趙彬彬 汪 蓉 姜煜資 張 瑩 高月求 陳建杰 王靈臺 聶紅明△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院(上海，200021) 2.上海市浦東新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院

大多數(shù)慢性肝病是一種嚴(yán)重的進(jìn)展性疾病，肝損傷伴隨慢性肝病進(jìn)展的全部過程。因此，有效的治療肝損傷對于延緩慢性肝病的進(jìn)展具有重要的意義。肝損傷是多種肝臟疾病共有的病變結(jié)果，乙醇、藥物、毒物、病毒等許多因素都可以誘導(dǎo)肝損傷。肝損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，例如氧化應(yīng)激、CYP450 酶系代謝異常、內(nèi)毒素、免疫反應(yīng)、炎癥因子以及各種信號通路等。其中Toll 樣受體(TLRs) 作為一個(gè)模式識別受體家族，其介導(dǎo)的炎癥信號通路廣泛參與和加劇了各種肝損傷的發(fā)生發(fā)展[1～8]。

補(bǔ)腎方是由王靈臺教授所創(chuàng)，歷經(jīng)30多年的臨床驗(yàn)證及其課題組相關(guān)研究，表明補(bǔ)腎方具有顯著抗肝損傷作用，但其作用機(jī)制尚待明確。前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎方具有下調(diào)多種炎癥介質(zhì)作用，如TNF、IL-6、IL-1等，同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎方能下調(diào)TLR3/9的表達(dá),補(bǔ)腎方的抗肝損傷作用可能與其抑制TLRs相關(guān)炎癥信號通路,從而下調(diào)炎癥介質(zhì)相關(guān)[9～11]。因此，本文試從TLRs介導(dǎo)的炎癥信號通路來進(jìn)一步闡明補(bǔ)腎方的抗肝損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級健康成年C57BL小鼠42只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級動(dòng)物房，清潔飲水，自由取食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑 采用以補(bǔ)腎方及其拆方為組方的我院院內(nèi)制劑—補(bǔ)腎沖劑(滬衛(wèi)藥N(97)-080，均采用深圳華潤三九現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)的中藥免煎顆粒。)補(bǔ)腎方：由仙靈脾、菟絲子、甜蓯蓉、桑寄生、生地、枸杞子、虎杖、黃芩、苦參各15g、青皮10g；補(bǔ)腎方拆方：補(bǔ)腎陽組(仙靈脾、菟絲子、甜蓯蓉各15g)、補(bǔ)腎陰組(桑寄生、生地、枸杞子各15g)、清化濕熱組(虎杖、黃芩、苦參各15g)；引經(jīng)藥：青皮9g。

刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma-Aldrich。肝功能試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 ELISA試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司。蛋白質(zhì)印跡分析使用的一抗：抗TLR4，抗TLR3和抗TLR9購自NovusBiologicals LLC；抗TNF-相關(guān)聯(lián)因子(TRAF)6，抗IFN調(diào)節(jié)因子(IRF)3，抗TBK1，抗TRAF相互作用蛋白(TIRP)購自Abcam；反核因素(NF)-κB，抗MyD88購自Cell Signaling Technology。二抗購自R&DSystems。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 雌雄不限，隨機(jī)分成7組。A組(正常，Control)：等體積生理鹽水(NS)；B組(模型組，Con A)：等體積NS；C組(補(bǔ)腎全方組，BSQ)：等劑量補(bǔ)腎方；D組(補(bǔ)腎陽組，BSY)：等劑量補(bǔ)腎陽藥物；E組(補(bǔ)腎陰組，BSC)：等劑量補(bǔ)腎陰藥物；F組(清化濕熱組，QH)：等劑量清化濕熱藥物；G組(引經(jīng)組，YJ)：等劑量引經(jīng)藥物。各組均予以灌胃給藥，A、B組給予同體積的生理鹽水，C～G組給予同劑量相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天，第7天給藥后4h，除正常組外均給予ConA15mg/kg尾靜脈注射，注射后18h處死老鼠。

