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2019-11-02 13:16:49常霞景炳年范毅王偉劉雨晴李智寧郭唯魏磊
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年16期
常霞 景炳年 范毅 王偉 劉雨晴 李智寧 郭唯 魏磊
摘要：以金銀花為原料，乙醇為溶劑，考察超聲輔助提取金銀花總?cè)频淖罴压に?。在單因素（料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度）試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法，研究各因素間相互作用及對(duì)三萜提取率的影響，獲得最佳提取工藝為料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度75%、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度45 ℃，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，三萜提取率為371%，與理論值接近;通過(guò)微量稀釋法檢測(cè)常見(jiàn)致病菌對(duì)金銀花總?cè)频拿舾行?，最小抑菌濃度范圍?～24 mg/mL之間，證明金銀花三萜具有較強(qiáng)的抗菌作用;DPPH、ABTS自由基清除試驗(yàn)IC50分別為26.1、18.8 mg/mL，說(shuō)明金銀花三萜具有一定的抗氧化活性。本研究為金銀花三萜進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞：金銀花;總?cè)?響應(yīng)面;抗菌;抗氧化;提取工藝
中圖分類號(hào)：R284 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A
文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0178-05
收稿日期：2018-05-14
基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：182102310061）;河南省科學(xué)院基本科研項(xiàng)目（編號(hào)18JK16015）。
作者簡(jiǎn)介：常 霞（1963—），女，山西陵川人，高級(jí)工程師，從事中藥化學(xué)研究。Tel：（0371）65353099;
通信作者：魏 磊，博士，助理研究員，從事植物化學(xué)及分子生物學(xué)研究。Tel：（0371）65353099;
金銀花是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開(kāi)的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，多用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等病癥[1]，其藥用成分主要包括揮發(fā)油、有機(jī)酸類、黃酮和三萜類化合物。三萜類化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、降血脂、降低膽固醇、增加免疫力等多種藥理功能[2-5]，且毒性較低，因此成為中外研究的熱點(diǎn)之一[6]。目前，從金銀花中已分離出30多個(gè)三萜類化合物[7]，并有保肝和利膽的功效[8]，但針對(duì)金銀花中三萜類化合物的總量、提取工藝及抗菌抗氧化活性等方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。
提取是回收和純化生物活性物質(zhì)最初始且重要的一步，多種因素會(huì)影響提取效率和產(chǎn)量[9]，因此優(yōu)化提取工藝最大程度提取生物活性物質(zhì)十分必要。超聲波提取技術(shù)提取效率高、耗能低、不破壞活性成分[10]。同時(shí)，響應(yīng)面法可以對(duì)多種影響提取效率的因素及因素間相互作用進(jìn)行有效性分析[11]。近年來(lái)，響應(yīng)面法結(jié)合超聲輔助提取技術(shù)在優(yōu)化黃酮[12]、多糖[13]等天然活性成分的提取工藝中得到廣泛應(yīng)用。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花總?cè)频某曒o助提取工藝，并考察提取所得的金銀花總?cè)茖?duì)人體常見(jiàn)致病菌的抑菌活性及抗氧化活性，旨在為金銀花總?cè)频倪M(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
金銀花產(chǎn)自河南省封丘縣，由新鄉(xiāng)博凱生物技術(shù)有限公司提供;7種常見(jiàn)致病菌（大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、化膿性鏈球菌ATCC 19615、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、肺炎鏈球菌ATCC 49619、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC 700603）均購(gòu)自南京便診生物科技有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;胰蛋白胨購(gòu)自上海寶錄生物科技有限公司;牛肉浸膏購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;D-101大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;微量MIC測(cè)定板購(gòu)自美國(guó)Corning公司;DPPH、ABTS購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;無(wú)水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均為分析純，購(gòu)自北京化工廠。
ME-204型電子天平;wi93008型麥?zhǔn)媳葷醿x;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱;SYQ-DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋;YJ-VS-2型超凈工作臺(tái);KQ-500E型超聲波清洗儀;TU-1810型紫外分光光度計(jì);XMTD-7000型恒溫水浴鍋;Bio-rad iMarkTM型酶標(biāo)儀。
