丁 媛 馮燕艷 向 芳 劉建勇 康曉靜

銀屑病是一種復(fù)雜的、炎性的、免疫學(xué)介導(dǎo)的、多因素的和過度增殖的皮膚病，遺傳和環(huán)境因素在其病因?qū)W中發(fā)揮著重要意義，約1%～3%的世界人口都患有銀屑病，不同種族后裔的患病率差異很大，表明銀屑病易感性存在種族間差異。國(guó)內(nèi)外不同研究者應(yīng)用遺傳連鎖分析原理，通過全基因組掃描研究共發(fā)現(xiàn)了至少12個(gè)不同的(PSORS)銀屑病易感基因位點(diǎn)，然而，大多數(shù)PSORS基因座的基因易感性仍不清楚[1]。近年來研究顯示許多NF-κB通路下調(diào)的基因具有銀屑病易感性，包括TNIP1和ANXA6(TNFAIP3相互作用蛋白1和膜聯(lián)蛋白A6)[2]。為研究TNIP1/ANXA6基因與新疆維吾爾族尋常型銀屑病人群相關(guān)性，筆者選擇位于TNIP1/ANXA6基因區(qū)域的rsl7728338、rs999556 2個(gè)位點(diǎn)單核苷酸基因多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)進(jìn)行分析，采用連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligasedetection reaction，LDR)對(duì)上述基因進(jìn)行基因分型，探討其與維吾爾族人群尋常型銀屑病臨床表型尤其是疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取新疆自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科332例維吾爾族尋常型銀屑病患者，診斷符合尋常型銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。 銀屑病病情輕重參照銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分，根據(jù)不同部位的皮損面積和紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)的嚴(yán)重程度，計(jì)算綜合積分。PASI≥10分為重型，<10分為輕型。 330例年齡與性別匹配的健康人來自新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院體檢中心的維吾爾族健康人群或者來自皮膚科門診無自身免疫性和系統(tǒng)性疾病的維吾爾族非銀屑病患者，同時(shí)排除其一、二、三級(jí)親屬患有銀屑病。采集外周靜脈血 5ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究已通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，并在實(shí)施過程中遵守赫爾辛基宣言，所有病例及對(duì)照均簽署知情同意書。

2.SNP選擇：根據(jù)既往文獻(xiàn)選擇2個(gè)SNP(rsl7728338和rs999556)進(jìn)行分型實(shí)驗(yàn)。

3.研究方法：(1)基因組 DNA 提?。豪没蚪M DNA 提取試劑盒(Qiagen)DNA 抽提試劑盒(250) 提取患者及對(duì)照基因組DNA，用分光光度儀分別于260nm和280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，計(jì)算DNA濃度，并用凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，所有DNA樣本均合格。 (2)引物及探針的合成：用在線軟件Primer3input 設(shè)計(jì)特異性引物，rsl7728338上游引物:5′-AAAATGTGGTTTGTTCAGC-3′,下游引物:5′-TAGGAAGGCAGGGTGCATT-3′。rs999556上游引物:5′-TTTCGCCCCTGTCATCTGGT-3′,下游引物:5′-TGCCCAAGGTCAAAGGATGA-3′。根據(jù)Oligo軟件設(shè)計(jì)LDR探針，根據(jù)LDR探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)LDR的上下游探針[3]。(3)多重PCR和LDR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系(20μl)為：1μl模板，2μl緩沖液，0.6μl Mg2+,2μl dNTP,0.2μl TaqDNA聚合酶，2μl引物混合液，PCR專用水補(bǔ)齊12.2μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2m→94℃變性30s→56℃退火1.5min→65℃延伸30s(進(jìn)行35個(gè)循環(huán))→65℃延伸10m→產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆?。LDR反應(yīng)體系(10μl)為：內(nèi)含4μl PCR產(chǎn)物，1μl×緩沖液, 1μl探針混合液，0.05μl Taq DNA連接酶，，PCR專用水補(bǔ)齊4μl。LDR反應(yīng)循環(huán)條件：95℃變性2min→94℃15s→50℃ 25s(40個(gè)循環(huán))→產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?4)測(cè)序與基因分型：擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工公司測(cè)序,測(cè)序儀器為美國(guó) ABI3730型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀完成測(cè)序并記錄結(jié)果。 最后用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，判讀各位點(diǎn)上各樣本的基因分型。

