馬曉中，張韶鵬，王菁，姜楠，陳慶良*

(1. 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070； 2. 天津市胸科醫(yī)院心外科，天津市心血管病研究所，天津，300222； 3. 天津市胸科醫(yī)院病理科，天津 300222)

夾層動(dòng)脈瘤(aortic dissecting aneurysm)是臨床上最為兇險(xiǎn)的疾病之一，具有發(fā)病急促，進(jìn)展迅猛，死亡率高等特點(diǎn)[1]，目前對于其發(fā)病機(jī)制的研究多停留在疾病的終末狀態(tài)。因此，探索符合人類流行病特點(diǎn)和病理特點(diǎn)的動(dòng)物模型，對于研究疾病的啟動(dòng)和發(fā)展等的病理過程和發(fā)病機(jī)制具有重要意義。對于夾層動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型的探索，已有60余年的歷史，傳統(tǒng)的外科造模方法具有手術(shù)難度大、費(fèi)用高昂等不足。近年來研究者發(fā)現(xiàn)β-氨基丙腈(BAPN)可抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)賴氨酰氧化酶活性，從而導(dǎo)致大動(dòng)脈壁彈力纖維和膠原纖維分離，進(jìn)而發(fā)生主動(dòng)脈壁擴(kuò)張或夾層[2]。但不同研究之間具有較大差異[3-4]，且BAPN本身具有較大毒性[5]。本研究旨在探索BAPN誘導(dǎo)夾層動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型的可靠性，尋求符合人類疾病特點(diǎn)的動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究夾層動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級4 ～ 5周齡雄性SD大鼠18只，體重(110.50 ± 2.51)g；SPF級3周齡雄性C57BL/6小鼠40只，體重(12.21 ± 0.51) g，均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號分別為SD大鼠【SCXK (京) 2016-0006】、C57BL/6小鼠【SCXK(京)2014-0013】)。動(dòng)物飼養(yǎng)于天津市環(huán)湖醫(yī)院(天津市神經(jīng)外科研究所)【SYXK(津)2018-0009】，飼養(yǎng)期間給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料，飼養(yǎng)環(huán)境房內(nèi)濕度恒定，溫度20 ～ 25℃。

1.1.2 試劑與儀器

β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile，美國西格瑪-奧德里奇公司)，二甲苯、無水乙醇、95%乙醇(天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠)，蘇木色精分色液、伊紅染液、蘇木色精染液(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司)，10%中性福爾馬林固定液(天津久圣醫(yī)療電子儀器有限公司)。

全自動(dòng)脫水機(jī)(Peloris，Leica公司，德國)，生物組織包埋機(jī)(JBM-A型，久圣醫(yī)療電子儀器，天津)，切片機(jī)(RM2135，Leica公司，德國)，全自動(dòng)染片機(jī)(ST5020，Leica公司，德國)，光學(xué)顯微鏡(BX50，Olympus公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)房適應(yīng)3 ～ 4 d后開始實(shí)驗(yàn)。18只4 ～ 5周齡SD大鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別記作SD-0.2(A組)、SD-0.4(B組)、SD-0.6(C組)。40只3周齡C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別記作C57-0.2(D組)、C57-0.4(E組)、C57-0.6(F組)、C57-對照(對照組)。

1.2.2 模型制作

A組、B組、C組大鼠分別給予0.2%、0.4%、0.6% BAPN溶液，飼養(yǎng)7周。D組、E組、F組和對照組小鼠分別給予0.2%、0.4%、0.6% BAPN水溶液和蒸餾水作為飲用水，飼養(yǎng)4 ～ 6周。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由取食飲水，記錄鼠每日采水量，每周進(jìn)行1次體重測量，直至動(dòng)脈瘤破裂死亡或?qū)嶒?yàn)結(jié)束。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)期間死亡的動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行解剖，分離大動(dòng)脈。飼養(yǎng)期結(jié)束后，將存活的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射過量戊巴比妥鈉(200 mg/kg)處死，進(jìn)行解剖。自心臟至髂動(dòng)脈分叉處，充分游離大動(dòng)脈，游離心臟及雙腎，同時(shí)將異常的骨骼組織、肺、破裂的腸壁等臟器分離，將獲取的標(biāo)本于10%中性福爾馬林固定液中固定24 h以上，制成4 μm石蠟切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

