吉鑫，樊雙喜，楊彤暉，劉一諾，鐘其頂

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 2 (全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015)

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)作為一種有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)解析的代表性分析方法，在1963年首次應(yīng)用于定量分析，確定了26種純有機(jī)物質(zhì)中的分子內(nèi)質(zhì)子比率[1]。近年來，NMR定量技術(shù)已經(jīng)在藥物分析[2]、代謝組學(xué)[3-4]、食品分析鑒別[5]等領(lǐng)域得到了較為廣泛的運(yùn)用。與氣相色譜法、高效液相色譜法等傳統(tǒng)分析方法相比，NMR僅需要很少的樣品量，便可直接測(cè)定啤酒[6-7]、果汁[8-9]、葡萄酒[10]和嬰兒配方奶粉[11]等不同食品基質(zhì)中的多種化合物，而無需預(yù)先將復(fù)雜混合物中的待測(cè)物質(zhì)分離，具有同時(shí)測(cè)定樣品中多種成分含量等優(yōu)點(diǎn)。

水蘇糖是由兩個(gè)α-半乳糖，一個(gè)葡萄糖和一個(gè)果糖構(gòu)成的四糖，為非還原性功能性低聚糖[12]。具有促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌繁殖及生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖和降血脂等功能[13]。由于水蘇糖的物化性質(zhì)較為穩(wěn)定，且具有良好的生理功能，通常被添加到如飲料、米粉、乳制品、口服液等[14-16]食品中，以適應(yīng)不同的消費(fèi)需求。

目前食品中水蘇糖含量的檢測(cè)主要使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(QB/T 4260—2011)，即高效液相色譜法[17]，另外，采用層析法[18]、氣相色譜法[19]等在特定條件下也能檢測(cè)水蘇糖含量。薄層層析法分析時(shí)間長(zhǎng)、展開劑體積需求大、分離結(jié)果差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性以及精密度較差；氣相色譜法需將糖通過衍生化的方法轉(zhuǎn)換成為可揮發(fā)的成分后再測(cè)定，過程較為繁瑣；高效液相色譜法是較為常用的方法[20]，但其分析時(shí)間較長(zhǎng)，示差折光檢測(cè)器的穩(wěn)定性、重復(fù)性和選擇性均有不足。此外，現(xiàn)行QB/T 4260—2011規(guī)定的方法僅適用于以食用植物為原料，經(jīng)加工提取、精制而成的水蘇糖含量進(jìn)行檢測(cè)，即P60、P70和P80型水蘇糖，對(duì)于復(fù)雜食品基質(zhì)中水蘇糖的定量分析較為困難，因此，開發(fā)一種能夠?qū)κ称分兴K糖實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的定量方法，對(duì)于規(guī)范水蘇糖類產(chǎn)品的市場(chǎng)尤為重要。

基于上述問題，本研究通過引入核磁共振波譜儀，旨在建立基于外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)的NMR定量分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中水蘇糖含量快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)。由于食品基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，為避免食品中其他物質(zhì)對(duì)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)信號(hào)峰產(chǎn)生干擾，故選取不同內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分析，探索NMR法直接應(yīng)用于食品基質(zhì)中水蘇糖含量定量檢測(cè)的可行性，彌補(bǔ)現(xiàn)行QB/T 4260—2011高效液相色譜法適用范圍不足的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品(98%)，北京百靈威科技有限公司；疊氮化鈉(高純，NaN3)，Biotopped；3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(Sodium-3-(trimethylsilyl)propionate-2,2,3,3-d4，TSP，98%)，CIL；KH2PO4，98%，CIL；重水(D2O，99.9%)，青島騰龍微波科技有限公司；檸檬酸(99%)，Vetec；煙酰胺(99%)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；琥珀酸(99%)，北京百靈威科技有限公司；市售含水蘇糖的主要食品(樣品編號(hào)為1-8，其中1號(hào)為以草石蠶為原料提取的P70型水蘇糖；2號(hào)為片劑；3-5號(hào)為3種不同品牌的固體飲料，電商平臺(tái)；6-8號(hào)為口服液，超市)。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker Avance III HD 400 MHz波譜儀，德國(guó)Bruker Biospin公司；Bruker自動(dòng)進(jìn)樣器(SampleJet)，德國(guó)Bruker Biospin公司；Bruker SampleJet 5 mm高通量核磁管，德國(guó)Bruker Biospin公司；渦旋混合器(MX-S)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 緩沖溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取1.00 g TSP和0.13 g NaN3于燒杯中，用D2O將其溶解并定容于10 mL容量瓶中，得到100 g/L的TSP溶液和13 g/L的NaN3溶液。準(zhǔn)確稱取8.00 g KH2PO4于燒杯中，用100 mL D2O將其溶解并轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，向其中加入5 mL H3PO4、2 mL上述TSP溶液和2 mL NaN3溶液，以及50 mL D2O。靜置24 h后，測(cè)定該溶液pH值，若pH>2.0，則加入適量H3PO4調(diào)整，若pH<2.0，則加入適量KH2PO4固體粉末調(diào)整，直至pH穩(wěn)定到2.0后，完成緩沖溶液的配制。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.064 0 g水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入適量蒸餾水，待其完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度為6.4 g/L的水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)溶儲(chǔ)備液。