1.2 方法
1.2.1 金銀花三萜提取工藝流程
金銀花打粉后過(guò)60目篩，稱定1.00 g于100 mL錐形瓶中，以一定料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，重復(fù)3次，濾液合并后濃縮定容，取適量測(cè)定總?cè)坪俊?/p>
1.2.2 三萜含量測(cè)定方法
1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法測(cè)定總?cè)坪俊７Q定標(biāo)準(zhǔn)品4.00 mg，甲醇定容至10 mL容量瓶中。準(zhǔn)確移取該溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL分別加入10 mL容量瓶中，揮盡溶劑。加入0.4 mL新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，搖勻后置于60 ℃水浴中加熱30 min。取出冷卻至室溫，加冰醋酸定容至10 mL搖勻，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以齊敦果酸含量x為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=28.175x-0.007 3，r2=0.999 2。說(shuō)明齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品在0～0.02 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
1.2.2.2 三萜含量測(cè)定
根據(jù)“1.2.2.1”項(xiàng)下回歸方程，計(jì)算提取液總?cè)坪?。提取率?jì)算公式為：
三萜提取率=三萜質(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/金銀花質(zhì)量×100%。
1.2.3 金銀花提取單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)
選定料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D）4個(gè)因素作單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平共29組試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)條件及結(jié)果見(jiàn)表2。
1.2.4 金銀花總?cè)浦苽?/p>
D-101大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)乙醇和蒸餾水預(yù)處理后，濕法裝柱，平衡后上樣（金銀花醇提物），然后用蒸餾水及30%、50%、70%、95%乙醇溶液依次洗脫，收集各項(xiàng)洗脫液，濃縮，凍干，以95%乙醇洗脫項(xiàng)制備金銀花總?cè)?，并將其配制成濃度?6 mg/mL的母液。
1.2.5 抑菌活性測(cè)定
1.2.5.1 菌株復(fù)蘇及菌懸液的制備
上述7種供試菌種復(fù)蘇后接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12～24 h。從平板上挑取單個(gè)菌落，混懸于液體培養(yǎng)基中，制成濃度為106～108 CFU/mL的菌懸液，備用。
1.2.5.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定
用微量稀釋法測(cè)定金銀花總?cè)频淖钚∫志鷿舛?。首先?.22 μm濾膜過(guò)濾“1.2.4”節(jié)藥液母液，用制備好的液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋成9個(gè)濃度后，加入微量MIC測(cè)定板中，每孔0.1 mL;再分別加入“1.2.5.1”節(jié)的各種菌液，每孔0.1 mL。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（加入0.1 mL菌液和0.1 mL液體培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照（只加液體培養(yǎng)基）。測(cè)定板于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，完全沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度即為最小抑菌濃度。將無(wú)菌生長(zhǎng)的各孔取樣，分別涂布于無(wú)菌瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，以平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最小殺菌濃度。
1.2.6 抗氧化活性測(cè)定
1.2.6.1 DPPH自由基清除率測(cè)定
參照Blois的方法[14]測(cè)定，略有變動(dòng)。取質(zhì)量濃度分別為3、6、12、24、48、96 mg/mL樣品溶液100 μL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL，充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇為空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。每一樣品平行測(cè)3次，取平均值。清除率公式表示為：
DPPH清除率=（1-D1/D2）×100%。
式中：D1為樣品或者陽(yáng)性對(duì)照吸光度;D2為空白對(duì)照吸光度。
1.2.6.2 ABTS自由基清除率測(cè)定
參照Re等的方法[15]測(cè)定。在反應(yīng)體系中，樣品溶液質(zhì)量濃度亦分別為3、6、12、24、48、96 mg/mL，體積100 μL，以甲醇為空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。每一樣品平行測(cè)3次取平均值。
