李 瑩 葉永安 李志國(guó) 張露丹 楊先照

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 (北京， 100700) 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所

肝癌是一種高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤，數(shù)據(jù)顯示，2014年我國(guó)肝癌新發(fā)病例約36.5萬(wàn)例，死亡病例約31.9萬(wàn)例[1]。盡管乙肝疫苗免疫接種及早期篩查等相關(guān)一、二級(jí)預(yù)防在我國(guó)已初見(jiàn)成效，但人口增長(zhǎng)和老齡化加劇導(dǎo)致肝癌新發(fā)及死亡病例數(shù)量大幅增加。肝癌帶來(lái)的疾病負(fù)擔(dān)已成為危害我國(guó)人群健康的重要因素之一。此外，由于肝癌具有癥狀出現(xiàn)較晚、病情進(jìn)展迅速、手術(shù)復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，使得肝癌的有效治療成為亟待解決的難題。這些都迫切要求肝癌的臨床治療及相關(guān)基礎(chǔ)研究戰(zhàn)略前移，因此，開(kāi)展肝癌前病變的研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

肝癌前病變，是一種具有細(xì)胞不典型性和分化異常的增生性病變，是良性病變向惡性病變過(guò)渡的移行階段，有高度惡變風(fēng)險(xiǎn)[2, 3]，如能阻斷其病理進(jìn)程，則可有效預(yù)防肝癌發(fā)生?？估w抑癌方是葉永安教授多年來(lái)防治肝癌前病變的臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期研究已證實(shí)該方可通過(guò)調(diào)控整合素α5β1信號(hào)通路改善大鼠肝臟纖維堆積及肝細(xì)胞異常增生[4, 5]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K /Akt) 信號(hào)通路是整合素α5β1下游重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在肝纖維化、肝硬化及肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，但在肝癌前病變的研究中未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察了抗纖抑癌方對(duì)肝癌前病變大鼠PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，探討其治療肝癌前病變的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性10周齡Wistar大鼠85只，體重(180±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào):SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)、飼養(yǎng)方案報(bào)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.1.2 藥品 抗纖抑癌方顆粒劑，由柴胡、黃芪、山藥、白芥子等藥物組成[培力(南寧)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)]；復(fù)方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Z19991011)；二乙基亞硝胺(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：N0756)。

1.1.3 試劑與儀器 Anti-GSTP1(bs-2735R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PI3K p85抗體(#4292，美國(guó)CST公司)，Phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) 抗體(#4228，美國(guó)CST公司)，Akt抗體(#9272，美國(guó)CST公司)，Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP Rabbit mAb(#4060，美國(guó)CST公司)，GAPDH(ab9485，英國(guó)Abcam公司)；兔SP試劑盒(SP-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(DA1010，北京索萊寶科技有限公司)，Trizol試劑盒(15596026，美國(guó)Invitrogen公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M1701，美國(guó)Promega公司)，Real-timePCR擴(kuò)增試劑盒(北京中原領(lǐng)先科技有限公司)，Agarose(V2111，美國(guó)Promega公司)，DEPC(D5758，美國(guó)Sigma公司)，Real-Time PCR儀(7500，美國(guó)ABI公司)，4℃低溫高速離心機(jī)(SORVALL Stratos，美國(guó)Thermo公司)，核酸蛋白測(cè)定儀(BioPhotometer，德國(guó)Eppendorf公司)，蛋白電泳槽(1658001，美國(guó)Bio-Rad公司)，半干轉(zhuǎn)印槽(1703940，美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照Excel隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組10只，模型組、抗纖抑癌低、中、高劑量組及鱉甲軟肝組每組各15只。正常組大鼠按0.4ml/l00g劑量給予生理鹽水腹腔注射，其余各組大鼠按50mg/kg劑量予二乙基亞硝胺腹腔注射制備肝癌前病變模型，每周1次，共14周。

1.2.2 給藥 第9周起，正常組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃，抗纖抑癌低、中、高劑量組分別予臨床劑量4、7、14倍的抗纖抑癌方灌胃，鱉甲軟肝組予臨床劑量7倍的復(fù)方鱉甲軟肝片灌胃，每次用藥體積均為1ml/l00g，每天1次，連續(xù)給藥6周。