1.2.2 指標(biāo)檢測 肝功能指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)和膽堿酯酶(ChE)；肝組織HE染色；ELISA法檢測外周血相關(guān)炎癥介質(zhì)如(IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-β)；Western Blot法檢測TLR3/4/9相關(guān)信號通路鏈中的關(guān)鍵蛋白，如(TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-κB、TIRP、MyD88)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎方對實(shí)驗(yàn)小鼠肝功能的影響 見圖1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)小鼠肝功能指標(biāo)的變化(*P<0.05)

2.2 各組實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理變化情況 肝組織HE染色表明，補(bǔ)腎全方及拆方各組均具有一定的改善肝組織炎癥壞死的作用，但補(bǔ)腎全組、補(bǔ)腎陽組中壞死區(qū)域的面積與模型組相比顯著減小。見插頁圖2。

2.3 各組初小鼠外周血炎癥因子水平 見圖3。

圖3 各組實(shí)驗(yàn)小鼠主要炎癥因子IL-6、TNF-α、TNF-β、IL-1的表達(dá)情況

2.4 各組實(shí)驗(yàn)小鼠TLR3/4/9信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況 Western Blot檢測結(jié)果表明，ConA處理后TLR3/4/9相關(guān)信號通路鏈中的關(guān)鍵蛋白如TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-κB、TIRP、MyD88的表達(dá)均增加，補(bǔ)腎全方及其拆方處理后，TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、NF-κB、MyD88在補(bǔ)腎全組中表達(dá)減少，TLR9、TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88在補(bǔ)腎陽組中表達(dá)減少，TLR9、TLR3、TRAF6、NF-κB在補(bǔ)腎陰組中表達(dá)減少，TRAF6在清化濕熱組中表達(dá)減少。

3 討論

Toll樣受體(TLR)是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，通過特異識別病原微生物及其細(xì)胞壁上的一些保守成分，啟動(dòng)非特異性免疫，并誘導(dǎo)特異性免疫，是連接天然免疫和特異性免疫的橋梁。所有TLR由氨基末端結(jié)構(gòu)域組成，其特征在于多個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列和羧基末端TIR與含TIR的適配器交互的域。Toll樣受體(TLRs)構(gòu)成一系列受體，直接識別廣譜的外源性和內(nèi)源性配體，在實(shí)現(xiàn)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并參與細(xì)胞增殖，存活，凋亡，血管生成，組織重塑和修復(fù)[12]。在先天免疫髓樣細(xì)胞中，TLRs誘導(dǎo)炎癥分泌因子[13]。

TLR主要激活信號傳導(dǎo)介質(zhì)MyD88(下游所有TLR成員除了TLR3)和TRIF(含有TIR域的銜接子誘導(dǎo)干擾素-β)最終導(dǎo)致激活NF-κB通路和幾種促炎癥分泌細(xì)胞因子[14]。MyD88 通路活化包括三條途徑：通過 NF-κB-促炎性細(xì)胞因子通路，激活炎性細(xì)胞因子 IL-6、TNF-α 基因致其表達(dá)；通過 IRF3/5-IFNα/β或IRF7/5-IFNα/β 通路激活 I 型干擾素基因致其表達(dá)；通過MAPK激活CD80、CD86 共剌激因子表達(dá)，參與獲得性免疫反應(yīng)。MyD88 通路中的NF-κB促炎通路參與炎癥慢性化和癌癥發(fā)生發(fā)展；MyD88 通路中的非 NF-κB 促炎通路和非MyD88 通路(TRIF-IRF3/5/7-IFNα/β)，通過介導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，并啟動(dòng)特異性免疫。已知TLR和MyD88是NF-κB的上游調(diào)節(jié)因子，在各種類型的細(xì)胞中，MyD88介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1等，最終導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)劑(如細(xì)胞因子)和抗菌劑(包括AMP)的轉(zhuǎn)錄[15]。過盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)提高了TLR4，TLR2和(MyD88)蛋白表達(dá)水平，曲古菌素A(TSA)可以減弱TLR4，TLR2和(MyD88)蛋白表達(dá)水平，其研究結(jié)果表明TSA通過抑制膿毒癥期間TLR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來減輕肝損傷[16]。Jung-Woo Kang等研究結(jié)果表明，褪黑激素通過調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，改善I / R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而保護(hù)肝臟[17]。先前已有研究表明CD14是TLR依賴性促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生所必需的，Chen Z等繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在敗血癥條件下上調(diào)CD14表達(dá)時(shí)，TLR的MyD88依賴性和TRIF非依賴性途徑被激活，該研究破譯了TLR與CD14之間的關(guān)鍵性交叉對話[18]。