上述所有試驗(yàn)于2017年7—11月在河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)試驗(yàn)室完成。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素對(duì)金銀花三萜提取率的影響
2.1.1 料液比
設(shè)定乙醇濃度60%、超聲時(shí)間50 min、溫度50 ℃，考察不同料液比（1 g ∶10 mL，1 g ∶15 mL，1 g ∶20 mL，1 g ∶25 mL，1 g ∶30 mL，1 g ∶35 mL）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-A。隨溶劑體積的增加，提取率逐漸增大，1 g ∶30 mL達(dá)到最大，之后不再增加，因此選擇較佳料液比為1 g ∶30 mL。
2.1.2 乙醇濃度
設(shè)定料液比1 g ∶30 mL、超聲時(shí)間 50 min、溫度50 ℃，考察不同乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-B。隨著乙醇濃度增加，提取率增大，80%達(dá)到最大;之后提取率不升反降，可能由于金銀花三萜極性與80%乙醇相似，選擇80%乙醇為最佳提取濃度。
2.1.3 超聲時(shí)間
設(shè)定料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度80%、溫度50 ℃，考察不同超聲時(shí)間（20、40、60、80、100 min）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-C。40 min時(shí)提取率陡然上升，此后逐漸下降，可能超聲時(shí)間延長(zhǎng)，使三萜化合物發(fā)生部分轉(zhuǎn)化，故選擇最佳提取時(shí)間為40 min。
2.1.4 超聲溫度
設(shè)定料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度80%、超聲時(shí)間40 min，考察不同超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-D。40 ℃時(shí)提取率最高，超過(guò)此溫度提取率下降，可能溫度升高會(huì)影響三萜穩(wěn)定性，故選擇40 ℃為最佳提取溫度。
2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花三萜提取工藝
2.2.1 不同因素對(duì)提取效果的影響
采用Design-Expert 8.0.6軟件得到擬合模型：
y=3.693 00+0.154 08A-0.120 08B+0.073 417C+0.121 75D-0.100 25AB+7.500 00E-004AC+0.059 750AD-0.054 000BC-0.081 500BD-0.045 000CD-0.467 75A2-0.444 00B2-0.083 500C2-0.135 50D2。
對(duì)擬合模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，回歸模型極顯著（P<0.000 1），而誤差項(xiàng)不顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況吻合較好，試驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。
決定系數(shù)R2和調(diào)整決定系數(shù)Adj R2分別為0.974 3和0.948 6，說(shuō)明該模型擬合度良好;預(yù)測(cè)決定系數(shù)Pred R2為 0.873 7，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性良好。方程中A、B、C、D、A2、B2、D2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，料液比A、乙醇濃度B、提取溫度D對(duì)提取率影響最顯著，其次為超聲時(shí)間C。AB交互作用顯著，說(shuō)明不同提取條件與金銀花總?cè)铺崛÷手g不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。
2.2.2 各因素交互作用分析
圖2是采用Design-Expert 8.0.6軟件繪出的響應(yīng)面及等高線圖。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。從響應(yīng)面等高線的分布規(guī)律和間隔距離可以看出因素間交互作用的強(qiáng)弱和因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度[16]。圖2表明料液比與乙醇濃度之間交互作用最顯著，對(duì)金銀花三萜的提取率影響最大。
2.2.3 最佳條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)
用Design-Expert 806軟件得出金銀花總?cè)铺崛∽顑?yōu)條件為：料液比 1 g ∶31.1 mL，乙醇濃度75.4%，超聲時(shí)間47.8 min，超聲溫度 45 ℃，為適應(yīng)試驗(yàn)操作調(diào)整為：料液比1 g ∶30 mL，乙醇濃度75%，超聲時(shí)間50 min，超聲溫度45 ℃。此條件下進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均提取率為3.71%，達(dá)到預(yù)測(cè)提取率（3.77%）的98.4%，說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了金銀花總?cè)频某曒o助提取工藝，且金銀花中三萜類物質(zhì)含量較高。
2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果
金銀花總?cè)埔志囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)所選7種常見(jiàn)致病菌的最小抑菌濃度（MIC）范圍在3～24 mg/mL，整體抑菌作用較強(qiáng)，尤其是對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)。
2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果