1.2.3 取材 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)第14周末取材。在末次給藥24h后，配置10%水合氯醛溶液按照0.33ml/100g腹腔注射麻醉，開(kāi)腹，于肝臟最大葉、距邊緣約1cm的部位切取肝組織置于4%多聚甲醛中固定，另取肝組織快速置于液氮中以備Western blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.4.1 免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織中胎盤(pán)型谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST-Pi)的表達(dá) 取出固定好的標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)流程石蠟包埋，制成切片；脫蠟至水，PBS沖洗3min×3次；置抗原修復(fù)液中煮沸15min，PBS沖洗5min×2次；滴加3%過(guò)氧化氫一滴，室溫孵育10min，PBS沖洗3min；加山羊血清封閉液一滴，放入濕盒內(nèi)，室溫10min；甩掉封閉液，滴加一抗(稀釋度1：150)蓋住組織，放入濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜；加二抗50μl，室溫孵育10min，PBS沖洗3min×3次；滴加一滴鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育10min，PBS沖洗3min×3次；DAB顯色，顯微鏡下控制染色；蘇木素復(fù)染，1～2min，細(xì)胞核變藍(lán)色即可終止，自來(lái)水沖洗反藍(lán)；常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞分布，陽(yáng)性信號(hào)為胞漿被染成棕黃色，每組隨機(jī)選取6張切片，每張切片取5個(gè)視野拍照，運(yùn)用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測(cè)量平均光密度(MOD)，取5個(gè)視野平均值代表每張切片的MOD值。

1.2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠肝臟組織中PI3K、Akt mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑提取總RNA，核酸紫外分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)稀釋的RNA提取物的OD值和濃度，判斷RNA純度，計(jì)算RNA濃度；用二步法進(jìn)行mRNA表達(dá)的檢測(cè)；按反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，取5μl總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和引物oligo(dT)15條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA鏈；以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μl，含2μlcDNA，10pmol/μl上下游引物各0.5μl，SYBRmix10μl，不足的體積以無(wú)RNA酶的水補(bǔ)齊；以GAPDH作為內(nèi)參照，循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94℃×10min，變性94℃×15s，退火60℃×60s，延伸72℃×10min，共45個(gè)循環(huán)。所得Ct值按照2-△△Ct法均一化處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.4.3 Western blot法檢測(cè)大鼠肝臟組織中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白的表達(dá) 將肝臟組織加蛋白裂解液進(jìn)行勻漿裂解，按蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，Bradford法定量；把蛋白樣品分裝到離心管中，并加入上樣緩沖液，沸水煮5min，4℃放置；制備12%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，各取5μl蛋白樣品進(jìn)行上樣，電泳4～5h，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉，分別加入一抗(稀釋度1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST沖洗5～10min，反復(fù)3次，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋度1∶5000)，室溫孵育60min，洗去未結(jié)合的二抗，滴加化學(xué)發(fā)光劑ECL進(jìn)行發(fā)光顯影?；叶葤呙韬笥肐mageJ軟件分析條帶的灰度值，結(jié)果以各目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織中GST-Pi的表達(dá)情況 GST-Pi陽(yáng)性灶表現(xiàn)為圓形或不規(guī)則形棕黃色團(tuán)塊，主要分布在細(xì)胞胞漿中。正常組(A)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)，模型組(B)可見(jiàn)多處位于匯管區(qū)周?chē)案涡∪~內(nèi)的陽(yáng)性灶，且染色較深；與模型組相比，抗纖抑癌低、中劑量組(C、D)及鱉甲軟肝組(F)陽(yáng)性表達(dá)面積減少，染色變淺；抗纖抑癌高劑量組(E)陽(yáng)性表達(dá)面積則明顯減少，染色減輕。見(jiàn)插頁(yè)圖1。采用IPP軟件對(duì)其陽(yáng)性表達(dá)MOD進(jìn)行半定量分析，兩兩比較可見(jiàn)，模型組MOD值較正常組顯著升高(P<0.01)，抗纖抑癌高劑量組MOD值較模型組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.2 各組大鼠肝組織中PI3K、Akt mRNA的表達(dá)水平 見(jiàn)圖3。與正常組相比，模型組PI3K、Akt mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，抗纖抑癌低、中、高劑量組及鱉甲軟肝組PI3K、Akt mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.01)；與鱉甲軟肝組相比，抗纖抑癌低劑量組PI3K、Akt mRNA的表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05)，抗纖抑癌高劑量組PI3K mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，抗纖抑癌高劑量組Akt mRNA的表達(dá)顯著降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2.各組大鼠肝組織GST-Pi平均光密度(MOD)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與鱉甲軟肝組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下圖同。

