王似錦 余萌 胡昌勤 馬仕洪

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)最早于1947年由康奈爾大學(xué)教授Burkholder分離，分離之初被命名為洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)，由于分子生物學(xué)鑒定技術(shù)的發(fā)展，1992年，該菌被重新分類命名，隸屬于伯克霍爾德菌屬[1]。目前該菌屬共有122個(gè)種，通過(guò)16S rDNA序列分析，將親緣關(guān)系相近的20余個(gè)種劃分為一，命名為洋蔥伯克霍爾德菌群復(fù)合體(Burkholderia cepaciacomplex,BCC)，其中包括基因型Ⅰ(genomovar Ⅰ，代表種為Burkholderia cepacia)、基因型Ⅱ(genomovarⅡ，代表種為Burkholderia multivorans)、基因型Ⅲ(genomovar Ⅲ，代表種為Burkholderia cenocepacia)、基因型Ⅳ(genomovarⅣ，代表種為Burkholderia stabilis)、基因型Ⅴ(genomovar Ⅴ，代表種為Burkholderia vietnamiensis)等，其中洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)是自然界中分離獲得的該菌群最常見的菌株之一[2]。

洋蔥伯克霍爾德菌在1981年因污染吸入劑導(dǎo)致數(shù)名囊性纖維化(CF)患者死亡引起美國(guó)食品藥品管理局(FDA)的注意，目前該菌已經(jīng)被FDA明確為不可接受微生物(objectionable microorganism)。近些年來(lái)，屢有因?yàn)榘ㄋ幤泛托l(wèi)生用品在內(nèi)的健康產(chǎn)品污染該菌而召回的案例，F(xiàn)DA也因?yàn)樵摼囊伤莆廴?，若干次發(fā)布警告信息[2-4]。

本研究收集菌種保藏中心以及樣品分離的伯克霍爾德菌科，其中包括BCC類群，非BCC的其他伯克霍爾德菌屬菌株，也包括已經(jīng)在2015年被重新分類為類伯克霍爾德菌屬菌株，采用4種方法進(jìn)行鑒定，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了比較分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

二級(jí)生物安全柜(美國(guó)Thermo)，KD-240恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDER)，顯微鏡(美國(guó)Olympus)，Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)(美國(guó)BIOLOG)、Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)(美國(guó)DuPont)、PCR儀(美國(guó)BIORAD)。

1.2 試劑

Riboprinter細(xì)菌鑒定套裝(美國(guó)DuPont)、BiologGENⅢ細(xì)菌鑒定板(美國(guó)Biolog)，API 20NE試劑條(法國(guó)Bio-Merieux)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根)。

1.3 菌種

來(lái)自菌種保藏中心的標(biāo)株11株，其中非BCC包括：熱帶伯克霍爾德菌(Burkholderia tropica,CICC10405)、烏拉姆伯克霍爾德菌(Burkolderia unamae,CICC10406)、含羞草結(jié)瘤伯克霍爾德菌(Burkholderia nodosa,CICC10407)、抗金屬伯克霍爾德菌(Burkholderia matelliresistens,CICC10561)、唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderia glaioli,CICC10574)；BCC包括污染伯克霍爾德菌(Burkholderia contaminants,CICC23882)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia,CICC10857)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia,CICC20700)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia,CICC21926)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia,CMCC(B)23001)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkhlderia cepaia，CMCC23002)。樣品分離菌3株：20170801、20180108和YY-1。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)和R2A瓊脂培養(yǎng)基(R2A)按照中國(guó)藥典2015年版四部通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限查：微生物計(jì)數(shù)[5]要求進(jìn)行配制和滅菌。1/10胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(1/10TSA)和1/10胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(1/10TSB)，根據(jù)中國(guó)藥典2015年版[5]的要求和配方，將除了瓊脂和水之外的各組分調(diào)整為原來(lái)的10，瓊脂和水的量不變，進(jìn)行配制和滅菌。

2 方法

2.1 微生物的分離與活化

將菌種保藏中心所得菌種或樣品分離菌接種至TSB和1/10TSB培養(yǎng)基中，置于33℃培養(yǎng)24～48h，根據(jù)生長(zhǎng)情況，分別選取TSB和1/10TSB培養(yǎng)液劃線于TSA、1/10TSA和R2A平板上，置于33℃培養(yǎng)24～48h，根據(jù)生長(zhǎng)情況選取TSA或1/10TSA平板進(jìn)一步進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。

