)；VORTEX-2 GENE渦旋混合器(美國(guó)，Scientific公司)；超聲波清洗器(中國(guó))；Turbo Vap型氮?dú)獯蹈蓛x(美國(guó)，Zymark公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1(AF B1)、黃曲霉毒素B2(AF B2)、黃曲霉毒素G1(AF G1)、黃曲霉毒素G2(AF G2)、黃曲霉毒素M1(AF M1)、黃曲霉毒素M2(AF M2)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)均購(gòu)于美國(guó)SUPELCO公司，用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度，4 ℃保存；用空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液成一系列混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸(色譜純，F(xiàn)luka)；無(wú)水Na2SO4(分析純)；無(wú)水MgSO4(分析純)；C18(分析純)。實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q(美國(guó)Millipore公司)高純水。

1.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g牛奶樣品于50 mL具塞離心管中，加入6 g無(wú)水Na2SO4和25 mL 1%乙酸乙腈，振搖1 min，超聲提取10 min，5 000 r/min離心6 min，移取上清液6 mL至另一帶螺旋蓋的10 mL離心管中，待凈化。將QuEChERS凈化粉(800 mg無(wú)水MgSO4、100 mg C18)加入裝有6 mL提取液的離心管，渦旋混勻1 min，5 000 r/min離心6 min。準(zhǔn)確移取5.0 mL上清液至氮吹管中，于40 ℃氮?dú)獯蹈?，?.0 mL 0.1%乙酸-乙腈(9+1)復(fù)溶，渦旋混合后，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent proroshell 120 EC-C18柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸-10%甲醇，B為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸-90%甲醇；梯度洗脫程序：0～3 min B從5%升到30%，3～7 min B升到90%，7～9 min保持B為90%，9～9.10 min B從90%降至5%，9.10～11 min保持B為5%；流速：0.4 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：20 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子或負(fù)離子掃描模式；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍80～800；質(zhì)譜調(diào)諧：正(負(fù))離子模式自動(dòng)調(diào)諧。其他信息見表1。

表1 9種真菌毒素的信息

圖1 不同溶劑對(duì)9種真菌毒素的提取效果Fig.1 Extraction efficiency of the different solvent for 9 mycotoxins

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

真菌毒素大多較易溶于甲醇、乙腈、水等極性溶劑中，但乙腈使樣品中蛋白質(zhì)變性沉淀的效果比甲醇好，因此實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、1%乙酸乙腈、乙腈-水(84+16)和乙腈-1%乙酸水(84+16)4種提取溶劑對(duì)牛奶中9種真菌毒素的提取效果(圖1)。結(jié)果表明1%乙酸乙腈對(duì)9種目標(biāo)物的提取效率較好，因此選擇1%乙酸乙腈為提取溶劑。

2.2 凈化方式的選擇

QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Rugged,Safe)提取方法最早主要用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)，由于其具有簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于各種檢測(cè)領(lǐng)域，其中也包括真菌毒素的檢測(cè)[11 - 12]。在QuEChERS提取方法中，通常加入無(wú)水MgSO4產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，降低提取液中水分含量，方便后續(xù)的濃縮步驟；除此之外還會(huì)加入C18和乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)來(lái)吸附脂肪、糖及有機(jī)酸。實(shí)驗(yàn)考察了500～1 000 mg無(wú)水MgSO4、30～150 mg C18及0～100 mg PSA按不同比例組合的凈化效果。結(jié)果表明，PSA對(duì)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有影響，采用800 mg無(wú)水MgSO4和100 mg C18為組合凈化劑進(jìn)行分散固相萃取時(shí)，樣品溶液澄清，基質(zhì)干擾較小，回收率最佳。

2.3 質(zhì)譜條件選擇

在TOF MS模式下對(duì)目標(biāo)化合物同時(shí)進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜全掃描，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000，二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z80～800。利用MasterView軟件對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析，通過(guò)每個(gè)化合物的分子式得到理論質(zhì)量數(shù)和實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)，處理后得到每個(gè)化合物的二級(jí)全掃描圖，選擇響應(yīng)最高的兩個(gè)碎片離子作為子離子。將實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)作為母離子，建立質(zhì)譜條件：先在m/z100～1 000范圍內(nèi)全掃描，然后設(shè)定每個(gè)化合物的實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)并設(shè)定在m/z80～800范圍內(nèi)進(jìn)行二級(jí)全掃描。利用二級(jí)質(zhì)譜定量，同時(shí)通過(guò)庫(kù)檢索，以目標(biāo)化合物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜、精確分子量、保留時(shí)間、同位素豐度匹配、特征離子等信息進(jìn)行定性確認(rèn)分析。9種目標(biāo)物的提取離子色譜圖見圖2。

圖2 牛奶中9種目標(biāo)物的定量限添加水平提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 9 compounds in milk of LOQ level

2.4 回收率及精密度

通過(guò)在空白牛奶樣品中分別添加3個(gè)不同水平的待測(cè)目標(biāo)物，平行測(cè)定5次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。以信噪比(S/N)=10確定樣品檢測(cè)的定量限，9種真菌毒素的定量限為1～20 μg/kg。

表2 方法的靈敏度、線性關(guān)系及回收率(n=5)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

在市場(chǎng)上購(gòu)買不同品牌牛奶樣品20份，按照上述方法進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果1份樣品中檢出AFM1含量為1.2 μg/kg。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用超高效液相色譜-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜建立了牛奶中9種真菌毒素的分析方法，實(shí)現(xiàn)了牛奶中9種真菌毒素的定量及定性確證分析。該方法具有適用性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，為食品安全領(lǐng)域提供重要的技術(shù)支持。