DPPH和ABTS自由基清除試驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花總?cè)葡盗腥芤簼舛确謩e為3、6、12、24、48、96 mg/mL，對(duì)應(yīng)的DPPH清除率分別為24.3%、36.8%、45.6、49.7%、53.2%、55.8%，對(duì)應(yīng)的ABTS清除率分別為27.5%、39.6%、48.3%、51.3%、
59.7%、62.8%，表明金銀花總?cè)凭哂幸欢ǖ那宄杂苫哪芰?，清除?0%即IC50所對(duì)應(yīng)濃度分別為26.1 mg/mL和18.8 mg/mL，且清除能力隨總?cè)坪吭黾佣鰪?qiáng)，呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。
3 結(jié)論與討論
中藥功能活性成分復(fù)雜，其療效多是由多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)綜合作用的結(jié)果，加之金銀花總?cè)坪?、提取工藝及抗菌、抗氧化活性至今未?jiàn)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)選擇總?cè)谱鳛榻疸y花有效成分的提取指標(biāo)。提取工藝的優(yōu)劣能直接影響生藥的利用率及后期加工的難易，提取工藝的研究是中藥生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
超聲波提取法近年來(lái)迅速發(fā)展。超聲波能增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物成分溶出速度和溶出數(shù)量，因此與常規(guī)方法比較，超聲波法提取效果好、對(duì)有效成分破壞少[17]。提取料液比、提取溫度、提取溶劑、提取時(shí)間等是影響藥物有效成分提取率的關(guān)鍵因素，要得到最佳提取工藝須要進(jìn)行大量的試驗(yàn)研究，響應(yīng)面法是優(yōu)化提取工藝時(shí)常采用的方法。
本研究應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花總?cè)频某曒o助提取工藝，確定的最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度75%、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度45 ℃，此條件下得到三萜提取率為3.71%，與其他中藥相比，金銀花中總?cè)坪枯^高，且表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌活性和一定的抗氧化活性，說(shuō)明在產(chǎn)量及活性方面金銀花三萜都具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值;加之試驗(yàn)值與理論值大致相同，說(shuō)明該工藝省時(shí)省力、科學(xué)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究為進(jìn)一步研究金銀花三萜化合物、提高金銀花資源綜合開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。
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常霞 景炳年 范毅 王偉 劉雨晴 李智寧 郭唯 魏磊
摘要：以金銀花為原料，乙醇為溶劑，考察超聲輔助提取金銀花總?cè)频淖罴压に?。在單因素（料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度）試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法，研究各因素間相互作用及對(duì)三萜提取率的影響，獲得最佳提取工藝為料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度75%、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度45 ℃，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，三萜提取率為371%，與理論值接近;通過(guò)微量稀釋法檢測(cè)常見(jiàn)致病菌對(duì)金銀花總?cè)频拿舾行?，最小抑菌濃度范圍?～24 mg/mL之間，證明金銀花三萜具有較強(qiáng)的抗菌作用;DPPH、ABTS自由基清除試驗(yàn)IC50分別為26.1、18.8 mg/mL，說(shuō)明金銀花三萜具有一定的抗氧化活性。本研究為金銀花三萜進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞：金銀花;總?cè)?響應(yīng)面;抗菌;抗氧化;提取工藝
中圖分類號(hào)：R284 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A
文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0178-05
收稿日期：2018-05-14
基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：182102310061）;河南省科學(xué)院基本科研項(xiàng)目（編號(hào)18JK16015）。
作者簡(jiǎn)介：常 霞（1963—），女，山西陵川人，高級(jí)工程師，從事中藥化學(xué)研究。Tel：（0371）65353099;
通信作者：魏 磊，博士，助理研究員，從事植物化學(xué)及分子生物學(xué)研究。Tel：（0371）65353099;
金銀花是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開(kāi)的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，多用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等病癥[1]，其藥用成分主要包括揮發(fā)油、有機(jī)酸類、黃酮和三萜類化合物。三萜類化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、降血脂、降低膽固醇、增加免疫力等多種藥理功能[2-5]，且毒性較低，因此成為中外研究的熱點(diǎn)之一[6]。目前，從金銀花中已分離出30多個(gè)三萜類化合物[7]，并有保肝和利膽的功效[8]，但針對(duì)金銀花中三萜類化合物的總量、提取工藝及抗菌抗氧化活性等方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。
