Ag2O/TiO2微球?qū)ψ儺愭溓蚓锬ば纬傻挠绊?/h1>
2019-11-02 05:44黃喬木
武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào) 2019年5期
黃喬木，呂 中
武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205
齲齒是世界上最普遍的慢性傳染病之一，它是引起口腔疼痛和牙齒脫落的主要原因［1］。據(jù)報(bào)道，世界上90%以上的人口一生中至少會(huì)患一次此 病［2］。 變 異 鏈 球 菌（Streptococcus mutans，S.mutans）被認(rèn)為是主要的致齲細(xì)菌。S.mutans重要的毒力因子包括在牙齒表面形成生物膜、產(chǎn)胞外多糖（EPS）和酸［3］。生物膜中的 S.mutans被大量EPS包裹，使藥物很難接觸到細(xì)菌，使其對(duì)抗生素等藥物的耐受性比浮游態(tài)提高1000倍［4］。S.mutans可通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸造成牙齒脫礦化［5］。因此，能夠抑制浮游細(xì)菌生長(zhǎng)、生物膜形成和產(chǎn)酸的材料將是一種理想的治齲藥物。
在抗生素療法使細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生抗藥性后，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、能夠長(zhǎng)時(shí)間抗菌的無(wú)機(jī)金屬氧化物為齲齒的預(yù)防和治療提供新的策略［6］。同已被廣泛應(yīng)用于牙科臨床的ZnO一樣，近年TiO2也被嵌入玻璃離子水門汀或樹(shù)脂中用于探究對(duì)口腔細(xì)菌的抗菌效果和對(duì)牙科材料的改性［7-8］。TiO2對(duì)人體的毒性很低，但是TiO2對(duì)許多口腔細(xì)菌生物膜形成的抑制效果不好［9］。當(dāng)高濃度的TiO2嵌入牙科材料時(shí)，復(fù)合牙科材料的機(jī)械性能可能會(huì)受到影響。Ag2O對(duì)許多細(xì)菌具有良好的抗菌活性，包括S.mutans［10-12］。Ag2O通過(guò)釋放Ag+抗菌，但是過(guò)多的Ag+對(duì)人體細(xì)胞具有毒性［13］。此外，單獨(dú)的Ag2O易發(fā)生團(tuán)聚而使粒徑過(guò)大，而無(wú)機(jī)材料的抗菌活性與其尺寸有關(guān)，粒徑越小，抗菌效果越好［14］。將Ag2O負(fù)載在TiO2上，可以有效地減少Ag2O的用量和TiO2的用量，并且在TiO2的影響下，可得到均勻分布在TiO2上的小尺寸Ag2O顆粒［15］。其中Ag2O/TiO2已被證實(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌活性［16］。然而，Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的抗菌作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用沉積沉淀法合成Ag2O/TiO2微球，測(cè)定其對(duì)S.mutans的抗菌作用及對(duì)生物膜形成和產(chǎn)酸的影響，以期為在牙科臨床上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 試劑與儀器
變異鏈球菌S.mutans UA 159（武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院）；鈦酸四丁酯（TBT）（天津百世有限公司）；硝酸銀（AgNO3）（阿拉丁試劑有限公司）；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）（Oxoid有限公司）；瓊脂粉（Biofrox有限公司），厭氧產(chǎn)氣袋（三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）；2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋（青島海博生物技術(shù)有限公司）；結(jié)晶紫（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。
D8 ADVANCE型 X-射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD），（德國(guó)Bruker公司）；JEM-2100透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），（日本電子株式會(huì)社）；AGILENT 7700電感耦合等離子質(zhì)譜儀（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）（安捷倫科技股份有限公司）；722 N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 Ag2O/TiO2微球的制備和表征 Ag2O/TiO2微球參照文獻(xiàn)［15］的合成法。