收集天津市胸科醫(yī)院行孫氏手術(shù)的主動(dòng)脈夾層患者的升主動(dòng)脈標(biāo)本10例，制成4 μm石蠟切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，將夾層患者大動(dòng)脈病理變化與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分析比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BAPN對鼠體重和采水量的影響

隨著給藥濃度的增加， C57BL/6小鼠和SD大鼠的藥物攝入量均明顯增加，采水量卻呈現(xiàn)出減少態(tài)勢，且體重增長趨勢減緩，其中SD大鼠的量效關(guān)系更為明顯(圖1)。

2.2 生存分析

如圖2所示，隨著給藥濃度的增加，SD大鼠和C57BL/6小鼠生存率均呈現(xiàn)下降的趨勢。A組、B組、C組4周生存率分別為83.3%、50.0%、43.3%；7周生存率分別為33.3%、16.7%、0。C57BL/6小鼠中，D組、E組、F組4周生存率分別為70.0%、80.0%、50.0%；7周生存率分別為50.0%、40.0%、40.0%。SD大鼠和C57BL/6小鼠4周生存率、7周生存率最低組均為0.6%BAPN組。A組7周生存率最高，為50.0%，E組與F組7周生存率均為40%。

圖1 C57BL/6小鼠和SD大鼠體重、采水量、BAPN攝入量情況Figure 1 Changes of body weight, water intake and BAPN intake in the SD rats and C57BL/6 mice

2.3 大動(dòng)脈改變

A、B、C組給藥4周后，均無動(dòng)脈瘤發(fā)生；給藥7周后，各組發(fā)生大動(dòng)脈破裂或動(dòng)脈瘤的數(shù)量分別為1只、2只、0只。 B組中共兩只發(fā)生動(dòng)脈瘤，1只大鼠于飼養(yǎng)第6周因升主動(dòng)脈破裂而死，破口位于升主動(dòng)脈，另1只于第7周末飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)處死，解剖提示慢性夾層動(dòng)脈瘤(圖3)。其余大鼠，解剖后大動(dòng)脈均未見明顯異常。

圖2 C57BL/6小鼠與SD大鼠生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of the SD rats and C57BL/6 mice

D、E、F組給藥4周動(dòng)脈瘤發(fā)生率分別為10%、20%、20%，截止第7周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈瘤發(fā)生率分別為50%、70%、60%(表1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，D組1只發(fā)生升主動(dòng)脈瘤；E組中，1只為升主動(dòng)脈瘤，2只為降主動(dòng)脈瘤；F組中2只均為升主動(dòng)脈瘤。

光鏡下可見實(shí)驗(yàn)組大動(dòng)脈中膜增厚，彈力纖維排列紊亂，伴大量紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(圖4)。C57BL/6小鼠中，實(shí)驗(yàn)組升主動(dòng)脈直徑和中膜面積均呈現(xiàn)增長趨勢(圖5)。對照組升主動(dòng)脈直徑為(0.96 ± 0.07)mm，中膜面積為(0.19 ± 0.02)mm2；D組升主動(dòng)脈直徑、中膜面積分別為(0.98 ± 0.22)mm、(0.27 ± 0.12)mm2；E組升主動(dòng)脈直徑、中膜面積分別為(0.99 ± 0.11)mm、(0.23 ± 0.11)mm2；F組升主動(dòng)脈直徑、中膜面積分別為(1.02 ± 0.08)mm、(0.31 ± 0.09)mm2。