提取是回收和純化生物活性物質(zhì)最初始且重要的一步，多種因素會(huì)影響提取效率和產(chǎn)量[9]，因此優(yōu)化提取工藝最大程度提取生物活性物質(zhì)十分必要。超聲波提取技術(shù)提取效率高、耗能低、不破壞活性成分[10]。同時(shí)，響應(yīng)面法可以對(duì)多種影響提取效率的因素及因素間相互作用進(jìn)行有效性分析[11]。近年來(lái)，響應(yīng)面法結(jié)合超聲輔助提取技術(shù)在優(yōu)化黃酮[12]、多糖[13]等天然活性成分的提取工藝中得到廣泛應(yīng)用。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花總?cè)频某曒o助提取工藝，并考察提取所得的金銀花總?cè)茖?duì)人體常見(jiàn)致病菌的抑菌活性及抗氧化活性，旨在為金銀花總?cè)频倪M(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
金銀花產(chǎn)自河南省封丘縣，由新鄉(xiāng)博凱生物技術(shù)有限公司提供;7種常見(jiàn)致病菌（大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、化膿性鏈球菌ATCC 19615、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、肺炎鏈球菌ATCC 49619、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC 700603）均購(gòu)自南京便診生物科技有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;胰蛋白胨購(gòu)自上海寶錄生物科技有限公司;牛肉浸膏購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;D-101大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;微量MIC測(cè)定板購(gòu)自美國(guó)Corning公司;DPPH、ABTS購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;無(wú)水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均為分析純，購(gòu)自北京化工廠。
ME-204型電子天平;wi93008型麥?zhǔn)媳葷醿x;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱;SYQ-DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋;YJ-VS-2型超凈工作臺(tái);KQ-500E型超聲波清洗儀;TU-1810型紫外分光光度計(jì);XMTD-7000型恒溫水浴鍋;Bio-rad iMarkTM型酶標(biāo)儀。
1.2 方法
1.2.1 金銀花三萜提取工藝流程
金銀花打粉后過(guò)60目篩，稱定1.00 g于100 mL錐形瓶中，以一定料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，重復(fù)3次，濾液合并后濃縮定容，取適量測(cè)定總?cè)坪俊?/p>
1.2.2 三萜含量測(cè)定方法
1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法測(cè)定總?cè)坪俊７Q定標(biāo)準(zhǔn)品4.00 mg，甲醇定容至10 mL容量瓶中。準(zhǔn)確移取該溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL分別加入10 mL容量瓶中，揮盡溶劑。加入0.4 mL新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，搖勻后置于60 ℃水浴中加熱30 min。取出冷卻至室溫，加冰醋酸定容至10 mL搖勻，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以齊敦果酸含量x為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=28.175x-0.007 3，r2=0.999 2。說(shuō)明齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品在0～0.02 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
1.2.2.2 三萜含量測(cè)定
根據(jù)“1.2.2.1”項(xiàng)下回歸方程，計(jì)算提取液總?cè)坪?。提取率?jì)算公式為：
三萜提取率=三萜質(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/金銀花質(zhì)量×100%。
1.2.3 金銀花提取單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)
選定料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D）4個(gè)因素作單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平共29組試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)條件及結(jié)果見(jiàn)表2。
1.2.4 金銀花總?cè)浦苽?/p>
D-101大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)乙醇和蒸餾水預(yù)處理后，濕法裝柱，平衡后上樣（金銀花醇提物），然后用蒸餾水及30%、50%、70%、95%乙醇溶液依次洗脫，收集各項(xiàng)洗脫液，濃縮，凍干，以95%乙醇洗脫項(xiàng)制備金銀花總?cè)?，并將其配制成濃度?6 mg/mL的母液。
1.2.5 抑菌活性測(cè)定
1.2.5.1 菌株復(fù)蘇及菌懸液的制備
上述7種供試菌種復(fù)蘇后接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12～24 h。從平板上挑取單個(gè)菌落，混懸于液體培養(yǎng)基中，制成濃度為106～108 CFU/mL的菌懸液，備用。