首先合成TiO2微球：取2mL的TBT溶液逐滴加進(jìn)60mL的CH3COOH溶液中，超聲分散15 min，將溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，150℃反應(yīng)5h后，用無(wú)水乙醇洗滌3次，70℃烘干，研磨得到TiO2微球。Ag2O/TiO2微米復(fù)合物（Ag2O與TiO2理論摩爾比為1∶10）制備過(guò)程如下：稱取0.2 g TiO2微球超聲分散在25mL去離子水中，與25mL 20 mmol/L的AgNO3溶液混合攪拌30 min混勻，逐滴加入25mL 0.5mol/L的NaOH溶液，攪拌30 min，用去離子水洗滌5次，室溫干燥研磨收集樣品。在不添加TiO2微球的情況下，用相同的方法合成Ag2O。
所制得的TiO2，Ag2O和Ag2O/TiO2采用XRD表征，掃描范圍為10～80°；利用TEM對(duì)TiO2和Ag2O/TiO2微球材料的形貌及粒徑進(jìn)行表征。Ag2O在Ag2O/TiO2中的占比通過(guò)ICP-MS確定。
1.2.2 抑菌圈測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［17］。在BHI固體培養(yǎng)基上均勻涂布108CFU/mL S.mutans菌液，貼上無(wú)菌濾紙片，分別滴加10mL 1 g/L的TiO2、Ag2O/TiO2以及10mL248mg/LAg2O的磷酸緩沖溶液（PBS）分散溶液，培養(yǎng)皿放入放有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧培養(yǎng)袋后，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h。滴加10mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）的濾紙片設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.3 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans的最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［18］。離心管中分別加入質(zhì)量濃度為 16、32、64、125、256、512和1000 mg/L的 TiO2或 16、32和 64 mg/L Ag2O/TiO2以及8、16和32 mg/L的Ag2O分散液，與5×105CFU/mL的菌液混合均勻后在37℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h。觀察每管的渾濁度，培養(yǎng)液透明的試管所對(duì)應(yīng)的最低樣品濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。僅含菌液的試管設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次。
1.2.4 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans形成生物膜的抑制作用 在24孔板中分別加入31.25、62.5和125 mg/L的Ag2O/TiO2［分散在含質(zhì)量體積比1%蔗糖的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI培養(yǎng)基）］，與2×108CFU/mL的菌液混合均勻后在37℃培養(yǎng)24h。移除上層的懸浮培養(yǎng)液，然后向形成的生物膜孔中加入1mL甲醇，固定生物膜15 min后棄去，然后加入質(zhì)量體積比0.1%結(jié)晶紫染色5 min，清洗多余染料后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）將生物膜溶解，最后用分光光度計(jì)檢測(cè)570 nm處的吸光度。僅含菌液的孔道設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.5 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans形成生物膜過(guò)程中產(chǎn)酸的檢測(cè) 參照實(shí)驗(yàn)方法1.2.4作用和培養(yǎng)S.mutans。在培養(yǎng)過(guò)程中，用pH計(jì)每隔2h測(cè)定培養(yǎng)液的pH值。僅含菌液的孔道設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.6 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans形成生物膜過(guò)程中產(chǎn)EPS的檢測(cè) 參照實(shí)驗(yàn)方法1.2.4作用和培養(yǎng)S.mutans。培養(yǎng)作用完成后，參照文獻(xiàn)［19］提取EPS：刮取形成的生物膜在4℃、12000r/m條件下離心10min。所得上清液包含可溶性EPS。沉淀重旋在1mol/L NaOH中，離心，此時(shí)的上清液包含不可溶性EPS。使用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀EPS，最后用苯酚-硫酸顯色反應(yīng)對(duì)提取的EPS進(jìn)行定量。僅含菌液的孔道設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件對(duì)Ag2O/TiO2生物膜形成的結(jié)晶紫定量、EPS的產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，選擇Tukey進(jìn)行事后檢驗(yàn)分析。所有試驗(yàn)的顯著性水平為0.05。