本課題組從國家六五攻關(guān)項(xiàng)目開始確立補(bǔ)腎法為主治療慢性乙型肝炎的研究，歷經(jīng) 30 余年臨床驗(yàn)證，證實(shí)補(bǔ)腎法和補(bǔ)腎方治療慢性乙型肝炎的有效性。同時(shí)對補(bǔ)腎法的免疫調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，在機(jī)制探討中，課題組在各級別課題資助下開展了系列實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)補(bǔ)腎方通過對免疫的多環(huán)節(jié)調(diào)控作用發(fā)揮其抗炎和促生干擾素效應(yīng)。其效應(yīng)包括：增強(qiáng) IL-2、IFN等 Th1 型細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制 IL-4、IL-10 等 Th2 型細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn) CD8+的CTL功能活化等；提高 NKT 細(xì)胞數(shù)量，改善外周血樹突細(xì)胞共刺激分子表達(dá)，促進(jìn)IFN分泌等。并且發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎方能促進(jìn)慢性乙型肝炎患者外周血 PBMC中Toll樣受體(TLR)3和9表達(dá)而介導(dǎo)抗炎效應(yīng)[9～11]。

本研究進(jìn)一步證實(shí)，補(bǔ)腎方及其各主要配伍組分均有一定的抗肝損傷作用，補(bǔ)腎小鼠方效果，優(yōu)于各主要配伍組分。值得一提的是，補(bǔ)腎陽組小鼠AST顯著下降(P<0.05)，補(bǔ)腎陰組小鼠ALT顯著下降(P<0.05))，而補(bǔ)腎全方組小鼠ALT、AST均顯著下降(P<0.05)，也一定程度說明中醫(yī)配伍的重要性。通過對炎癥因子的分析，補(bǔ)腎全方組的IL-6、IL-1、TNF-α、TNF-β均顯著下降(P<0.05)，補(bǔ)腎陽組的TNF-β、IL-1顯著下降(P<0.05)，而補(bǔ)腎陰組的TNF-α、TNF-β、IL-6顯著下降(P<0.05)，再次說明補(bǔ)腎陽與補(bǔ)腎陰在補(bǔ)腎方中的配伍協(xié)同性。ConA處理后TLR3/4/9信號通路中關(guān)鍵蛋白TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-kB、TIRP、MyD88的蛋白表達(dá)均顯著增加，說明TLR通路被刀豆蛋白A介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)激活。TLRs通路激活后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，如c-JunN-末端激酶、p38、絲裂原活化蛋白激酶和磷酸肌醇3-激酶，轉(zhuǎn)錄因子IRF3/5/7，NF-κB，激活蛋白-1以及一些重要的銜接蛋白(如MyD88，TRIF，TRAM、TRAF6等)協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)[19，20]，最終促進(jìn)相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)。補(bǔ)腎方干預(yù)后的結(jié)果表明,補(bǔ)腎方通過抑制TLR3/4/9的表達(dá)及其下游通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，影響TLRs介導(dǎo)的炎癥信號通路, 最終下調(diào)相關(guān)炎癥介質(zhì)，發(fā)揮其抗肝損傷作用。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同配伍組分對TLR3/4/9及其下游通路中關(guān)鍵蛋白的影響不盡相同，通過全方配伍后能協(xié)同增效，這也是中醫(yī)組方配伍的魅力所在。

需要指出的是，由于TLRs在肝臟多種免疫細(xì)胞的表面均有表達(dá)，如T淋巴細(xì)胞、肝枯否氏細(xì)胞等，若需要進(jìn)一步明確補(bǔ)腎方對TLRs及其相關(guān)信號通路的抑制是作用在哪種細(xì)胞，則需要找到更適合的動(dòng)物模型，該模型既能造成免疫性肝損傷，又能在炎癥區(qū)域成功分離提取和培養(yǎng)出相關(guān)免疫細(xì)胞。