1.2.5.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定
用微量稀釋法測(cè)定金銀花總?cè)频淖钚∫志鷿舛?。首先?.22 μm濾膜過(guò)濾“1.2.4”節(jié)藥液母液，用制備好的液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋成9個(gè)濃度后，加入微量MIC測(cè)定板中，每孔0.1 mL;再分別加入“1.2.5.1”節(jié)的各種菌液，每孔0.1 mL。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（加入0.1 mL菌液和0.1 mL液體培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照（只加液體培養(yǎng)基）。測(cè)定板于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，完全沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度即為最小抑菌濃度。將無(wú)菌生長(zhǎng)的各孔取樣，分別涂布于無(wú)菌瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，以平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最小殺菌濃度。
1.2.6 抗氧化活性測(cè)定
1.2.6.1 DPPH自由基清除率測(cè)定
參照Blois的方法[14]測(cè)定，略有變動(dòng)。取質(zhì)量濃度分別為3、6、12、24、48、96 mg/mL樣品溶液100 μL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL，充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇為空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。每一樣品平行測(cè)3次，取平均值。清除率公式表示為：
DPPH清除率=（1-D1/D2）×100%。
式中：D1為樣品或者陽(yáng)性對(duì)照吸光度;D2為空白對(duì)照吸光度。
1.2.6.2 ABTS自由基清除率測(cè)定
參照Re等的方法[15]測(cè)定。在反應(yīng)體系中，樣品溶液質(zhì)量濃度亦分別為3、6、12、24、48、96 mg/mL，體積100 μL，以甲醇為空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。每一樣品平行測(cè)3次取平均值。
上述所有試驗(yàn)于2017年7—11月在河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)試驗(yàn)室完成。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素對(duì)金銀花三萜提取率的影響
2.1.1 料液比
設(shè)定乙醇濃度60%、超聲時(shí)間50 min、溫度50 ℃，考察不同料液比（1 g ∶10 mL，1 g ∶15 mL，1 g ∶20 mL，1 g ∶25 mL，1 g ∶30 mL，1 g ∶35 mL）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-A。隨溶劑體積的增加，提取率逐漸增大，1 g ∶30 mL達(dá)到最大，之后不再增加，因此選擇較佳料液比為1 g ∶30 mL。
2.1.2 乙醇濃度
設(shè)定料液比1 g ∶30 mL、超聲時(shí)間 50 min、溫度50 ℃，考察不同乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-B。隨著乙醇濃度增加，提取率增大，80%達(dá)到最大;之后提取率不升反降，可能由于金銀花三萜極性與80%乙醇相似，選擇80%乙醇為最佳提取濃度。
2.1.3 超聲時(shí)間
設(shè)定料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度80%、溫度50 ℃，考察不同超聲時(shí)間（20、40、60、80、100 min）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-C。40 min時(shí)提取率陡然上升，此后逐漸下降，可能超聲時(shí)間延長(zhǎng)，使三萜化合物發(fā)生部分轉(zhuǎn)化，故選擇最佳提取時(shí)間為40 min。
2.1.4 超聲溫度
設(shè)定料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度80%、超聲時(shí)間40 min，考察不同超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）對(duì)金銀花三萜提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1-D。40 ℃時(shí)提取率最高，超過(guò)此溫度提取率下降，可能溫度升高會(huì)影響三萜穩(wěn)定性，故選擇40 ℃為最佳提取溫度。
2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花三萜提取工藝
2.2.1 不同因素對(duì)提取效果的影響
采用Design-Expert 8.0.6軟件得到擬合模型：
y=3.693 00+0.154 08A-0.120 08B+0.073 417C+0.121 75D-0.100 25AB+7.500 00E-004AC+0.059 750AD-0.054 000BC-0.081 500BD-0.045 000CD-0.467 75A2-0.444 00B2-0.083 500C2-0.135 50D2。
對(duì)擬合模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，回歸模型極顯著（P<0.000 1），而誤差項(xiàng)不顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況吻合較好，試驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。