2 結(jié)果與討論
2.1 Ag2O/TiO2微球的表征
圖1是所合成TiO2、Ag2O及Ag2O/TiO2樣品的XRD圖。其中TiO2樣品的衍射峰與銳鈦礦型TiO2的標(biāo)準(zhǔn)卡片圖譜（JCPDS 4-477）相一致。合成的Ag2O樣品的衍射峰也與Ag2O標(biāo)準(zhǔn)卡片圖譜（JCPDS 1-1041）的衍射峰相一致，說(shuō)明成功合成了純凈的Ag2O。Ag2O/TiO2的衍射峰除了能觀察到TiO2的衍射峰之外，還能觀察到與Ag2O標(biāo)準(zhǔn)卡片圖譜（JCPDS 1-1041）相一致的衍射峰，衍射峰沒(méi)有雜峰，且衍射峰均有較高強(qiáng)度，說(shuō)明合成的樣品為結(jié)晶度較高的Ag2O/TiO2。
圖1 TiO2，Ag2O和Ag2O/TiO2的XRD圖Fig.1 XRD patterns of TiO2，Ag2O and Ag2O/TiO2
圖2分別是樣品TiO2及Ag2O/TiO2的TEM圖。由圖2（a）可知，純的TiO2是由一維納米棒組成的直徑為2～3 mm的微球。從圖2（d）中可以看到，在Ag2O/TiO2中，TiO2表面變得粗糙，粒徑為 5～10 nm的Ag2O納米顆粒沿著微球上的納米棒均勻負(fù)載。由ICP-MS數(shù)據(jù)可知，Ag2O在Ag2O/TiO2中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.80%。
圖 2 TEM 圖：（a）TiO2，（c）Ag2O/TiO2，（b）和（d）分別為（a）和（c）中矩形的放大圖片F(xiàn)ig.2 TEM images：（a）TiO2，（c）Ag2O/TiO2，（b）and（d）are magnified images of rectangles in（a）and（c）respectively
2.2 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的抗菌活性
圖3（a）顯示，TiO2和空白組的濾紙片周圍沒(méi)有看到抑菌圈，而Ag2O/TiO2和與Ag2O/TiO2相當(dāng)量的Ag2O的濾紙片周圍有明顯的抑菌圈，說(shuō)明Ag2O和Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans有抑菌效果，而TiO2對(duì)S.mutans沒(méi)有明顯抑菌效果。其中Ag2O/TiO2的抑菌圈大于Ag2O的抑菌圈，說(shuō)明Ag2O/TiO2的抑菌效果強(qiáng)于Ag2O。由圖3（b）可見(jiàn)，TiO2作用的每根離心管培養(yǎng)液渾濁度基本與空白組一致，說(shuō)明TiO2在質(zhì)量濃度為1000 mg/L及以下時(shí)對(duì)S.mutans沒(méi)有明顯抑菌活性；Ag2O/TiO2作用的離心管培養(yǎng)液在質(zhì)量濃度為64 mg/L時(shí)，試管中培養(yǎng)液呈澄清狀態(tài)，說(shuō)明 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的MIC為 64 mg/L。Ag2O對(duì)S.mutans的MIC為32 mg/L。根據(jù)ICP-MS結(jié)果可計(jì)算，64 mg/L Ag2O/TiO2中的Ag2O質(zhì)量濃度為15.87 mg/L，而Ag2O的MIC大于這個(gè)濃度，說(shuō)明Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的抗菌作用強(qiáng)于相同濃度下的Ag2O。
圖3 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans的抗菌活性：（a）抑菌圈，（b）MIC圖Fig.3 Antibacterial activity of Ag2O/TiO2against planktonic S.mutans：（a）inhibition zone，（b）MIC images
2.3 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成的抑制
圖4顯示，隨著Ag2O/TiO2濃度的升高，生物膜形成量越少。當(dāng)Ag2O/TiO2質(zhì)量濃度為125 mg/L時(shí)，相比于空白組，生物膜形成量下降61.8%，結(jié)果表明Ag2O/TiO2能顯著抑制S.mutans生物膜的形成。