結(jié) 果

1.基線資料:病例組244例男性和88例女性銀屑病患者，對(duì)照組248例男性和82例女性健康志愿者。病例組平均年齡為40.83±23.52歲。在病例組中觀察到的活動(dòng)評(píng)分(PASI)平均為9.3±8.8分。332例病例組中，早發(fā)患者≤40歲有200例，>40歲有132例。其中斑塊狀銀屑病有304例，點(diǎn)滴狀銀屑病28例，伴有關(guān)節(jié)損害有127例，伴有指甲的損害有161例，有銀屑病家族史57例，PASI評(píng)分≥10分有183例。病例組和對(duì)照組在年齡、性別上比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表1。

表1 病例組和對(duì)照組年齡及性別分布

2.病例組和對(duì)照組間TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs17728338和rs999556 位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較：病例組與對(duì)照組間TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs17728338位點(diǎn)的基因型、等位基因分布頻率比較，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，病例組和對(duì)照組間rs999556位點(diǎn)的基因型、等位基因分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

3.TNIP1/ANXA6 SNP基因型與等位基因在維吾爾族尋常型銀屑病中臨床表型的分布:TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556 的基因型、等位基因在維吾爾族尋常型銀屑病患者臨床表型(性別、患病年齡、分型、累及指甲、累及關(guān)節(jié)、家族史、病情輕重)進(jìn)行分層比較所得χ2值、P值、OR(95% CI) 分布,見表3、表4。 TNIP1/ANXA6rs17728338位點(diǎn)分層分析中的基因型、等位基因在有家族史組與無家族史組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNIP1/ANXA6rs17728338位點(diǎn)的基因型、等位基因在PASI評(píng)分≥10分和PASI評(píng)分<10分之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在其他臨床分層分析中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TNIP1/ANXA6rs999556的基因型、等位基因在年齡、分型、是否累及指甲、是否累及關(guān)節(jié)、家族史、病情輕重分層分析后發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 病例組及對(duì)照組TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556等位基因與基因頻率分布

表3 TNIP1/ANXA6 rs17728338、rs999556基因型在維吾爾族尋常型銀屑病中臨床表型的分布

討 論

研究認(rèn)為銀屑病是具有遺傳背景的人群在環(huán)境的作用下，通過天然免疫系統(tǒng)過度活化引起的，銀屑病表皮的過度增生就是皮膚天然免疫系統(tǒng)被過度激活的結(jié)果[4,5]。TNIP1基因通過TNF-α受體、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體和Toll樣受體抑制核因子κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。NF-κB是一種天然免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)在銀屑病患者體內(nèi)TNIP1有一個(gè)被改變的甲基化模式導(dǎo)致TNIP1在銀屑病皮膚上調(diào)[6]。TNIP1不僅僅是銀屑病的易感基因位點(diǎn)，也是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的易感基因位點(diǎn)[7,8]。 ANXA6基因通過調(diào)節(jié)EGF受體相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路，在細(xì)胞表面，EGF受體被激活后可以觸發(fā)了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，發(fā)出各種信號(hào)調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，從而參與銀屑病的發(fā)病過程[9，10]。Zhang等[11]通過GWAS證實(shí)TNIP1/ANXA6基因?yàn)闈h族人尋常型銀屑病的易感基因，這兩個(gè)基因共同的易感位點(diǎn)rs3762999和rs999556和高加索人報(bào)道的rsl7728338均在同一區(qū)域。

表4 TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556等位基因在維吾爾族尋常型銀屑病中臨床表型的分布