決定系數(shù)R2和調(diào)整決定系數(shù)Adj R2分別為0.974 3和0.948 6，說(shuō)明該模型擬合度良好;預(yù)測(cè)決定系數(shù)Pred R2為 0.873 7，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性良好。方程中A、B、C、D、A2、B2、D2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，料液比A、乙醇濃度B、提取溫度D對(duì)提取率影響最顯著，其次為超聲時(shí)間C。AB交互作用顯著，說(shuō)明不同提取條件與金銀花總?cè)铺崛÷手g不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。
2.2.2 各因素交互作用分析
圖2是采用Design-Expert 8.0.6軟件繪出的響應(yīng)面及等高線圖。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。從響應(yīng)面等高線的分布規(guī)律和間隔距離可以看出因素間交互作用的強(qiáng)弱和因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度[16]。圖2表明料液比與乙醇濃度之間交互作用最顯著，對(duì)金銀花三萜的提取率影響最大。
2.2.3 最佳條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)
用Design-Expert 806軟件得出金銀花總?cè)铺崛∽顑?yōu)條件為：料液比 1 g ∶31.1 mL，乙醇濃度75.4%，超聲時(shí)間47.8 min，超聲溫度 45 ℃，為適應(yīng)試驗(yàn)操作調(diào)整為：料液比1 g ∶30 mL，乙醇濃度75%，超聲時(shí)間50 min，超聲溫度45 ℃。此條件下進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均提取率為3.71%，達(dá)到預(yù)測(cè)提取率（3.77%）的98.4%，說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了金銀花總?cè)频某曒o助提取工藝，且金銀花中三萜類物質(zhì)含量較高。
2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果
金銀花總?cè)埔志囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)所選7種常見(jiàn)致病菌的最小抑菌濃度（MIC）范圍在3～24 mg/mL，整體抑菌作用較強(qiáng)，尤其是對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)。
2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果
DPPH和ABTS自由基清除試驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花總?cè)葡盗腥芤簼舛确謩e為3、6、12、24、48、96 mg/mL，對(duì)應(yīng)的DPPH清除率分別為24.3%、36.8%、45.6、49.7%、53.2%、55.8%，對(duì)應(yīng)的ABTS清除率分別為27.5%、39.6%、48.3%、51.3%、
59.7%、62.8%，表明金銀花總?cè)凭哂幸欢ǖ那宄杂苫哪芰?，清除?0%即IC50所對(duì)應(yīng)濃度分別為26.1 mg/mL和18.8 mg/mL，且清除能力隨總?cè)坪吭黾佣鰪?qiáng)，呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。
3 結(jié)論與討論
中藥功能活性成分復(fù)雜，其療效多是由多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)綜合作用的結(jié)果，加之金銀花總?cè)坪?、提取工藝及抗菌、抗氧化活性至今未?jiàn)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)選擇總?cè)谱鳛榻疸y花有效成分的提取指標(biāo)。提取工藝的優(yōu)劣能直接影響生藥的利用率及后期加工的難易，提取工藝的研究是中藥生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
超聲波提取法近年來(lái)迅速發(fā)展。超聲波能增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物成分溶出速度和溶出數(shù)量，因此與常規(guī)方法比較，超聲波法提取效果好、對(duì)有效成分破壞少[17]。提取料液比、提取溫度、提取溶劑、提取時(shí)間等是影響藥物有效成分提取率的關(guān)鍵因素，要得到最佳提取工藝須要進(jìn)行大量的試驗(yàn)研究，響應(yīng)面法是優(yōu)化提取工藝時(shí)常采用的方法。
本研究應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花總?cè)频某曒o助提取工藝，確定的最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度75%、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度45 ℃，此條件下得到三萜提取率為3.71%，與其他中藥相比，金銀花中總?cè)坪枯^高，且表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌活性和一定的抗氧化活性，說(shuō)明在產(chǎn)量及活性方面金銀花三萜都具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值;加之試驗(yàn)值與理論值大致相同，說(shuō)明該工藝省時(shí)省力、科學(xué)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究為進(jìn)一步研究金銀花三萜化合物、提高金銀花資源綜合開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。
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