李 欣,盧永昌

(1.青海民族大學藥學院，青海西寧810007；2.青海省藥物分析重點實驗室，青海西寧810007；3.青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室，青海西寧810007）

塞北紫堇（Corydalis impatiens）為罌粟科紫堇屬，主要分布于青海、甘肅、內(nèi)蒙古等地,生山地疏林中或草坡上。在藏藥中，主要用于治療高血壓、肝炎、腸胃炎及活血化瘀等[1-2]。生物堿是存在于塞北紫堇中的一大主要成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理活性[3-4]。通過建立高效毛細管電泳法來測定其生物堿含量的技術(shù)研究較少，現(xiàn)采用HPCE法測定其原阿片堿的含量，為其進一步的開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗儀器

美國Agilent7100毛細管電泳系統(tǒng)、石英毛細管（64.5 cm×50 μm，有效長度56 cm），pHS-3C 酸度計（成都世紀方舟科技有限公司），AL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司上海分公司），KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 實驗試劑及實驗藥材

硼砂、鹽酸（藥集團化學試劑有限公司）；甲醇，乙腈；原阿片堿對照品（批號：MUST-18110711）。

藥材于2018年采于青海省，由青海民族大學林鵬程教授鑒定，確定為塞北紫堇。

2 實驗方法

2.1 溶液制備

供試樣品溶液的制備：稱取塞北紫堇粉末約0.5 g，加甲醇10 mL，超聲提取。

對照品溶液：稱取原阿片堿對照品0.28 mg，用甲醇溶解并定容。

所制備的溶液均用0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2.2 電泳條件

檢測波長270 nm；壓力進樣5 mba×5 s；分離電壓17 kV；毛細管溫度20 ℃；選用50 mmol/L 硼砂-15%的乙腈為緩沖溶液（pH = 8.85)，并過0.45 μm 微孔濾膜過濾。

供試品A、對照品B溶液的HPCE圖譜見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別移取原阿片堿對照品溶液0.3、0.8、1.3、1.8、2.3、2.8 mL，置于 10 mL 量瓶中 ,用甲醇定容至刻度，電泳測得各個對照品濃度所對應的峰面積，并以峰面積為縱坐標，以對照品濃度為橫坐標做標準曲線。得回歸方程為Y= 2369.1X+20.623。結(jié)果表明原阿片堿在濃度為0.006 ～0.056 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

取對照品溶液，連續(xù)進樣6 次,記錄原阿片堿的峰面積并計算RSD為1.25%。表明用此方法的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h 進樣, 計算RSD為1.76%。實驗結(jié)果表明該供試品溶液在8 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

圖1 供試品A、對照品B溶液的HPCE圖譜

2.6 重復性試驗

稱取塞北紫堇藥材6 份,用甲醇超聲提取，測得原阿片堿相應峰面積并計算其RSD為1.97%。實驗結(jié)果表明該試驗的重復性較好。

2.7 加樣回收率

稱取已知原阿片堿含量的細果角茴香樣品6份，分別按80%、100%、120%3個濃度加入原阿片堿對照品，制備供試品溶液，電泳測得原阿片堿的加樣回收率及RSD為0.4%。

3 討論

3.1 緩沖液的選擇

通過幾種緩沖液的選擇：磷酸-甲醇、磷酸-乙腈、硼砂-甲醇、硼砂-乙腈，發(fā)現(xiàn)硼砂-乙腈的的分離效果最佳。

3.2 緩沖溶液pH的選擇

確定硼砂-乙腈緩沖體系后，用不同的酸、堿調(diào)緩沖液的pH, 最后確定為用HCl 調(diào)至pH = 8.73為最佳，分離效果達到做好。

3.3 有機溶劑的選擇

甲醇、乙腈能夠增加毛細管的電滲流，從而改善分離效果。乙腈和甲醇的圖譜進行對比，乙腈的分離效果優(yōu)于甲醇。

3.4 分離電壓

分離電壓的大小決定出峰的快慢，當達到17 kV時出峰最為恰當。

通過多種因素的考察，包括緩沖溶液、pH、分離電壓、有機溶劑等，發(fā)現(xiàn)在5 min內(nèi)，分離電壓為17 kV、以四硼酸鈉-乙腈為緩沖溶液且pH 為8.85時，分離效果最為滿意，原阿品堿完全分離。添加少量的乙腈可以改善分離效果，乙腈的體積不宜過高，否則會導致毛細管內(nèi)殘留結(jié)晶。