準(zhǔn)確稱取適量檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成2.0 g/L的檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍準(zhǔn)確吸取100 μL緩沖溶液加入樣品管后，取900 μL檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品管并混勻，移取600 μL上述溶液于核磁管中，用于外標(biāo)法測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取適量琥珀酸、煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成10.0 g/L的琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和10.0 g/L的煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。

1.3.3 樣品制備

準(zhǔn)確稱取適量1～5號(hào)樣品于燒杯中，用蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至容量瓶定容。取2 mL定容后的溶液，使用0.22 μm濾膜過濾。吸取6～8號(hào)樣品并用蒸餾水稀釋至適當(dāng)濃度。

用移液槍準(zhǔn)確吸取100 μL緩沖溶液于樣品管中，加入900 μL上述1～8號(hào)水蘇糖樣品溶液，混合均勻后吸取600 μL于5 mm NMR管中，用于外標(biāo)法測(cè)定。用移液槍準(zhǔn)確分別吸取100 μL內(nèi)標(biāo)溶液和100 μL緩沖溶液于樣品管中，加入900 μL上述1～8號(hào)水蘇糖樣品溶液，混合均勻后吸取600 μL于5 mm NMR管中，用于內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。

1.3.41H NMR采樣參數(shù)

實(shí)驗(yàn)所采用的1H NMR的共振頻率為400.13 MHz；檢測(cè)溫度300 K(±0.1)；空掃次數(shù)(DS)為4次；掃描次數(shù)(NS)為64次；譜寬(SW)為20.5524；采樣點(diǎn)數(shù)(TD)為65536；接收增益(RG)為16；弛豫延遲(D1)為4 s。以TSP(δ= 0)作為化學(xué)位移的零點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)的脈沖序列(NOESYGPPR)用于水(δ= 4.8)的信號(hào)抑制，有效地減弱了水峰對(duì)檢測(cè)的干擾。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取一定體積的水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用蒸餾水逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為6.400、3.200、1.600、0.800、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025 g/L的水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并取少量蒸餾水作為空白對(duì)照。進(jìn)行與樣品溶液相同前處理后，在1.3.4所述條件下，首先測(cè)定檸檬酸外標(biāo)溶液，再依次對(duì)以上9個(gè)水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 精密度分析

本文選取1號(hào)樣品溶液，1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，取平均值，分析方法的日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定5次并取平均值，分析方法的日間精密度。

1.3.7 回收率實(shí)驗(yàn)

平行稱取25份1號(hào)樣品，用蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至容量瓶定容。其中5份作為對(duì)照組，其余20份由低至高，分別加入4個(gè)不同濃度水平的水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)水平重復(fù)5次，測(cè)定其1H NMR譜圖，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8 方法對(duì)比

將核磁共振定量法、高效液相色譜行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法QB/T 4260—2011和樣品標(biāo)簽標(biāo)注的水蘇糖的含量方法進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證分析方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)法定量

對(duì)于確定的原子，其核磁共振信號(hào)強(qiáng)度(峰面積)與產(chǎn)生該信號(hào)的原子的數(shù)目成正比，而與其化學(xué)性質(zhì)和所處的化學(xué)環(huán)境無關(guān)。以內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)峰面積作為參考，根據(jù)樣品指定質(zhì)子共振峰的相對(duì)峰面積計(jì)算含量，根據(jù)以下公式(1)計(jì)算分析物濃度[10]：

(1)

式中：ρ，分析物質(zhì)量濃度，mg/L；M為相對(duì)分子質(zhì)量；nH為質(zhì)子數(shù)；A為信號(hào)積分面積；CF為校正因子。