2.2 鑒定試驗(yàn)

將分離的微生物進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。按照儀器使用操作規(guī)程，采用Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)和Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)(使用Biolog GENⅢ細(xì)菌鑒定對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定。按照試劑條使用說(shuō)明采用API 20NE試劑條對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，并提交數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。采用試劑盒提取細(xì)菌基因組，并進(jìn)行16S rDNA和recA基因序列測(cè)定[6]，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析。16S rDNA序列引物為27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1492r:TACGGCTACCTTGTTACGACTT；recA序列引物為BCR1:TGACCGCCGAGAAGAGCAA,BCR2:CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC。

3 結(jié)果與討論

3.1 14株菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

有文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，部分伯克霍爾德菌屬的菌更適宜在寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，本試驗(yàn)給出了同樣的結(jié)果。從結(jié)果(表1)可以看出，4株菌CICC10405、CICC10406、CICC10407和CICC10561在TSB和TSA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，而在1/10TSB、1/10TSA和R2A培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。其余菌株在5種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)都較為良好，但總體而言，在1/10TSA和R2A培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落要大于TSA培養(yǎng)基。

3.2 API20NE鑒定結(jié)果

Api20NE適用于非腸道革蘭陰性菌，其數(shù)據(jù)庫(kù)中伯克霍爾德菌屬的菌只包括3個(gè)種：B.cepacia、B.gladioli和B.pseudomallei。所以，大部分的標(biāo)準(zhǔn)菌株均鑒定為B.cepacia，另外有2株為無(wú)可接受結(jié)果。從結(jié)果分析可知，Api20NE試劑條只能將伯克霍爾德菌鑒定到屬水平。

3.3 Biolog微生物全自動(dòng)鑒定分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果

Biolog鑒定系統(tǒng)主要是利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致的顏色變化(吸光度)以及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異，還包括細(xì)菌對(duì)部分化學(xué)物質(zhì)(乳酸、NaCl、抗生素和不同的pH值)的耐受性，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫(kù)比較，即可得出鑒定結(jié)果。

CICC10574和CICC23882能夠準(zhǔn)確鑒定到種；幾株洋蔥伯克霍爾德菌(CICC10857、CICC20700、CICC21926、CMCC(B)23001)均鑒定為Burkholderia pyrrocinia/cepacia，無(wú)法確定種，但基本可以確定屬于BCC；另外有4株非BCC菌給出了不準(zhǔn)確的結(jié)果。3株未知菌的鑒定在屬水平上正確，且給出的結(jié)果也都屬于BCC。

3.4 Riboprinter基因指紋圖譜鑒定系統(tǒng)

該鑒定系統(tǒng)是利用核糖體DNA在不同菌株中的拷貝數(shù)存在差異。限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行酶切，菌株之間的酶切片段長(zhǎng)度、數(shù)量存在差異，經(jīng)特異性探針標(biāo)記，形成菌株專一的指紋圖譜，通過(guò)圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖譜比對(duì)，得到鑒定結(jié)果。當(dāng)相似度值S高于0.85時(shí)，結(jié)果可信，當(dāng)相似度值S低于于0.85時(shí)，結(jié)果不可信。

鑒定結(jié)果見表2和圖1。從結(jié)果可以看出，Riboprinter能夠準(zhǔn)確鑒定到種的有3株，且通過(guò)圖譜比較可知，其中CICC10857和CICC20700的同源性較高，這與菌種保藏中心給出的溯源信息(這2株菌等同于某一株菌)是一致的。其他幾株菌的相似度S均比較低(都低于0.85，甚至只有0.5～0.6)，結(jié)果均不可信，但有幾株給出了正確的屬的信息。20170801-1、20170801-2、20170801-3和20170801-8 4株菌均分離來(lái)自同批樣品的不同支，雖然鑒定的S值偏低(均低于0.83)，但通過(guò)比較條帶可知，這4株菌的同源性較高(與20170801-1相比，其他3株菌的相似度達(dá)到了0.95以上)。

表1 14株菌在5種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Tab.1 Growth conditions of 14 strains in 5 culture mediums

表2 14株伯克霍爾德菌的鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of 14 Burkholderia

