徐 然，韓生華，王利剛，李春成，劉之博

(1.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同037009;2.南京信息工程大學(xué)，江蘇南京210044)

脂肪酶(Lipase)是一類羧基酯水解酶，可催化酯類物質(zhì)的解酯、酯交換以及酯合成等反應(yīng)[1]。與普通化學(xué)催化劑相比，脂肪酶具有高催化活性、高特異性以及綠色環(huán)保性等優(yōu)點(diǎn)[2]，已逐步應(yīng)用于日化、能源、醫(yī)藥以及食品等領(lǐng)域[3-4]。然而，游離狀態(tài)的脂肪酶穩(wěn)定性差、成本高、無(wú)法回收利用，使得脂肪酶難以進(jìn)一步被工業(yè)化應(yīng)用[5]。脂肪酶固定化技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展逐步解決了游離脂肪酶的這些缺點(diǎn)[6]。脂肪酶固定化技術(shù)是指通過(guò)某些化學(xué)或者物理的方法將脂肪酶限制在特定的空間范圍內(nèi)發(fā)生酶促反應(yīng)的技術(shù)[7-8]。常用的脂肪酶固定化技術(shù)包括吸附法、交聯(lián)法、包埋法以及共價(jià)結(jié)合法[9-10]，其中，共價(jià)結(jié)合法制備的固定化脂肪酶具有穩(wěn)定性高、不易失活等優(yōu)點(diǎn)更受到廣泛研究。

我們采用共價(jià)結(jié)合法制備固定化脂肪酶，并對(duì)固定條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)固定后脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為其今后工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器、HH-S2兩孔水浴鍋、SHZ-D循環(huán)水式真空泵，購(gòu)自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；MA200電子天平，購(gòu)自上海良平儀器儀表有限公司；101AB-1 電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自菏澤市石油化工學(xué)校儀器設(shè)備廠；KDM 電熱套，購(gòu)自山東省鄄城大華儀器廠；SB—5200DTDN超聲波清洗機(jī)，購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司。

脂肪酶，實(shí)驗(yàn)室自制（酶活力：6.08×104μmol/g)；戊二醛50%，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、無(wú)水乙醇、聚乙烯醇均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；橄欖油，成都科龍化工試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 醛基硅膠的制備

取實(shí)驗(yàn)室自制氨基硅膠（氨基鍵含量為1.019 1 mmol/g）于錐形瓶中，加入適量一定濃度的戊二醛溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)。將反應(yīng)之后的溶液抽真空過(guò)濾，用去離子水將多余的戊二醛沖洗干凈，于室溫下干燥后對(duì)固體進(jìn)行收集。

1.2.2 脂肪酶的固定化

取0.5 g 上述醛基硅膠，加入5 mL 1 mg/mL 的脂肪酶液和5 mL pH為7.5的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，在室溫下磁力攪拌6 h。將反應(yīng)后的溶液進(jìn)行抽真空過(guò)濾，分別對(duì)濾液及固定酶進(jìn)行收集，固定酶于室溫下干燥備用。

分別對(duì)加入反應(yīng)的游離酶、反應(yīng)后的濾液以及固定酶進(jìn)行酶活的測(cè)定，以下列公式進(jìn)行酶活回收率的計(jì)算：

1.2.3 脂肪酶活力測(cè)定

采用橄欖油乳化法對(duì)酶活進(jìn)行測(cè)定。

將5.0 mL 乳化劑和4.0 mL 0.1 mol/L pH 為8.0的磷酸緩沖液分別加入到空白a、樣品b和樣品c錐形瓶中，于40 ℃恒溫水浴鍋里保溫5.0 min，樣品b、c 加入1.0 mL 待測(cè)酶液反應(yīng)10.0 min 后，分別向3 個(gè)瓶子中加入20.0 mL 無(wú)水乙醇同時(shí)終止反應(yīng)。加入酚酞作指示劑，用NaOH 溶液滴定反應(yīng)出來(lái)的脂肪酸，當(dāng)溶液變微紅時(shí)記錄滴定過(guò)程所用NaOH的體積量。

式中：a—空白 a 消耗的 NaOH 溶液的體積，b、c—樣品b、c消耗的NaOH 溶液的體積，N—NaOH的濃度，F(xiàn)—稀釋倍數(shù)，T—反應(yīng)所需時(shí)間（min）