2.2 外標(biāo)法定量

脈沖寬度定量(pulse length based concentration determination，PULCON)[21]外標(biāo)法是基于信號(hào)強(qiáng)度互易原理，即給定線圈中樣品化合物的NMR信號(hào)強(qiáng)度與90°脈沖寬度成反比。通過介電特性(離子強(qiáng)度)在樣品間的變化來補(bǔ)償因線圈靈敏度損失的信號(hào)強(qiáng)度，將外部參考樣品的校準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到實(shí)際樣品中。每次定量前，需測(cè)定具有已知濃度的用于校準(zhǔn)的外部參考樣品(如2 g/L檸檬酸)，計(jì)算定量因子。樣品定量公式(2)如下[10]：

(2)

式中：ρ，分析物質(zhì)量濃度，mg/L；A為絕對(duì)積分面積；M為相對(duì)分子質(zhì)量；nH為質(zhì)子數(shù)；NS為掃描次數(shù)；P1為1H 90°脈沖寬度；T為檢測(cè)溫度；CF為校正因子。

2.3 校正因子(CF)

校正因子是在NMR波譜儀和測(cè)量條件等因素相互影響情況下對(duì)樣品定量結(jié)果的校正，如校正測(cè)量過程中對(duì)水信號(hào)壓制的影響等[10]。

校正因子的計(jì)算：水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標(biāo)，外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法所得的濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸y=ɑx+β，ɑ即校正因子(CF)。

2.4 水蘇糖1H NMR譜中水蘇糖特征峰確認(rèn)、定量峰以及內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)物的選擇

以D2O為溶劑，測(cè)定水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR譜，并對(duì)水蘇糖1H NMR譜信號(hào)峰進(jìn)行歸屬。1H NMR(D2O，400 MHz，TSP)δ：5.44(1H，d，J=3.8 Hz)，5.00(2H，dd，J=3.5，2.0 Hz)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24-26]。

由于水蘇糖是由1分子α-葡萄糖、1分子β-果糖和2分子α-半乳糖構(gòu)成的非還原性四糖[24]，糖環(huán)上多數(shù)質(zhì)子處于相似的化學(xué)環(huán)境中，如圖1-a所示，以D2O為溶劑的水蘇糖1H NMR譜中，化學(xué)位移分布在δH3.4～4.3范圍內(nèi)的質(zhì)子信號(hào)峰多發(fā)生重疊現(xiàn)象，裂分情況難以歸屬，因此不能用作定量峰進(jìn)行分析。由于糖端基質(zhì)子所受的去屏蔽作用明顯強(qiáng)于環(huán)上其他質(zhì)子，糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移向低場(chǎng)區(qū)移動(dòng)，根據(jù)水蘇糖結(jié)構(gòu)(圖2)，2個(gè)α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子信號(hào)峰(δH5.00)和α-D-葡萄糖基的端基質(zhì)子信號(hào)峰(δH5.44)(圖1-b)與樣品中其他成分信號(hào)峰無重疊，易于辨認(rèn)?？紤]到食品基質(zhì)的復(fù)雜性，故選擇葡萄糖基的端基質(zhì)子信號(hào)峰(δH5.44)和α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子信號(hào)(δH5.00)作為樣品中水蘇糖的定量峰，從而確保定量方法的準(zhǔn)確性。

a-水蘇糖1H NMR譜圖;b-水蘇糖特征峰圖1 以D2O為溶劑的水蘇糖1H NMR譜圖(a)以及特征峰(b)Fig.1 1H NMR spectra of stachyose in D2O solvent(a) and characteristic peaks(b)

圖2 水蘇糖結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula of stachyose

PULCON外標(biāo)法定量使用外部參考樣品，將外部參考樣品的校準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到實(shí)際樣品中，因此無需考慮分析物和參考樣品之間的相互作用和信號(hào)重疊，具有較高的精確度和準(zhǔn)確度[27]。此外，采用PULCON外標(biāo)法成本相對(duì)較低，可多次重復(fù)利用，進(jìn)一步降低了核磁共振的檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了前處理操作。檸檬酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，根據(jù)1H NMR譜顯示，其僅在δH2.65和δH2.52處存在兩組雙峰，且兩組雙峰對(duì)稱，易于辨認(rèn)，用于定量分析結(jié)果準(zhǔn)確，因此選擇檸檬酸作為外部參考物。