*P<0.05

張麗君等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ANXA6基因多態(tài)性rs999556和rs3762999與漢族人尋常型銀屑病發(fā)病的易感性相關(guān)，rs999556與該病的臨床類型相關(guān)，與發(fā)病年齡和家族史不相關(guān)；rs3762999與該病的發(fā)病年齡、家族史及臨床類型均不相關(guān) 。本研究發(fā)現(xiàn)在維吾爾族銀屑病患者TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs999556位點(diǎn)與對(duì)照組等位基因及基因型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且rs999556位點(diǎn)的基因型、等位基因與該病的臨床類型、發(fā)病年齡、家族史、伴隨的臨床癥狀、疾病嚴(yán)重程度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs999556可能為漢族群體所獨(dú)立具有的銀屑病易感位點(diǎn)。而在病例組和對(duì)照組中rs17728338位點(diǎn)基因型、等位基因比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNIP1/ANXA6基因rs17728338位點(diǎn)是維吾爾族人群的易感位點(diǎn)，維吾爾族可能和漢族人群、高加索人群有著共同的致病位點(diǎn)，提示在這些不同種族人群中銀屑病發(fā)病可能存在的共同機(jī)制。

韓建文等[3]研究發(fā)現(xiàn)，TNIP1基因區(qū)域的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即rs17728338、rs3762999和rs999556在465例漢族尋常性銀屑病患者和476例健康對(duì)照組中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分層分析發(fā)現(xiàn)，rs17728338的基因型頻率在早發(fā)型、晚發(fā)型、有家族史、無家族史尋常性銀屑病組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且均顯示為顯性遺傳模式，提示TNIP1基因在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，緊接著該項(xiàng)研究還證明了TNIP1基因的5個(gè)單核苷酸片段rs3805435、rs3792798、rs3792797、rs869976、rs17728338和rs999011在泛發(fā)性膿皰型銀屑病病例組和對(duì)照組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是在沒有尋常型銀屑病皮損的患者中，但在掌跖膿皰病中沒有差異性，從而證明TNIP1基因是泛發(fā)性膿皰型銀屑病的易感基因[13]。本研究也證實(shí)了TNIP1/ANXA6基因rs17728338位點(diǎn)的基因型頻率在有家族史及無家族史的維吾爾族尋常型銀屑病患者中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明了TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs17728338對(duì)于家族史陽性的漢族、維吾爾族發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大，與既往在漢族銀屑病人群中研究結(jié)果相一致。

Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP3基因rs610604基因多態(tài)性和尋常型銀屑病的發(fā)生相關(guān)，患者病情分層分析(PASI≥6分和PASI<6分之間)發(fā)現(xiàn)上述兩項(xiàng)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Indhumathi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在南印度泰米爾人群中360例尋常型銀屑病患者和360例對(duì)照組中TNFAIP3(rs610604)、TNIP1 (rs17728338) 的基因多態(tài)性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其前者和家族史相關(guān)，后者和疾病的PASI評(píng)分可能相關(guān)，雖然顯性模式下比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在基因型AA的頻率上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，TNIP1/ANXA6基因rs17728338的基因型、等位基因在病情分層分析(PASI≥10分和PASI<10分之間)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs17728338和維吾爾族尋常型銀屑病病情相關(guān)。而在性別、早發(fā)晚發(fā)、斑塊狀銀屑病和點(diǎn)滴狀銀屑病、有無關(guān)節(jié)損害、有無指甲損害均未發(fā)現(xiàn)TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs17728338的基因型、等位基因分布存在差異。

Yin等[16]研究發(fā)現(xiàn),TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs3762999(P=0.0257) 和 rs999556(P=0.0071)在飲酒和不飲酒漢族銀屑病人群中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在吸煙和不吸煙的漢族銀屑病人群中 CSMD1基因多態(tài)性rs7007032 (P=0.0023)和rs10088247(P=0.0023) 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此項(xiàng)研究進(jìn)行了基因和環(huán)境交互作用的相關(guān)分析。本研究沒有針對(duì)TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性和維吾爾族銀屑病人群的生活習(xí)慣相關(guān)性進(jìn)行分析，可以在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，TNIP1/ANXA6基因rs17728338與維吾爾族尋常型銀屑病發(fā)病的易感性相關(guān)，rs17728338對(duì)于家族史陽性的維吾爾族發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大，且和維吾爾族尋常型銀屑病病情相關(guān)。TNIP1/ANXA6基因多態(tài)性rs999556和維吾爾族尋常型銀屑病發(fā)病的易感性不相關(guān)，與漢族人群研究結(jié)果不同，進(jìn)一步證明了不同種族人群的遺傳異質(zhì)性。