劉 蕾，楊 勇，高 欣，劉曉雷，唐 斌，王學林，劉明遠，白 雪

近年來，旋毛蟲的基因組、轉錄組、表觀基因組和蛋白質組的研究為深入了解旋毛蟲生物學、旋毛蟲-宿主相互作用和發(fā)病機理奠定了堅實的分子基礎[1-2]。然而，對于旋毛蟲蛋白質生物合成過程中或之后發(fā)生的轉錄后修飾(Post Transcriptional Modification, PTMs)至今沒有相關報到，限制了旋毛蟲侵襲過程中關鍵蛋白分子的功能研究。PTMs可以調控蛋白質的性質，包括折疊、穩(wěn)定性、定位、結合親和力和活性，它們在多種細胞途徑和過程中發(fā)揮重要作用。由于它們在調節(jié)蛋白質功能及代謝和基因轉錄等細胞過程中發(fā)揮關鍵作用，因此，蛋白質PTMs的研究在后基因組時代變得更加重要[3]。迄今為止，已經鑒定了超過461種不同的PTM，例如磷酸化、甲基化、泛素化、丙二?；㈢牾；?、糖基化和乙?；湓谠S多原核和真核蛋白質的功能調節(jié)中發(fā)揮作用[4]。這些PTM形成一個復雜的監(jiān)管系統(tǒng)，用于在各種條件下細胞的動態(tài)調控。

研究表明，乙?；梢哉{節(jié)寄生蟲的發(fā)育和抗原變異，這主要是由強選擇壓力決定的[5]。旋毛蟲的完整生命周期發(fā)生在單一宿主體內，可分為3個主要階段：肌幼蟲期(ML)，成蟲期(AD)和新生幼蟲期(NBL)。它們占據(jù)了2個不同的細胞內龕：腸細胞和骨骼肌細胞[6]。在這些發(fā)育階段，旋毛蟲已進化出適應不同環(huán)境并成功建立感染(例如寄生蟲表面抗原的變異)的策略。因此，旋毛蟲不同發(fā)育階段的乙?；鞍踪|組的研究，有助于揭示賴氨酸乙?；谡{節(jié)旋毛蟲發(fā)育轉變及其在不同生活環(huán)境的選擇壓力下成功寄生中的作用。本研究第一次大規(guī)模分析旋毛蟲肌幼蟲期蛋白質中賴氨酸乙?；潭?，不僅可以拓展我們對蠕蟲蛋白乙酰化的知識，而且為設計新的控制旋毛蟲病的疫苗及藥物靶點提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1細胞、實驗動物與旋毛蟲蟲種 Wistar大鼠，購自長春生物制品研究所，用于旋毛蟲傳代保種及旋毛蟲肌幼蟲收集。中國河南豬旋毛蟲分離株T.spiralis(ISS534)，由本室傳代保種。

1.1.2主要試劑 胃蛋白酶、胰蛋白酶、三氟乙酸購自Sigma公司；三氯乙酸(TCA)、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)購自Merck公司；蛋白酶抑制劑購自碧云天生物技術有限公司；2-D Quant試劑盒購自GE Healthcare公司；EDTA購自索萊寶公司；抗乙酰賴氨酸抗體珠購自PTM Biolabs公司；C18 ZipTips購自美國Millipore公司。

1.2 方 法

1.2.1旋毛蟲收集和蛋白質提取 旋毛蟲(ISS534)在Wistar大鼠中通過連續(xù)傳代保種。取旋毛蟲ISS534感染后35 d(dpi)的Wistar大鼠1只，脫頸致死，37 °C人工消化液(10 g/L胃蛋白酶和10 mL/L濃鹽酸)消化胴體2 h后，采用自然沉淀的方法收集感染性肌幼蟲(ML)隨后進行蟲體蛋白的提取。用含有8 mol/L尿素，10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)和0.1%蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液裂解旋毛蟲后，進行超聲處理，并通過20 000×g、4 ℃離心10 min除去細胞碎片。離心后的上清液用預冷的15%三氯乙酸(TCA)在-20 ℃沉淀2 h后離心。沉淀用預冷的丙酮洗滌3次，隨后溶解在含有8 mol/L尿素和100 mmol/L NH4CO3(pH 8.0)的緩沖液中，2-D Quant試劑盒(GE Healthcare)測量蛋白質濃度。