內(nèi)標(biāo)法定量需在樣品溶液中直接加入一定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。煙酰胺化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在水中具有良好的溶解性，1H NMR譜在δH9.17顯示一組雙峰，不與水蘇糖特征峰重疊且不易與食品基質(zhì)中其他化合物信號(hào)峰發(fā)生重疊。琥珀酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可溶于水，兩個(gè)亞甲基所包含的4個(gè)質(zhì)子均處于相同的化學(xué)環(huán)境中，因此，其1H NMR譜僅在δH2.67處存在單峰，與水蘇糖信號(hào)峰不發(fā)生重疊，峰型尖銳，易于辨認(rèn)。故選擇煙酰胺和琥珀酸作為內(nèi)部參考物。

2.5 實(shí)際水蘇糖樣品1H NMR圖譜

按照1.3.4的條件測(cè)定得到水蘇糖食品的1H NMR圖譜(見圖3)，上、中、下分別代表的是1號(hào)P70型水蘇糖樣品、4號(hào)固體飲料和8號(hào)口服液，由圖3可知，δH5.44特征信號(hào)峰與周圍質(zhì)子信號(hào)峰未發(fā)生重疊現(xiàn)象。

圖3 水蘇糖樣品1H NMR特征峰Fig.3 1H NMR spectra of stachyose sample with characteristic peaks

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系

以水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標(biāo)，測(cè)定濃度為橫坐標(biāo)做線性回歸。水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.025～6.40 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。

檸檬酸作為定量外標(biāo)，水蘇糖回歸方程分別為y=1.169 2x-0.0106，R2=1；琥珀酸和煙酰胺分別作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，水蘇糖回歸方程分別為y=1.064 3x+0.001 7，R2=0.999 6和y=1.036 5x-0.016 3，R2=1。表明本方法線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度分析

選取1號(hào)樣品溶液，1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，每次重復(fù)測(cè)定5遍，取平均值，分析方法的日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定5次取平均值，分析方法的日間精密度。結(jié)果如表1所示，采用PULCON檸檬酸作為外標(biāo)方法日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.65%和5.27%，且日內(nèi)與日間兩者水蘇糖測(cè)定結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，滿足測(cè)定方法對(duì)于精密度的要求。以琥珀酸和煙酰胺作為內(nèi)部參考物時(shí)，方法的日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果如表2所示。以琥珀酸作為內(nèi)標(biāo)，方法的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.34%和0.65%；以煙酰胺作為內(nèi)標(biāo)，方法的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為0.83%和2.46%。

表1 檸檬酸作為外標(biāo)方法日間與日內(nèi)精密度(n=5)Table 1 Intra-day and inter-day precision of the method with citric acid as an external standard

表2 內(nèi)標(biāo)方法日間與日內(nèi)精密度(n=5)Table 2 Intra-day and inter-day precision of internal standard method

2.6.3 回收率實(shí)驗(yàn)

選取1號(hào)樣品溶液，向其中分別添加0.78、1.59、2.34、3.20 g/L，4個(gè)不同水平的水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，單個(gè)水平5次重復(fù)取均值，結(jié)果取平均值，如表3所示。以檸檬酸作為外標(biāo)，采用PULCON方法測(cè)定4個(gè)不同的加標(biāo)水平下，該方法的回收率在95.63%～101.28%，其平均回收率為97.91%，回收率的RSD在2.00%～2.32%，結(jié)果表明該水蘇糖檢測(cè)方法精確度較好，能夠滿足水蘇糖的準(zhǔn)確測(cè)定。分別以琥珀酸和煙酰胺作為內(nèi)標(biāo)對(duì)水蘇糖進(jìn)行定量，結(jié)果如表4、表5所示。以琥珀酸作為內(nèi)標(biāo)測(cè)定4個(gè)不同的加標(biāo)水平下，該方法的回收率在96.56%～110.26%，其平均回收率為101.39%，回收率的RSD在1.54%～1.84%。以煙酰胺作為內(nèi)標(biāo)測(cè)定4個(gè)不同的加標(biāo)水平下，方法的回收率在100.31%～114.10%，其平均回收率為106.35%，回收率的RSD在1.28%～2.22%。

表3 檸檬酸作為外標(biāo)方法回收率Table 3 Recovery of the method with citric acid as an external standard

表4 琥珀酸作為內(nèi)標(biāo)方法回收率Table 4 Recovery of the method with succinic acid as an internal standard

表5 煙酰胺作為內(nèi)標(biāo)方法回收率Table 5 Recovery of the method with niacinamide as an internal standard