表1 夾層動(dòng)脈瘤發(fā)生率(%)Table 1 Incidence rate of aortic aneurysm

注：箭頭所示為破口或動(dòng)脈瘤形成病理切片可見夾層形成。(100×)圖3 夾層動(dòng)脈瘤大體標(biāo)本和病理切片改變Note. Yellow arrow indicated the location of aneurysm. Dissection formation was showed in histology. (100×)Figure 3 Macroscopic and histopathological features of the dissecting aneurysm

2.4 其他臟器改變

C57BL/6小鼠組，E組中1只小鼠發(fā)生脊柱測彎，1只小鼠死亡后解剖提示于大量胸腔積液，肺葉壓縮萎陷，呈白色。其余C57BL/6小鼠解剖均未見明顯臟器異常(除外大動(dòng)脈破裂或擴(kuò)張)。

SD大鼠組，A組中3只SD大鼠發(fā)生腸破裂，B組中有2只SD大鼠發(fā)生腸破裂，C組中4只SD大鼠發(fā)生腸破裂(表2)。發(fā)生腸破裂的大鼠，均自直腸發(fā)生腸梗阻，降結(jié)腸處發(fā)生破裂，致嚴(yán)重腹膜炎，空回腸嚴(yán)重腸脹氣。解剖可見脊柱側(cè)彎，脊柱旁或肋骨近肋脊關(guān)節(jié)出可見瘤樣膨出，呈白色，質(zhì)地稍硬(圖6)，光鏡下顯示鈣鹽沉積，可見異形的腫瘤細(xì)胞。心肌和結(jié)腸肌層均可見不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(圖7)。

2.5 夾層動(dòng)脈瘤患者大動(dòng)脈病理改變

人急性主動(dòng)脈夾層大動(dòng)脈病理改變主要體現(xiàn)為：囊性中膜壞死、平滑肌細(xì)胞排列紊亂及彈力纖維斷裂。其中，平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(變性壞死、排列紊亂及重塑)被認(rèn)為是發(fā)生夾層動(dòng)脈瘤的重要因素[6-7]。夾層動(dòng)脈瘤患者平滑肌變性壞死重于平滑肌重塑、基質(zhì)降解、基質(zhì)黏液樣變性等(圖8)。

注：可見實(shí)驗(yàn)組大動(dòng)脈中膜增厚明顯，彈力纖維出現(xiàn)斷裂、排列紊亂等改變，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主。(100×)圖4 各組升主動(dòng)脈病理改變Note. Increased thickness of the tunica media, disruption and disarrangement of elastic fibers, and inflammatory cell infiltration and many multi-nucleate giant cells are present in the aortic tissues. (100×)Figure 4 Pathological changes of the ascending aortas

注： 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組升主動(dòng)脈直徑和中膜面積均呈現(xiàn)增長趨勢(P< 0.05)。圖5 C57BL/6各組小鼠升主動(dòng)脈直徑及中膜面積變化Note. Compared with the control group, both diameter and area of tunica media showed a rising tendency (P< 0.05).Figure 5 Changes of the diameter and area of tunica media of the mouse ascending aortas

組別GroupsSD大鼠(%) SD rats (%) C57BL/6小鼠(%) C57BL/6 mice (%)腸破裂Colon rupture骨骼畸形Scoliosis胸腔積液Hydrothorax腸破裂Colon rupture骨骼畸形Scoliosis胸腔積液Hydrothorax0.2%50(3/6)0(0/6)0(0/6)0(0/10)0(0/10)0(0/10)0.4%33(2/6)33(2/6)0(0/6)0(0/10)10(1/10)10(1/10)0.6%66(4/6)33(2/6)0(0/6)0(0/10)0(0/10)0(0/10)

注.黃色箭頭所示為發(fā)生脊柱側(cè)彎、肋骨腫物、腸破裂部位。圖6 骨骼、結(jié)腸大體標(biāo)本Note. Yellow arrows indicated the sites of scoliosis, rib fracture and colon rupture.Figure 6 Macroscopic changes of the skeleton and colon