1.2.2樣品制備和高效液相色譜(HPLC)分離肽段

用10 mmol/L DTT和20 mmol/L碘乙酰胺(IAA)對蛋白進行還原和烷基化處理，并用胰蛋白酶(1∶50質量比)過夜消化。為確保完全消化，以1∶100(質量比)再次消化4 h。隨后使用高pH反相HPLC將胰蛋白酶肽分成6個部分并將分離的肽在Speed Vac(Thermo Scientific)中干燥，保存在-80 ℃，用于乙?；患治?。

1.2.3親和富集和液相色譜電噴霧串聯(lián)質譜(LC-ESI-MS/MS)分析 將分級分離的肽溶解在含有100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl和0.5% NP-40(pH8.0)的NETN緩沖液中，并在4 ℃下與抗乙酰賴氨酸抗體珠(PTM Biolabs)孵育過夜。用NETN緩沖液和去離子H2O洗滌后，0.1%三氟乙酸洗脫肽段，真空干燥。在HPLC/MS/MS 分析前用C18 ZipTips(Millipore)清理洗脫的肽段。隨后，利用EASY-nLC 1000超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)上在Q Exactive 質譜儀(Thermo Fisher Scientific)對所富集的肽段進行LC-ESI-MS/MS分析，所得到的MS/MS數(shù)據(jù)使用MaxQuant軟件和整合的Andromeda搜索引擎(v.1.5)進行處理。使用以下參數(shù)在UniProt上的T.spiralis數(shù)據(jù)庫對串聯(lián)質譜進行查詢[7]：胰酶酶解肽段在譜圖搜庫時使用最大4個漏切位點，每個肽段最大4個修飾個數(shù)。Mass error 設置為母離子10-6，碎片離子0.02 Da。指定Cys上的氨甲酰甲基化為固定修飾，指定Met上的氧化，Lys上的乙?；偷鞍踪|N-末端上的乙?；癁榭勺冃揎?。蛋白、肽段和乙?；腇DR閾值設置為1%, 最小肽段長度為7。

1.2.4生物信息學分析 利用UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫對鑒定的蛋白進行GO(gene ontology)功能注釋。利用Wolfpsort對每個乙?；牡鞍走M行亞細胞定位注釋。在對目標蛋白質集合進行GO注釋或KEGG通路注釋的富集分析時，通過Fisher精確檢驗(Fisher’s Exact Test)，來分析乙?；鞍譍O或KEGG通路蛋白質富集度的顯著性水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1旋毛蟲賴氨酸乙?；鞍椎蔫b定與分析 分析表明分子量偏差的分布接近零，大部分≤10-6(圖1A)。此外，所有賴氨酸乙?；牡拈L度都在7到37個氨基酸之間，這與胰蛋白酶消化的肽一致(圖1B)。這些結果表明樣品制備方法是正確的，并且從MS獲得的修飾的肽數(shù)據(jù)是高度準確的。本實驗共鑒定出1 592個乙酰化蛋白及3 872個Kac位點，旋毛蟲的乙?；鞍缀胁煌瑪?shù)目的乙?；稽c，范圍從1至47(圖1C)，約一半(795/1 592)僅含有一個乙?；稽c，平均每個蛋白2.4個位點。

(A)所有鑒定的肽的質量誤差分布；(B)乙?；牡拈L度分布；(C)乙?；揎椀鞍仔揎椢稽c的分布圖1 組學基于的旋毛蟲賴氨酸乙?；稽c的鑒定 Fig.1 Proteome-wide identification of lysine acetylation sites in T. spiralis