圖4 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成的抑制Fig.4 Inhibition of Ag2O/TiO2on biofilm formation of S.mutans
2.4 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成過(guò)程產(chǎn)酸的抑制
圖5顯示，S.mutans在不受藥物作用情況下，培養(yǎng)8h后培養(yǎng)液的pH值會(huì)降到4.5；而在Ag2O/TiO2的作用下，培養(yǎng)液中的pH值幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明Ag2O/TiO2能夠顯著抑制細(xì)菌在生物膜形成過(guò)程中的產(chǎn)酸。
圖5 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans產(chǎn)酸影響Fig.5 Effects of Ag2O/TiO2on acid production of S.mutans
2.5 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成過(guò)程產(chǎn)EPS的抑制
圖6顯示，在Ag2O/TiO2作用下，水可溶性和水不可溶性EPS的產(chǎn)量都顯著下降。當(dāng)Ag2O/TiO2質(zhì)量濃度為125 mg/L時(shí)，水可溶性和水不可溶性EPS產(chǎn)量相比于空白組分別下降了56.14%和69.95%，結(jié)果表明Ag2O/TiO2能顯著地抑制細(xì)菌EPS的產(chǎn)生。
圖6 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成過(guò)程產(chǎn)EPS影響Fig.6 Effects of Ag2O/TiO2on production of EPS during the biofilm formation of S.mutans
3 結(jié) 語(yǔ)
通過(guò)沉積沉淀法合成的Ag2O/TiO2微球?qū)谇恢慢x細(xì)菌S.mutans有顯著的抗菌活性，并能夠抑制其生物膜的形成及該過(guò)程中的產(chǎn)酸和EPS。由于Ag2O/TiO2具有較好穩(wěn)定性，未來(lái)可將Ag2O/TiO2摻雜進(jìn)牙科材料中探索其在牙科臨床實(shí)際應(yīng)用可行性。
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1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 Ag2O/TiO2微球的制備和表征 Ag2O/TiO2微球參照文獻(xiàn)［15］的合成法。首先合成TiO2微球：取2mL的TBT溶液逐滴加進(jìn)60mL的CH3COOH溶液中，超聲分散15 min，將溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，150℃反應(yīng)5h后，用無(wú)水乙醇洗滌3次，70℃烘干，研磨得到TiO2微球。Ag2O/TiO2微米復(fù)合物（Ag2O與TiO2理論摩爾比為1∶10）制備過(guò)程如下：稱取0.2 g TiO2微球超聲分散在25mL去離子水中，與25mL 20 mmol/L的AgNO3溶液混合攪拌30 min混勻，逐滴加入25mL 0.5mol/L的NaOH溶液，攪拌30 min，用去離子水洗滌5次，室溫干燥研磨收集樣品。在不添加TiO2微球的情況下，用相同的方法合成Ag2O。
所制得的TiO2，Ag2O和Ag2O/TiO2采用XRD表征，掃描范圍為10～80°；利用TEM對(duì)TiO2和Ag2O/TiO2微球材料的形貌及粒徑進(jìn)行表征。Ag2O在Ag2O/TiO2中的占比通過(guò)ICP-MS確定。
1.2.2 抑菌圈測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［17］。在BHI固體培養(yǎng)基上均勻涂布108CFU/mL S.mutans菌液，貼上無(wú)菌濾紙片，分別滴加10mL 1 g/L的TiO2、Ag2O/TiO2以及10mL248mg/LAg2O的磷酸緩沖溶液（PBS）分散溶液，培養(yǎng)皿放入放有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧培養(yǎng)袋后，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h。滴加10mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）的濾紙片設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.3 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans的最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［18］。離心管中分別加入質(zhì)量濃度為 16、32、64、125、256、512和1000 mg/L的 TiO2或 16、32和 64 mg/L Ag2O/TiO2以及8、16和32 mg/L的Ag2O分散液，與5×105CFU/mL的菌液混合均勻后在37℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h。觀察每管的渾濁度，培養(yǎng)液透明的試管所對(duì)應(yīng)的最低樣品濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。僅含菌液的試管設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次。
