葉 陳

中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心，廣東省廣州市 510610

精液優(yōu)化處理技術(shù)作為輔助生殖(Assisted reproductive technology，ART)中的起始重要環(huán)節(jié)，其能夠?qū)⒎蔷蛹?xì)胞成分進(jìn)行有效剔除，并回收有效功能形態(tài)精子細(xì)胞，以促進(jìn)精子獲能，為ART后續(xù)提供正常形態(tài)學(xué)精子，提高臨床妊娠率[1-2]。近年來(lái)，隨著育齡夫婦不孕不育率的不斷升高，ART技術(shù)日臻成熟。目前臨床常見(jiàn)的精液處理方法有上游法(Swim-up)、密度梯度離心法(Density gradient centrifugation，DGC)及DGC衍生法。本研究旨在對(duì)不同精液優(yōu)化方法處理后精子精液常規(guī)指標(biāo)及精子完整性等相關(guān)參數(shù)變化進(jìn)行對(duì)比，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月—2019年5月于我院生殖中心就診，且禁欲3～5d后采集并送檢至男科實(shí)驗(yàn)室的100份新鮮精液標(biāo)本作為研究對(duì)象，采集過(guò)程中嚴(yán)格按照無(wú)菌操作流程進(jìn)行，根據(jù)不同處理方式均分為三組。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：所有參與實(shí)驗(yàn)者禁欲3～5d后，到院取精，收集標(biāo)本室溫下靜置1h，待精液完全液化后均分為三組，采用上游法、密度梯度離心法及聯(lián)合法進(jìn)行處理，分為SUP組、DGC組及聯(lián)合組。

1.2.2 SUP組：取1ml精液液化后以1∶3的比率加入人類輸卵管液體(HTF)，混勻后離心5min(300g)，離心管傾斜45°置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)上游0.5～1h，靜置避免晃動(dòng)。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取導(dǎo)管上層雨霧狀液體，加入2ml HTF液體，混勻，離心5min(1 000r/min)后取上清液，加入0.5ml HTF液，沉淀松散后分層加入HTF液，45°傾斜靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20min，吸取上部精液懸濁液。

1.2.3 DGC組：取2ml濃度80%及2ml 40%的密度梯隊(duì)分離液(SAGE，America)，上層加入2ml液化精液，液體分層界面清晰，離心20min(1 800r/min)取上清液，加入2ml擬人輸卵管液(mHTF)及10%血清替代物(SPS)組成的培養(yǎng)液，混勻后離心5min(1 700r/min)，取上清液沉淀團(tuán)混勻，傾斜45°加入1.5ml洗精劑后，靜置37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，上游1h。

1.2.4 聯(lián)合組：先進(jìn)行DGC法，再進(jìn)行SUP法。

1.2.5 檢測(cè)方法：精子存活率檢測(cè)：取三組處理后樣本10μl，分別滴于載玻片上，用伊紅進(jìn)行染色，靜置30s后在低倍鏡下選擇分布均勻區(qū)域后轉(zhuǎn)高倍鏡觀察20個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)精子，記錄未被染上顏色的精子數(shù)量，以此計(jì)算精子存活率；活力檢測(cè)：用英國(guó)HAMILON精子分析儀分別對(duì)處理后的三組樣本進(jìn)行活力檢測(cè)；精子形態(tài)：取樣(10μl)均勻涂布于載玻片上，室溫下自然干燥，置于95%乙醇固定15min，然后采用傳統(tǒng)巴氏染色法鏡下染色，待涂片自然干燥后，計(jì)數(shù)200個(gè)完整形態(tài)精子，記錄其中異常形態(tài)精子數(shù)，以此計(jì)算精子畸形率；DFI(DNA Fracture Index,DNA斷裂指數(shù))與HDS(High DNA Stainbility,高DNA可染性)檢測(cè)；通過(guò)BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀對(duì)DFI及HDS水平進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自浙江星博生物科技股份有限公司。

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組樣本精子存活率、活力、形態(tài)、DFI及HDS水平。精子存活率=活動(dòng)精子數(shù)量/200×100%；精子活力分級(jí)：A級(jí)(精子活動(dòng)良好，運(yùn)動(dòng)活潑，快速直線運(yùn)動(dòng))、B級(jí)(精子活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)快速非直線或直線遲鈍運(yùn)動(dòng))、C級(jí)(精子活動(dòng)不良，原地旋轉(zhuǎn)移動(dòng))、D級(jí)(精子不能活動(dòng))，精子活動(dòng)率=A級(jí)活動(dòng)率+B級(jí)活動(dòng)率+C級(jí)活動(dòng)率；精子形態(tài)：畸形精子包括精子頭部缺陷、頸部及中段缺陷、尾部異常以及過(guò)量胞漿殘留，計(jì)數(shù)過(guò)程中凡是異常形態(tài)不明顯視為異常精子，未成熟圓形精子、無(wú)頭尾精子不予計(jì)數(shù)，精子畸形率=畸形精子數(shù)量/200×100%。精子DFI和HDS值是精子DNA碎片的兩個(gè)指標(biāo)，數(shù)值越低表示DNA碎片率低,即精子DNA完整性越好。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析進(jìn)行差異比較，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行，P<0.05則差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組處理后精子基本狀態(tài)比較 三組處理后精子存活率、活動(dòng)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組精子存活率、活動(dòng)率均顯著高于其余兩組， SUP組顯著優(yōu)于DGC組；三組精子畸形率組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 三組處理后精子DFI、HDS水平比較 三組DFI、HDS比較，聯(lián)合組DFI、HDS顯著低于其余兩組，SUP組低于DGC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