2.2旋毛蟲賴氨酸乙?；?Kac)保守性分析 在旋毛蟲的1 592個乙?；鞍字校?08個(35.5%)和87個(30%)的蛋白分別與日本血吸蟲和弓形蟲乙酰化蛋白存在同源物，479個(35.2%)和471個(36.3%)的蛋白分別與小鼠和人類乙?；鞍状嬖谕次?。159個(31.6%)和190個(39.8%)蛋白分別與釀酒酵母和白色念珠菌存在同源物，而僅43個(12.3%)與大腸桿菌乙?；鞍状嬖谕次?圖2)。

圖2 分析比較旋毛蟲乙酰蛋白質組與大腸桿菌，芽殖酵母(釀酒酵母)，白色念珠菌，剛地弓形蟲，日本血吸蟲，小鼠和人類的乙?；鞍踪|組 Fig.2 Analysis comparing the T. spiralis acetyl proteome with those of E. coli, budding yeast (S. cerevisiae), C. albicans, T. gondii, S. japonicum, mouse, and human. Venn diagram describing the relationships among lysine-acetylated proteins from these species.

2.3乙?；鞍踪|在旋毛蟲中的功能注釋和細胞定位 我們對乙酰化的蛋白質組學數(shù)據(jù)進行了基因本體(gene ontology，GO)分析。細胞組件聚類分析顯示旋毛蟲乙酰化蛋白質主要分布在細胞(37%)，細胞器(24%)，大分子復合物(22%)和膜(13%)中。分子功能的聚類分析顯示，最大一組乙?；鞍讌⑴c各種靶標結合，占所有鑒定乙?；鞍踪|的40%(圖3B)。本文的結果與以前的研究結果一致，其中相當數(shù)量的具有催化活性的蛋白被乙酰化。GO生物過程的聚類分析顯示乙?；鞍字饕獏⑴c細胞和代謝過程，分別占識別蛋白的29%和28%(圖3C)。本文也分析了1 592個乙?；鞍踪|在旋毛蟲中的亞細胞定位(圖3D)，結果表明大多數(shù)鑒定的Kac蛋白質定位于細胞質(38%)，其次是細胞核(17%)和線粒體(12%)。這一結果與生物過程分析結果一致，表明大部分乙?；鞍踪|參與細胞代謝和蛋白質合成。重要的是，還發(fā)現(xiàn)一些乙?；鞍踪|是細胞質膜(12%)或細胞外蛋白質(12%)定位，其可能調節(jié)旋毛蟲表面蛋白和分泌蛋白，影響旋毛蟲與宿主細胞之間的相互作用。

2.4功能富集分析 進一步對乙?；瘮?shù)據(jù)進行了GO富集分析?；谏镞^程的GO富集分析顯示，乙?；鞍踪|富集于生物合成和代謝過程(圖4A)。同時還進行了KEGG富集分析，數(shù)據(jù)表明，旋毛蟲(T.spiralis)的乙?；鞍踪|組在蛋白質生物合成和3種類型的生物大分子的代謝中高度富集(圖4B)。

(A)根據(jù)細胞成分分類的乙?；鞍踪|；(B)根據(jù)生物學過程分類的乙?；鞍踪|；(C)根據(jù)分子功能分類的乙酰化蛋白質；(D)鑒定的乙?；鞍椎膩喖毎ㄎ?。圖3 基因本體功能分類和亞細胞定位信息鑒定乙酰化蛋白質Fig.3 Gene Ontology functional classification and subcellular location information of identified acetylated proteins

(A)就分子功能，細胞組分和生物過程而言，乙?；鞍踪|的基于GO的富集分析；(B)KEGG途徑富集分析。圖4 旋毛蟲乙?；鞍椎母患治?Fig.4 Enrichment analysis of acetylated proteins in T. spiralis