3.5 16S rDNA和recA序列分析

從16S rDNA序列分析的鑒定結(jié)果看，幾株洋蔥伯克霍爾德菌(B.cepacia)的標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定無(wú)法確定到種，只給出了Burkholderia territorii/cepacia的結(jié)果，B.cepacia(CICC21926)鑒定為了Burkholderia contaminans。不屬于BCC的幾株標(biāo)準(zhǔn)菌株均能夠正確的鑒定到種水平。其中，CICC10405、CICC10406、CICC10407和CICC10561 4株菌原屬于伯克霍爾德菌屬，2015年有微生物學(xué)家在分析了部分菌的基因特征之后將部分伯克霍爾德菌屬的菌劃分為新的屬，其屬名由Burkholderia更改為Paraburkholderia，即類伯克霍爾德菌屬，其種名未變[10]。

從recA序列分析結(jié)果可知，幾株洋蔥伯克霍爾德菌(B.cepacia)的標(biāo)準(zhǔn)菌株和2株非BCC的標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC10574和CICC23882)能夠準(zhǔn)確鑒定到種。4株非BCC的菌未能擴(kuò)增到目標(biāo)長(zhǎng)度的基因片段，推測(cè)由于本實(shí)驗(yàn)所用recA引物是根據(jù)BCC的recA基因設(shè)計(jì)，對(duì)其他種屬特異性不強(qiáng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

3株未知菌的鑒定，16S rDNA序列無(wú)法給出準(zhǔn)確的種的結(jié)果，但給出的鑒定結(jié)果均屬于BCC；recA序列分析給出了種的結(jié)果：20170801鑒定為B.cepacia，20180108鑒定為B.cenocepacia，YY-1鑒定為B.stabilis。

有文獻(xiàn)報(bào)道表明，BCC類群中種間的16S rDNA序列相似度極高(98%～100%)，這使被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌分類學(xué)研究和鑒定的16S rDNA序列分析在對(duì)BCC進(jìn)行種水平上的區(qū)分時(shí)能力有限[11]，很多時(shí)候不能鑒定到種水平。對(duì)于BCC種間的區(qū)分可借助看家基因recA的序列分析來(lái)進(jìn)行[6]。recA基因編碼蛋白參與集體DNA重組修復(fù)，在細(xì)菌基因組中普遍存在，高度保守，其序列分析多應(yīng)用于遺傳關(guān)系相近的物種[12-13]。

4 結(jié)論

BCC常分離于制藥行業(yè)和醫(yī)院的水系統(tǒng)和液體醫(yī)療產(chǎn)品中，為條件致病菌，對(duì)于免疫力低下的人群有較大的危害性[3,9,14-16]，因此被美國(guó)FDA認(rèn)為是典型的不可接受微生物[3]，應(yīng)引起制藥行業(yè)的關(guān)注。本研究分別用生理生化(API20NE和Biolog碳源分析系統(tǒng))、分子生物學(xué)技術(shù)(核糖體分型、16S rDNA和recA序列分析)的方法對(duì)11株標(biāo)準(zhǔn)菌株和3株未知菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明：生理生化的方法能夠鑒定到屬的水平，Biolog能夠區(qū)分BCC與非BCC類群微生物；16S rDNA序列分析能夠鑒定到屬水平，對(duì)于非BCC的部分菌可以鑒定到種水平，并且能夠?qū)CC正確分類；recA序列分析能夠?qū)珺CC的部分菌正確鑒定到種水平；Riboprinter技術(shù)能夠鑒定到屬水平，但是該技術(shù)能夠?qū)M(jìn)行同源性比較和溯源分析。在進(jìn)行該菌的鑒定時(shí)，可以參考中國(guó)藥典2015年版四部9204微生物鑒定技術(shù)指導(dǎo)原則的要求，根據(jù)自身的需求、技術(shù)能力以及能夠承擔(dān)的成本，選擇適宜的鑒定方法和技術(shù)，依據(jù)多相鑒定原則進(jìn)行鑒定分析，第一步判斷是否屬于伯克霍爾德菌屬；第二步判斷是否屬于BCC；第三步盡可能準(zhǔn)確鑒定到種水平，有必要的情況下進(jìn)行溯源分析以確認(rèn)污染來(lái)源。

圖1 17株伯克霍爾德菌的Riboprinter鑒定結(jié)果Fig.1 Results ofidentification and strain typing of 14 Burkholderia by Riboprinter