注： 心臟：心外膜下心肌細(xì)胞排列疏松，伴單核淋巴細(xì)胞浸潤。結(jié)腸：結(jié)腸肌層分離，大量紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。肋骨腫物：鈣鹽沉積，可見異形的腫瘤細(xì)胞。(100×)圖7 心臟、結(jié)腸和肋骨的病理改變Note. Heart, Loose arrangement of cardiomyocytes accompanied by lymphocyte and mononuclear cell infiltration. Colon, The muscle layer was dissected, and accumulation of great amount of erythrocytes and lymphocyte infiltration. Rib, calcium deposition and heteromorphic tumor cells. (100×)Figure 7 Histological changes of the heart, colon and rib

注：A-D為急性A型主動(dòng)脈夾層患者，其中D為醫(yī)源性主動(dòng)脈夾層。A、C、D：中膜分離，夾層形成并可見紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤。B：中膜平滑肌細(xì)胞變性、壞死，彈力纖維斷裂、排列紊亂，基質(zhì)粘液樣變性。(100×)圖8 夾層動(dòng)脈瘤患者升主動(dòng)脈病理切片Note. A-D. Ascending aorta from a patient with acute aortic dissecting aneurysm. D. Iatrogenic aortic dissection. A, C, D. Separation of the tunica media, with erythrocyte accumulation and inflammatory cell infiltration. B. Necrosis and degeneration of smooth muscle cells, destruction and disarrangement of elastic fibers in the tunica media, and mucoid degeneration of matrix. (100×)Figure 8 Histological changes in the human aortic tissues

3 討論

3.1 BAPN對鼠大動(dòng)脈影響

賴胺酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)是一種具有銅結(jié)合位點(diǎn)的單胺氧化酶[5, 8]，相對分子質(zhì)量為32 000，能夠氧化膠原和彈性蛋白的賴氨酸殘基，使這些纖維性蛋白的共價(jià)交聯(lián)，從而形成穩(wěn)定的細(xì)胞外基質(zhì)。BAPN是不可逆性LOX抑制劑，能競爭性地與彈性蛋白或氨基烷基結(jié)合，從而抑制彈性蛋白和膠原蛋白的交聯(lián)[2]。

BAPN處理剛離乳的幼鼠可致其大動(dòng)脈中模增厚，彈力纖維、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生排列紊亂、壞死等病理改變，與夾層患者大動(dòng)脈病理改變基本相符。3周齡幼鼠處于快速生長發(fā)育階段，BAPN可抑制大動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)成分的形成，從而導(dǎo)致動(dòng)脈瘤或動(dòng)脈夾層的形成。其作用有明顯的種屬差異，且與發(fā)育程度密切相關(guān)[3]。Ren等[3]證實(shí)，F(xiàn)VB小鼠動(dòng)脈瘤成模率遠(yuǎn)低于C57BL/6小鼠。本研究前期實(shí)驗(yàn)曾采用6周齡雄性C57BL/6小鼠，BAPN飼養(yǎng)6周未見大動(dòng)脈異常改變。而4 ～ 5周齡SD大鼠模型成功率低、死亡率高可能與周齡過大，生長發(fā)育趨于成熟有關(guān)。