3 討 論

賴氨酸乙酰化(Kac)是一種動態(tài)可逆且高度保守的翻譯后修飾，是乙?；D移酶 (lysineacetyltransferase, KAT) 和去乙?；?(lysine deacetylase, KDAC)催化乙酰輔酶A(acetyl-CoA)提供的乙?；鶊F到蛋白質分子賴氨酸殘基的可逆轉移過程。Kac首先在真核組蛋白中被鑒定，它參與調節(jié)染色質結構和DNA轉錄[7]。除了在組蛋白中的作用外，Kac還存在于許多非核蛋白中參與不同的細胞生理過程，如細胞骨架動力學、凋亡、自噬和代謝[8]。另外，乙?；灿绊懖≡亩玖涂股乜剐訹9]。盡管Kac在許多生物體中發(fā)揮重要作用，但是迄今為止，蠕蟲賴氨酸乙?；难芯肯鄬τ邢?。旋毛蟲作為重要的寄生蠕蟲，其基因組的測序揭示了許多乙酰轉移酶和脫乙酰酶同源物的存在，表明Kac可能在旋毛蟲的發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要作用[10]。Kac過程依賴氨酸乙酰轉移酶和去乙酰酶(KDAC)調節(jié)，比其他PTMs的調控范圍廣泛并且更有可比性。KDAC已被確定為開發(fā)新型抗寄生蟲治療的藥物靶點，并且一些KDAC配體顯示出治療寄生蟲病的潛力[11]。

本項究中，我們利用抗賴氨酸乙酰化抗體富集技術結合高度靈敏的質譜鑒定在組學層面分析旋毛蟲中的賴氨酸乙?；潭龋l(fā)現(xiàn)旋毛蟲1 592種蛋白質872個賴氨酸位點發(fā)生了乙?；揎?，超過了已報道的日本血吸蟲中Kac水平[12]，表明Kac在旋毛蟲發(fā)育、寄生中的重要作用。與以前的研究結果一致，大量的乙酰化蛋白質涉及代謝和生物合成過程。進一步分析表面，大約一半的乙酰化蛋白存在2個以上的修飾位點。乙酰化轉移酶通過修飾非組蛋白的多重位點利用不同的機制調節(jié)從細胞信號、蛋白轉錄、降解等不同的細胞進程[13]。這是旋毛蟲蛋白的多重位點乙?；揎椩谡{節(jié)蛋白功能中的作用需要進一步的研究。大量的證據(jù)表明，乙?；揎椏赡苁沁M化保守在不同的種屬[14]。

我們對乙酰化的蛋白進行了保守性分析，結果表明旋毛蟲和大腸桿菌之間的同源性最低，這可能反應了真核與原核生物間不同的細胞結構及生物進程。而旋毛蟲和白色念珠菌之間的同源性最高，這可能與它們之間的遺傳性相關，也可能他們有著相似的亞細胞分布。在其他真核生物和原核生物中也報道了乙酰化蛋白質在各種途徑(包括翻譯，轉錄和代謝)中高度富集，我們的GO和KEGG富集結果進一步表明了Kac在各種生物體中的重要作用。乙?；揎椩谔谴x已被表面發(fā)揮著重要的作用在調節(jié)寄生蟲生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲糖酵解相關酶中僅僅葡萄糖六磷酸異構酶(GAPDH)沒有發(fā)生乙酰化[15]，而在血吸蟲中，全部的糖酵解發(fā)生了乙?；揎?。我們的研究發(fā)現(xiàn)，僅僅GAPDH沒有發(fā)生乙?；揎?。結果表明與其他寄生蟲一樣，乙?；揎椩谛x糖代謝調節(jié)中同樣發(fā)揮著重要的作用。已表明吞噬在寄生蟲獲取營養(yǎng)，細胞增殖和寄生蟲毒力中發(fā)揮重要的作用。有趣的是，根據(jù)功能富集分析，29個乙酰化蛋白與吞噬作用相關，表明賴氨酸乙?；谶@一過程中的重要作用[16]?？傊?，本研究首次對旋毛蟲乙?；膱蟮溃峁┝诵x乙?；瘓D譜，為進一步探索賴氨酸乙?；谌湎x的寄生作用提供了重要數(shù)據(jù)。

利益沖突：無