圖3 各組大鼠肝組織中PI3K、Akt mRNA達(dá)結(jié)果

2.3 各組大鼠肝組織中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白的表達(dá)水平 見(jiàn)圖4。與正常組相比，模型組PI3K、p-PI3K及p-Akt蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，抗纖抑癌低劑量組PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)，抗纖抑癌中、高劑量組PI3K、p-PI3K及p-Akt蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與鱉甲軟肝組相比，抗纖抑癌高劑量組p-PI3K蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖4 各組大鼠肝組織PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt 蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

肝癌前病變的實(shí)質(zhì)是肝細(xì)胞異常增殖、分化及凋亡紊亂[6]，是肝纖維化、肝硬化進(jìn)展為肝癌的重要階段[7]。預(yù)防及阻斷肝癌前病變的發(fā)生、發(fā)展，逐漸成為當(dāng)前肝癌防治工作的重點(diǎn)。目前，在肝癌前病變的治療方面還沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的療效確切的上市藥物，無(wú)論西醫(yī)還是中醫(yī)都處在同一條起跑線(xiàn)上，開(kāi)展具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中醫(yī)藥干預(yù)肝癌前病變研究具有重要戰(zhàn)略意義?？估w抑癌方是葉永安教授治療肝癌前病變的經(jīng)驗(yàn)方，由柴胡、黃芪、山藥、白芥子等藥物組成，具有調(diào)肝健脾、活血化痰之功，在臨床上取得了較好的療效。已完成的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，抗纖抑癌方可減輕肝癌前病變大鼠的肝細(xì)胞變性壞死、結(jié)締組織增生和肝細(xì)胞異型增生程度，降低 GST-Pi、PCNA、AFP的表達(dá)，抑制HSC活化，調(diào)控 MMP-1、 COX-2及 TIMP-1 表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解、抑制腫瘤血管生成[8, 9]。

在肝癌前病變的研究中，GST-Pi是目前公認(rèn)的癌前指標(biāo)，在許多惡性腫瘤中均有不同程度地表達(dá)，特別是在癌前病變及分化較好的腫瘤中有著較高的表達(dá)[10]。由于大多數(shù)的異常增生結(jié)節(jié)中都高度表達(dá)此種酶，因此在實(shí)驗(yàn)中被廣泛用作肝癌前病變的標(biāo)志物。GST-Pi 陽(yáng)性灶數(shù)目和面積在一定程度上反應(yīng)了癌細(xì)胞的增殖情況[11]。本研究中抗纖抑癌方干預(yù)組GST-Pi陽(yáng)性灶數(shù)量及陽(yáng)性表達(dá)面積明顯減少，表明抗纖抑癌方對(duì)肝細(xì)胞的異常增殖有抑制作用。

PI3K/Akt 信號(hào)通路在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]，該通路抑制劑可顯著控制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移[12, 13]。此外，PI3K/Akt的激活在肝纖維化、肝硬化及肝癌的行程中發(fā)揮重要作用，諸多研究將PI3K/Akt 信號(hào)通路作為治療慢性肝病的重要靶標(biāo)。Wei等[14]研究發(fā)現(xiàn)，積雪草酸通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt /mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑可抑制肝星狀細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)合成，延緩CCL4 誘導(dǎo)的大鼠纖維化的形成。Ye等[15]通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鴉膽子素可抑制HCC增殖并誘導(dǎo)HCC凋亡，其機(jī)制與調(diào)控PI3K/Akt /mTOR信號(hào)通路相關(guān)。本研究顯示抗纖抑癌方可下調(diào)PI3K/Akt通路中相關(guān)mRNA及蛋白的表達(dá)，抑制PI3K及Akt的磷酸化，從而誘導(dǎo)異型細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步阻斷肝癌前病變的進(jìn)展。

綜上所述，抗纖抑癌方對(duì)于大鼠的肝癌前病變具有抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K /Akt 信號(hào)通路相關(guān)。本研究結(jié)果為抗纖抑癌方干預(yù)肝癌前病變作用機(jī)制的深入探討提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。