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響

分別采用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的戊二醛進(jìn)行優(yōu)化，戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響見(jiàn)圖1。隨著戊二醛濃度的增大，酶活回收率呈先上升后下降趨勢(shì)，在戊二醛濃度為1.5%時(shí)，酶活回收率最大。這是因?yàn)樵谖於舛容^低時(shí)，可與酶結(jié)合的醛基數(shù)量較少。當(dāng)戊二醛濃度提高時(shí)，有更多的醛基與氨基硅膠中氨基發(fā)生結(jié)合，相應(yīng)的固定化酶的數(shù)量也有所提高，故酶的固定率提高。但戊二醛濃度過(guò)大時(shí)，與醛基發(fā)生鍵合的酶量增加，這使得酶催化反應(yīng)的空間位阻也增加，從而導(dǎo)致酶活回收率下降。

圖1 戊二醛濃度對(duì)酶活回收率的影響

2.1.2 給酶量對(duì)酶固定化的影響

分別采用0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/ mL 的脂肪酶溶液進(jìn)行優(yōu)化，給酶量對(duì)酶固定化的影響結(jié)果如圖2。在酶的濃度低于0.5 mg/mL 時(shí)，其酶活回收率隨濃度的提高而提高。在酶濃度為0.5 mg/ mL時(shí)，酶活回收率最大。繼續(xù)增大酶濃度，其酶活回收率反而降低。

圖2 酶液濃度對(duì)酶活回收率的影響

當(dāng)脂肪酶濃度較低時(shí)，脂肪酶可以充分與醛基硅膠結(jié)合，固定化脂肪酶的酶活回收率取決于加入的脂肪酶的濃度，當(dāng)脂肪酶濃度升高時(shí)，相應(yīng)的固定酶的酶活回收率也增加。當(dāng)脂肪酶濃度持續(xù)增大時(shí)，脂肪酶分子間會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合醛基硅膠增加空間位阻，反而造成酶活回收率降低。

2.1.3 pH對(duì)酶固定化的影響

分別采用pH 為5.5、6.5、7.5、8.5、9.0 進(jìn)行優(yōu)化，酸堿度對(duì)酶固定化的影響如圖3。在pH 低于7.5時(shí)，酶活回收率隨pH 的升高而提高；在pH 為7.5時(shí)，酶活回收率最大。此后繼續(xù)增大pH，酶活回收率呈下降趨勢(shì)。

pH 的大小會(huì)影響脂肪酶的帶電荷量、空間構(gòu)象以及酶活性基團(tuán)的解離狀態(tài)。pH 會(huì)改變酶的微觀結(jié)構(gòu)，從而改變酶的催化能力。過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境都會(huì)引起酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去活力。

圖3 pH對(duì)酶活回收率的影響

2.1.4 固定時(shí)間對(duì)酶固定化的影響

分別采用3、6、12、15、18 h 固定時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。固定時(shí)間對(duì)酶固定化的影響如圖4。在固定時(shí)間少于6 h 時(shí)，酶活回收率隨著固定時(shí)間的增加而顯著提高；在固定時(shí)間為6 h 時(shí)，酶活回收率達(dá)到最大。繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)，所測(cè)得的酶活回收率略微下降。

圖4 固定時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響

圖中出現(xiàn)這樣的趨勢(shì)是因?yàn)槊富钚愿叩筒粌H僅取決于其與醛基鍵合的時(shí)間，同時(shí)也受到戊二醛變性作用的影響。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，二者之間的鍵合反應(yīng)進(jìn)行的越完全，酶的固定量也高，但過(guò)度的鍵合反應(yīng)會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性，同時(shí)固定后的酶也會(huì)隨時(shí)間而出現(xiàn)一定程度的失活。

2.1.5 溫度對(duì)酶固定化的影響

分別采用0、20、30、40、50 ℃ 進(jìn)行優(yōu)化。溫度對(duì)脂肪酶固定化的影響如圖5。酶活回收率隨著溫度的升高呈先增加后下降的趨勢(shì)，在固定溫度為30 ℃時(shí)，酶活回收率最大為49.6%。

圖5 溫度對(duì)酶活回收率的影響

溫度對(duì)脂肪酶的影響很大，在一定范圍內(nèi)，升溫能使酶的固定速度增加。但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，從而使酶蛋白變性，所以超出一定的溫度范圍會(huì)使脂肪酶失活而影響酶活回收率。

2.2 游離脂肪酶和固定化脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的比較

2.2.1 最適反應(yīng)溫度的比較

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放入10、20、30、35、40 及50 ℃ 的催化溫度下測(cè)定酶活，結(jié)果如圖6。游離酶經(jīng)固定化后其酶學(xué)性質(zhì)中的最適反應(yīng)溫度由40 ℃降低到35 ℃，這是因?yàn)槊傅膭傂越Y(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。但隨著溫度的升高，兩種脂肪酶的酶活都會(huì)大幅度下降，是因?yàn)檫^(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而失活。