1.2.4 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans形成生物膜的抑制作用 在24孔板中分別加入31.25、62.5和125 mg/L的Ag2O/TiO2［分散在含質(zhì)量體積比1%蔗糖的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI培養(yǎng)基）］，與2×108CFU/mL的菌液混合均勻后在37℃培養(yǎng)24h。移除上層的懸浮培養(yǎng)液，然后向形成的生物膜孔中加入1mL甲醇，固定生物膜15 min后棄去，然后加入質(zhì)量體積比0.1%結(jié)晶紫染色5 min，清洗多余染料后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）將生物膜溶解，最后用分光光度計(jì)檢測(cè)570 nm處的吸光度。僅含菌液的孔道設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.5 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans形成生物膜過(guò)程中產(chǎn)酸的檢測(cè) 參照實(shí)驗(yàn)方法1.2.4作用和培養(yǎng)S.mutans。在培養(yǎng)過(guò)程中，用pH計(jì)每隔2h測(cè)定培養(yǎng)液的pH值。僅含菌液的孔道設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.6 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans形成生物膜過(guò)程中產(chǎn)EPS的檢測(cè) 參照實(shí)驗(yàn)方法1.2.4作用和培養(yǎng)S.mutans。培養(yǎng)作用完成后，參照文獻(xiàn)［19］提取EPS：刮取形成的生物膜在4℃、12000r/m條件下離心10min。所得上清液包含可溶性EPS。沉淀重旋在1mol/L NaOH中，離心，此時(shí)的上清液包含不可溶性EPS。使用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀EPS，最后用苯酚-硫酸顯色反應(yīng)對(duì)提取的EPS進(jìn)行定量。僅含菌液的孔道設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件對(duì)Ag2O/TiO2生物膜形成的結(jié)晶紫定量、EPS的產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，選擇Tukey進(jìn)行事后檢驗(yàn)分析。所有試驗(yàn)的顯著性水平為0.05。
2 結(jié)果與討論
2.1 Ag2O/TiO2微球的表征
圖1是所合成TiO2、Ag2O及Ag2O/TiO2樣品的XRD圖。其中TiO2樣品的衍射峰與銳鈦礦型TiO2的標(biāo)準(zhǔn)卡片圖譜（JCPDS 4-477）相一致。合成的Ag2O樣品的衍射峰也與Ag2O標(biāo)準(zhǔn)卡片圖譜（JCPDS 1-1041）的衍射峰相一致，說(shuō)明成功合成了純凈的Ag2O。Ag2O/TiO2的衍射峰除了能觀察到TiO2的衍射峰之外，還能觀察到與Ag2O標(biāo)準(zhǔn)卡片圖譜（JCPDS 1-1041）相一致的衍射峰，衍射峰沒(méi)有雜峰，且衍射峰均有較高強(qiáng)度，說(shuō)明合成的樣品為結(jié)晶度較高的Ag2O/TiO2。
圖1 TiO2，Ag2O和Ag2O/TiO2的XRD圖Fig.1 XRD patterns of TiO2，Ag2O and Ag2O/TiO2
圖2分別是樣品TiO2及Ag2O/TiO2的TEM圖。由圖2（a）可知，純的TiO2是由一維納米棒組成的直徑為2～3 mm的微球。從圖2（d）中可以看到，在Ag2O/TiO2中，TiO2表面變得粗糙，粒徑為 5～10 nm的Ag2O納米顆粒沿著微球上的納米棒均勻負(fù)載。由ICP-MS數(shù)據(jù)可知，Ag2O在Ag2O/TiO2中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.80%。
圖 2 TEM 圖：（a）TiO2，（c）Ag2O/TiO2，（b）和（d）分別為（a）和（c）中矩形的放大圖片F(xiàn)ig.2 TEM images：（a）TiO2，（c）Ag2O/TiO2，（b）and（d）are magnified images of rectangles in（a）and（c）respectively