3.2 BAPN對其他臟器影響

本研究中E組(C57-0.4%)，尸檢可見1只小鼠發(fā)生脊柱側(cè)彎，1只小鼠存在大量胸腔積液，未見明顯其他異常；SD大鼠組，腸破裂和肋骨腫物的發(fā)生率遠(yuǎn)高于夾層動(dòng)脈瘤發(fā)生率，而類似的情況在其他動(dòng)物模型研究中鮮有報(bào)道。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，賴胺酰氧化酶家族包括5種[2, 5]，每一種酶由不同的基因編碼：lysyl oxidase (LOX) 和 lysyl oxidase-like 1-4 (LOXL1 - LOXL4)。每一種LOX，其個(gè)體發(fā)育受特定組織或細(xì)胞的特異性表達(dá)和定位的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致LOX的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生的復(fù)雜變化[2, 9]。LOX功能非常廣泛,除了保持細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定外，還能夠抑制Ras癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，以及抑制腫瘤的形成[10]，對維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的正常、組織器官的發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)甚至腫瘤的轉(zhuǎn)移都具有重要的意義[11]。BAPN可以通過修飾膠原蛋白導(dǎo)致心肌異常[12]；在結(jié)直腸、膀胱、食管、頭頸部等組織發(fā)生的惡性腫瘤中，LOX家族相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加，表現(xiàn)為促腫瘤轉(zhuǎn)移作用[13]。Kubota等[14]的一項(xiàng)研究中，在雞胚孵化的49天，注入BAPN，發(fā)現(xiàn)多發(fā)骨骼畸形，特別是脛跗骨的畸形更為明顯。

基于BAPN作用機(jī)制及其他研究報(bào)道，可以認(rèn)為該試劑可對全身富含彈性蛋白和膠原蛋白的結(jié)締組織產(chǎn)生各種負(fù)面作用。盡管BAPN用于夾層動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型有較高的成功率，由于上述種種作用，該試劑造模過程中，不可避免地會發(fā)生因其他系統(tǒng)嚴(yán)重功能障礙而導(dǎo)致的死亡(如SD大鼠中發(fā)生率較高的腸破裂)，模型過高的死亡率勢必會影響該模型應(yīng)用于下一階段的研究。

3.3 模型成功率與BAPN量效關(guān)系

本研究中，C57-0.4組夾層動(dòng)脈瘤發(fā)生率最高為70%(7/10)，采用0.4%的給藥濃度，BAPN攝入量為0.6 g/(kg·d)。高艷香等[4]用同樣的方式成功建立了小鼠夾層動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，夾層動(dòng)脈瘤的發(fā)生對BAPN存在明顯的計(jì)量依賴性，而Ren等[3]實(shí)驗(yàn)結(jié)果則截然相反，本實(shí)驗(yàn)同樣不支持模型成功率與攝入量存在明顯正相關(guān)系。事實(shí)上，無論將BAPN混入飼料或是飲用水中，特定給藥濃度下，動(dòng)物攝入飼料或水的量難以準(zhǔn)確計(jì)量。因此，BAPN實(shí)際攝入量均存在較大誤差，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方案尚需大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

3.4 該動(dòng)物模型不足之處

1)實(shí)驗(yàn)周期較長，大部分動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)周期均以4周為限，而本實(shí)驗(yàn)4周成模率極低；2)本實(shí)驗(yàn)未采用其他特殊染色方法，無法進(jìn)行彈性蛋白、膠原蛋白等定性、定量分析；3)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中隨著動(dòng)物的死亡，存活動(dòng)物的體重、采水量等計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，未進(jìn)行有效的差異性檢驗(yàn)；4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量相對較少，實(shí)驗(yàn)方案未進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。

因種屬差異性等原因，任何動(dòng)物模型均不能完全代表人類疾病，研究者需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求來選擇合理的動(dòng)物模型。研究保護(hù)因素，可選用成模率較高的動(dòng)物模型，研究危險(xiǎn)因素則與之相反[4]。

4 結(jié)論

C57BL/6小鼠夾層動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型的病理改變與夾層動(dòng)脈瘤患者基本符合，選用0.4%濃度的BAPN溶液作為飲用水造模，可作為一種簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的動(dòng)物模型進(jìn)行下一步研究。然而，SD大鼠發(fā)生腸破裂、脊柱側(cè)彎等致死性并發(fā)癥比例高于夾層動(dòng)脈瘤發(fā)生率，其作為夾層動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型尚需進(jìn)一步探索。