圖6 游離脂肪酶和固定化脂肪酶的反應(yīng)溫度曲線

2.2.2 最適反應(yīng)pH的比較

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶在其各自最適溫度下分別放入pH 為5.5、6.5、7.5、8.0、8.5、9.0 的催化環(huán)境中測(cè)定酶活。結(jié)果如圖7，游離酶和固定酶的最適反應(yīng)pH均為8。在其他條件相同的情況下，pH不僅可以影響酶的活性，同樣會(huì)影響反應(yīng)底物的解離狀態(tài)。過(guò)高或過(guò)低的pH都不利于酶的催化。

圖7 游離脂肪酶和固定化脂肪酶的反應(yīng)pH曲線

2.2.3 熱穩(wěn)定性分析

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放置在30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境中1 h后再測(cè)定其脂肪酶活力，以各自酶活損失百分比（損失酶活占初始酶活的百分?jǐn)?shù)）為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作圖8。

圖8 脂肪酶的酶活損失百分比圖

在不同的溫度下放置1 h 后，可以看出，在任何溫度下，游離脂肪酶比固定化脂肪酶的酶活損失都要高。酶分子的伸展變形以及分子的自我變形可能是酶失活的主要原因，而固定化酶中載體的存在增加了酶分子的剛性阻止了它的變形。但隨著溫度逐漸升高，酶活損失量不斷增加，這是因?yàn)樵黾拥膭傂允怯幸欢ㄏ薅鹊摹?/p>

2.2.4 有機(jī)溶劑穩(wěn)定性分析

將游離酶和固定酶分別放置于10 mL 的甲醇、丙酮、石油醚、環(huán)己烷溶液中1 h 后測(cè)定其脂肪酶活力。酶在有機(jī)相中的穩(wěn)定性是影響其能否長(zhǎng)時(shí)間且有效進(jìn)行催化反應(yīng)的重要因素。以酶活損失百分比為縱坐標(biāo)，各種有機(jī)溶劑為橫坐標(biāo)作圖9。可以看出在非極性有機(jī)溶劑環(huán)己烷中兩種酶酶活損失較少，而在極性溶劑如丙酮、甲醇中酶活損失較多。但總體上固定酶在有機(jī)溶劑中損失酶活量較少，比游離酶在有機(jī)相中更穩(wěn)定。

2 種酶在有機(jī)溶劑中的酶活都降低了，且酶在非極性有機(jī)溶劑的耐受性要高于在極性有機(jī)溶劑，如在環(huán)己烷中的酶活始終高于在甲醇中的酶活，這可能是由于非極性溶劑不易奪取酶構(gòu)象中的必需水，而極性溶劑恰恰相反，從而導(dǎo)致酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使酶失去活性。所以，脂肪酶在有非極性有機(jī)溶劑中難失活的性能有助于推動(dòng)有機(jī)相催化反應(yīng)的發(fā)展。

2.2.5 重復(fù)使用性分析

對(duì)游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別進(jìn)行重復(fù)使用性分析，結(jié)果如圖10。游離脂肪酶無(wú)法進(jìn)行回收再利用，沒(méi)有重復(fù)利用性。固定化脂肪酶經(jīng)過(guò)6次重復(fù)使用之后，仍有38.24 %的初始固定酶活。重復(fù)使用性是固定化脂肪酶的一大特點(diǎn)，將有助于降低使用成本、實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

圖10 固定化酶的重復(fù)利用性曲線

2.2.6 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放置于室溫環(huán)境下，并在每天固定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定酶活力。酶的活性會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，擁有好的穩(wěn)定性會(huì)使其更適合在工業(yè)等方面的應(yīng)用。以相對(duì)酶活率為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖11?？梢钥闯觯潭ɑ久傅姆€(wěn)定性比游離脂肪酶更好，在放置5 d后仍有34.12%的初始固定酶活。

圖11 酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性曲線

3 結(jié)論

采用共價(jià)結(jié)合法將游離脂肪酶固定于自制氨基硅膠上，通過(guò)優(yōu)化固定條件可使其酶活回收率達(dá)到49.6%。并進(jìn)一步對(duì)比了游離脂肪酶與固定化脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)，表明脂肪酶經(jīng)固定后，不僅獲得了重復(fù)使用性，且其熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性都得到增強(qiáng)。固定化脂肪酶將極大降低游離脂肪酶的使用成本，為其今后工業(yè)化應(yīng)用提供參考。