2.2 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的抗菌活性
圖3（a）顯示，TiO2和空白組的濾紙片周圍沒(méi)有看到抑菌圈，而Ag2O/TiO2和與Ag2O/TiO2相當(dāng)量的Ag2O的濾紙片周圍有明顯的抑菌圈，說(shuō)明Ag2O和Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans有抑菌效果，而TiO2對(duì)S.mutans沒(méi)有明顯抑菌效果。其中Ag2O/TiO2的抑菌圈大于Ag2O的抑菌圈，說(shuō)明Ag2O/TiO2的抑菌效果強(qiáng)于Ag2O。由圖3（b）可見(jiàn)，TiO2作用的每根離心管培養(yǎng)液渾濁度基本與空白組一致，說(shuō)明TiO2在質(zhì)量濃度為1000 mg/L及以下時(shí)對(duì)S.mutans沒(méi)有明顯抑菌活性；Ag2O/TiO2作用的離心管培養(yǎng)液在質(zhì)量濃度為64 mg/L時(shí)，試管中培養(yǎng)液呈澄清狀態(tài)，說(shuō)明 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的MIC為 64 mg/L。Ag2O對(duì)S.mutans的MIC為32 mg/L。根據(jù)ICP-MS結(jié)果可計(jì)算，64 mg/L Ag2O/TiO2中的Ag2O質(zhì)量濃度為15.87 mg/L，而Ag2O的MIC大于這個(gè)濃度，說(shuō)明Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的抗菌作用強(qiáng)于相同濃度下的Ag2O。
圖3 Ag2O/TiO2對(duì)浮游狀S.mutans的抗菌活性：（a）抑菌圈，（b）MIC圖Fig.3 Antibacterial activity of Ag2O/TiO2against planktonic S.mutans：（a）inhibition zone，（b）MIC images
2.3 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成的抑制
圖4顯示，隨著Ag2O/TiO2濃度的升高，生物膜形成量越少。當(dāng)Ag2O/TiO2質(zhì)量濃度為125 mg/L時(shí)，相比于空白組，生物膜形成量下降61.8%，結(jié)果表明Ag2O/TiO2能顯著抑制S.mutans生物膜的形成。
圖4 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成的抑制Fig.4 Inhibition of Ag2O/TiO2on biofilm formation of S.mutans
2.4 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成過(guò)程產(chǎn)酸的抑制
圖5顯示，S.mutans在不受藥物作用情況下，培養(yǎng)8h后培養(yǎng)液的pH值會(huì)降到4.5；而在Ag2O/TiO2的作用下，培養(yǎng)液中的pH值幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明Ag2O/TiO2能夠顯著抑制細(xì)菌在生物膜形成過(guò)程中的產(chǎn)酸。
圖5 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans產(chǎn)酸影響Fig.5 Effects of Ag2O/TiO2on acid production of S.mutans
2.5 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成過(guò)程產(chǎn)EPS的抑制
圖6顯示，在Ag2O/TiO2作用下，水可溶性和水不可溶性EPS的產(chǎn)量都顯著下降。當(dāng)Ag2O/TiO2質(zhì)量濃度為125 mg/L時(shí)，水可溶性和水不可溶性EPS產(chǎn)量相比于空白組分別下降了56.14%和69.95%，結(jié)果表明Ag2O/TiO2能顯著地抑制細(xì)菌EPS的產(chǎn)生。
圖6 Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans生物膜形成過(guò)程產(chǎn)EPS影響Fig.6 Effects of Ag2O/TiO2on production of EPS during the biofilm formation of S.mutans
3 結(jié) 語(yǔ)
通過(guò)沉積沉淀法合成的Ag2O/TiO2微球?qū)谇恢慢x細(xì)菌S.mutans有顯著的抗菌活性，并能夠抑制其生物膜的形成及該過(guò)程中的產(chǎn)酸和EPS。由于Ag2O/TiO2具有較好穩(wěn)定性，未來(lái)可將Ag2O/TiO2摻雜進(jìn)牙科材料中探索其在牙科臨床實(shí)際應(yīng)用可行性。
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