2.6.4 方法對(duì)比

應(yīng)用上述已經(jīng)建立NMR定量方法對(duì)市售8個(gè)樣品的水蘇糖含量進(jìn)行定量測(cè)定，每個(gè)樣品采用1H NMR和2D J-resolved進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定2次，取平均值，結(jié)果如表6所示。NMR內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，NMR定量結(jié)果符合樣品標(biāo)簽注明的含量；2D J-resolved譜結(jié)果顯示，δH5.44水蘇糖信號(hào)峰周圍不存在可對(duì)其定量結(jié)果產(chǎn)生干擾的雜質(zhì)信號(hào)，不影響NMR準(zhǔn)確定量，結(jié)果表明NMR能夠用于水蘇糖樣品的快速定量檢測(cè)。

采用行標(biāo)QB/T 4260—2011高效液相色譜法重復(fù)測(cè)定2次，取平均值，結(jié)果如表6所示。1號(hào)P70型水蘇糖、2號(hào)片劑、3號(hào)固體飲料和8號(hào)口服液樣品NMR和高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果基本一致，無顯著性差異(P>0.05)，進(jìn)一步表明NMR能夠準(zhǔn)確定量食品中水蘇糖含量；4、5號(hào)樣品經(jīng)NMR定量所得結(jié)果明顯高于行標(biāo)法和標(biāo)簽注明含量，產(chǎn)生偏差原因可能是樣品中其他糖類與水蘇糖中葡萄糖基端基質(zhì)子(δH5.44)信號(hào)峰完全重疊；6、7號(hào)樣品經(jīng)行標(biāo)方法檢測(cè)，未檢出水蘇糖成分，產(chǎn)生偏差原因考慮主要是樣品基質(zhì)中不含有水蘇糖成分而是其他糖類在水蘇糖中葡萄糖基端基質(zhì)子(δH5.44)信號(hào)峰處產(chǎn)生信號(hào)。

表6 核磁共振和行標(biāo)高效液相色譜法定量水蘇糖結(jié)果 單位：%

注：%指單位物質(zhì)所含水蘇糖質(zhì)量的百分比；ND表示未檢出。下同。

為近一步探究4～7號(hào)樣品NMR定量結(jié)果與行標(biāo)方法產(chǎn)生差異的原因，以水蘇糖的半乳糖端基質(zhì)子(δH5.00)信號(hào)作為定量峰對(duì)樣品中水蘇糖含量進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果如表7所示。

表7 以半乳糖端基質(zhì)子信號(hào)作為定量峰的水蘇糖核磁共振定量結(jié)果 單位：%

1～3號(hào)和8號(hào)樣品定量結(jié)果與以葡萄糖端基質(zhì)子作為定量峰時(shí)結(jié)果一致，無顯著性差異(P>0.05)。4、5號(hào)樣品定量結(jié)果更接近于行標(biāo)法測(cè)定的水蘇糖含量。而6、7號(hào)樣品在δH5.00處未出現(xiàn)質(zhì)子特征信號(hào)，則認(rèn)為6、7號(hào)樣品中不含水蘇糖。

根據(jù)4、5號(hào)樣品配料表所注明成分，對(duì)其分別添加葡萄糖、果糖、半乳糖和低聚果糖進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)添加低聚果糖的4、5號(hào)樣品，其δH5.44質(zhì)子信號(hào)積分面積顯著增加，由此造成以δH5.44質(zhì)子信號(hào)作為定量峰時(shí)，水蘇糖定量結(jié)果偏高，故δH5.44定量峰不適用于含低聚果糖的食品基質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究以檸檬酸作為定量外標(biāo)，琥珀酸和煙酰胺分別作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，建立了食品中水蘇糖NMR定量分析檢測(cè)方法。以葡萄糖端基質(zhì)子(δH5.44)信號(hào)作為定量峰，該方法在0.025～6.40 g/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999；以檸檬酸作為外標(biāo)方法加標(biāo)回收率為97.91%，日內(nèi)精密度與日間精密度分別為1.65%與5.27%；琥珀酸和煙酰胺內(nèi)標(biāo)方法加標(biāo)回收率分別為101.39%和106.35%，日內(nèi)精密度分別為1.34%和0.83%，日間精密度分別為0.65%與2.46%；對(duì)于基質(zhì)中含有低聚果糖的食品，采用半乳糖端基質(zhì)子(δH5.00)信號(hào)作為定量峰對(duì)水蘇糖含量進(jìn)行計(jì)算。該方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。與現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法相比，NMR法前處理操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)過程中避免了有機(jī)試劑的引入，單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間為7 min，極大地縮短了待測(cè)樣品的前處理時(shí)間，檢測(cè)效率顯著提高，對(duì)食品中水蘇糖的定量具有很好的準(zhǔn)確性和更廣泛的適用性，為含水蘇糖食品的市場(chǎng)規(guī)范提供了方法支撐。