精子優(yōu)選技術(shù)是ART關(guān)鍵所在，隨著ART技術(shù)的廣泛應(yīng)用，臨床上更加期望通過(guò)優(yōu)選技術(shù)能夠獲得更加有效完整的精子。精液處理過(guò)程主要是剔除精液中的精漿、細(xì)胞碎片及微生物等非精細(xì)胞成分，提高正常形態(tài)精子數(shù)量密度，提高輔助生殖成功率[3-5]。優(yōu)選技術(shù)中較為成熟的方法以SUP及DGC法為主。SUP法原理主要是依靠精子自身運(yùn)動(dòng)，通過(guò)在精液上加入密度較低的介質(zhì)，通過(guò)精子自發(fā)向上移動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)精液的處理及分離，報(bào)道稱[6-8]，上游法能夠得到高質(zhì)量、具有完整頂體區(qū)域的橢圓形精子，其獲得精子存活率高于其他方法，但精子回收率較低，能夠篩除染色體異常及不成熟精子，但不能提高完整頂體精子比例。DGC法原理則是根據(jù)不同活力及密度精子穿透密度梯度界值速度不同，對(duì)精子形態(tài)能夠進(jìn)行有效區(qū)分，離心后精液各種成分在密度梯度溶液中達(dá)到自身平衡，從而根據(jù)密度不同分析精子，對(duì)抗精子抗體陽(yáng)性、精漿黏度較大、液化不良的患者具有較高的篩除效率，與SUP法相比，DGC法能夠提高精子的回收率，但精子存活率不如SUP法，因此兩種方法各有利弊，現(xiàn)目前也有部分研究將兩種方法進(jìn)行合并使用，但對(duì)比研究不夠充分[9-10]。目前，精子質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)主要以精子活動(dòng)率、存活率、形態(tài)比較為主，隨著技術(shù)發(fā)展，精子DFI值正逐漸成為臨床評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的重要指標(biāo)，研究證實(shí)[11]，含有DNA碎片的精子仍具有使卵子受精的能力，但可能對(duì)胚胎發(fā)育造成影響，因此DNA完整性是精子優(yōu)選方法的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

表1 三組處理后精子基本狀態(tài)比較

表2 三組處理后精子基本狀態(tài)比較

研究結(jié)果顯示，通過(guò)將同質(zhì)樣本分為三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較發(fā)現(xiàn)，三組在精子狀態(tài)比較上，聯(lián)合組精子存活率、活動(dòng)率均顯著高于其余兩組，DFI和HDS值(DNA碎片率的兩個(gè)指標(biāo))顯著低于其余兩組，SUP組精子存活率、活動(dòng)率顯著高于DGC組，DNA碎片率顯著低于DGC組；與相關(guān)研究結(jié)果相似[12]，對(duì)于精子濃度較低患者一般首選采用DGC法進(jìn)行篩選，對(duì)精子濃度較高患者可采用聯(lián)合法進(jìn)行，三組精子畸形率進(jìn)行比較，三種方法對(duì)精子畸形率篩選的效率基本相同。對(duì)精子DFI及HDS進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合法精子DFI及HDS值顯著低于其余兩組，而SUP組顯著低于DGC組，這表示聯(lián)合組DNA完整性優(yōu)于其余兩組，而SUP組DNA完整性優(yōu)于DGC組，這可能與DGC法的離心方式有關(guān)，而SUP法與DGC法相比，進(jìn)行處理后能夠獲得更多DNA完整精子，研究證實(shí)，SUP法能夠獲得更多端粒均值較長(zhǎng)的精子，而聯(lián)合組雖然進(jìn)行DGC處理后精子DNA碎片率升高，通過(guò)離心后進(jìn)行SUP能夠有效篩選出更加完整DNA的精子，上游后能夠更加徹底去除梯度介質(zhì)，盡量減少介質(zhì)對(duì)精子的影響，聯(lián)合組與單純SUP組相比，能夠在DGC處理時(shí)去除精漿、細(xì)胞碎片后再進(jìn)行上游，減少了非精子細(xì)胞在上游過(guò)程中產(chǎn)生ROS，減少DNA碎片的產(chǎn)生。

綜上所述，與單純上游法或密度梯度離心法相比較，聯(lián)合法能夠更好地處理精液中非細(xì)胞成分影響，減少對(duì)精子功能的影響，對(duì)提高精子存活率、DNA完整率具有較好作用。