黃愷，孫鑫，趙志敏，彭淵，陶艷艷，劉成海,*

(1. 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所，上海 201203)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝性DNA病毒，可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化與肝癌[1-2]。建立穩(wěn)定的HBV誘導(dǎo)的慢性肝炎肝纖維化動物模型對于乙肝肝纖維化病理機(jī)制及其藥物評價具有重要意義。本研究采用C57BL/6 N-Tg(1.28HBV)/Vst乙肝病毒轉(zhuǎn)基因(HBV-Tg)與rAAV8-1.3HBV腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染(rAAV)小鼠，聯(lián)合CCl4腹腔注射，誘導(dǎo)慢性乙肝肝纖維化發(fā)生。觀察比較兩種模型的病毒學(xué)及纖維化病理特點(diǎn)，為研究時選擇相關(guān)動物模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性C57BL/6野生型小鼠20只，C57BL/6 N-Tg (1.28 HBV)/Vst乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠10只，購自并飼養(yǎng)于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2014-0001】【SYXK(京)2014-0015】，體重(20 ± 5)g，自由飲食飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

rAAV8-1.3HBV 重組腺相關(guān)病毒，購自北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司。四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)，化學(xué)純；橄欖油，化學(xué)純，均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血清HBsAg、HBeAg檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，ELISA)，HBV-DNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，購自上?？迫A生物工程股份有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒(貨號：C009-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測試盒(貨號：C010-1)、堿性磷酸酶(AKP)測試盒(貨號：A059-1)、蘇木精-伊紅染液(貨號：D006)，均購自南京建成生物工程研究所；兔抗HBcAg多克隆抗體(貨號：ab140243)、小鼠抗HBsAg單克隆抗體(貨號：ab859)、兔鼠通用HRP/DAB二抗顯色試劑盒(貨號：ab64264)，均購自Abcam公司；羥脯氨酸(Hyp)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。Bio-Tek Power Wave XS微孔板分光光度計(jì)，購自美國Bio-Tek公司；石蠟脫水機(jī)、病理切片機(jī)購自德國徠卡公司；高倍顯微鏡購自日本奧林巴斯有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物造模與分組

將C57BL/6N野生型小鼠隨機(jī)分為野生型對照組(WT)、rAAV8-1.3HBV轉(zhuǎn)染組(rAAV)、CCl4組(CCl4)、rAAV8-1.3HBV轉(zhuǎn)染復(fù)合CCl4組(rAAV+CCl4)，將同周齡C57BL/6 N-Tg(1.28HBV)/Vst乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為HBV轉(zhuǎn)基因組(Tg)、HBV轉(zhuǎn)基因復(fù)合CCl4組(Tg+CCl4)。每組小鼠各設(shè)5只。rAAV8-1.3HBV轉(zhuǎn)染采用尾靜脈注射方式，實(shí)驗(yàn)首日注射1次，每只小鼠尾靜脈注射病毒載量為1E+10v.g.；CCl4以橄欖油稀釋至10%濃度，按照2 mL/kg小鼠體重腹腔注射造模，隔天1次。造模12周后麻醉處死小鼠，留取血清與肝組織。

1.2.2 血清HBV病毒學(xué)指標(biāo)測定

血清HBsAg、HBeAg采用ELISA試劑盒檢測，按照試劑盒說明書要求操作；血清HBV-DNA采用熒光探針PCR試劑盒檢測，UNG酶反應(yīng)50℃ 2 min，預(yù)變性94℃ 2 min， 變性94℃ 10 s 循環(huán)60次，退火、延伸及檢測熒光60℃ 30 s檢測通道：530 nm(FAM)。

1.2.3 血清肝功能測定

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，采用賴氏比色法試劑盒檢測；血清堿性磷酸酶(AKP)，采用金氏法試劑盒檢測，均按照試劑盒說明書要求操作。

1.2.4 肝組織Hyp含量測定

參照J(rèn)amall’s鹽酸水解法[3]，稱取100 mg肝組織放入50%鹽酸中105℃水解過夜。后取三層濾紙過濾水解液并吸取100 μL烘干處理。取Hyp標(biāo)準(zhǔn)品0.2 ～ 1.6 μg設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)氯胺T溶液0.2 mL，含25%對二甲基氨基苯甲醛和27.3%高氯酸的異丙醇溶液反應(yīng)，50℃水浴1 h， 558 nm測定吸收值。

1.2.5 肝組織病理

小鼠肝組織 4%甲醛浸泡固定、脫水后石蠟包埋切片；進(jìn)行HE染色后封片，顯微鏡(×200倍)觀察。天狼猩紅采用飽和苦味酸配制，顯微鏡(×100倍)觀察，利用Image-Pro Plus 6.0軟件對膠原面積作半定量分析。

1.2.6 肝組織免疫組織化學(xué)染色

肝組織脫蠟逐級復(fù)水，檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)，3%雙氧水去酶處理內(nèi)源性酶。5% BSA室溫30 min，滴加一抗4℃過夜。洗去一抗滴加二抗37℃ 1 h，洗去后滴加SABC鏈霉素10 min。DAB顯色后蘇木素染核封片。陽性區(qū)域總面積半定量分析采用Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩種復(fù)合模型小鼠血清病毒學(xué)指標(biāo)比較

結(jié)果顯示：除WT組、CCl4組外，其余組血清HBsAg、HBeAg均為陽性，兩種復(fù)合模型組相比，Tg+CCl4組血清HBsAg和HBeAg水平高于rAAV+CCl4組(P< 0.01、P< 0.05)(圖1A、1B)。PCR結(jié)果顯示，除WT組、CCl4組外，其余組別血清HBV-DNA載量均高于1.0×104IU/mL， rAAV組與rAAV+CCl4組HBV-DNA載量高于Tg組與Tg+CCl4組(P< 0.01、P< 0.05)(圖1C)。

注：**P< 0.01 vs WT;ΔΔP< 0.01 vs rAAV;▲P< 0.05，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4;n=5。圖1 小鼠血清乙肝病毒學(xué)檢測結(jié)果Note. **P<0.01 vs WT.ΔΔP<0.01 vs rAAV.▲P< 0.05，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4.n=5.Figure 1 Virological detection of HBV in the mouse serum

2.2 兩種復(fù)合模型小鼠肝組織免疫組化染色指標(biāo)比較

肝組織石蠟切片免疫組化結(jié)果顯示，WT組、CCl4組均未見HBsAg、HBcAg陽性表達(dá)，其余組別小鼠肝組織中HBsAg和HBcAg均可見不同程度陽性表達(dá)(圖2A)；通過圖片半定量分析后發(fā)現(xiàn)，rAAV組較Tg組HBsAg陽性表達(dá)面積明顯減少(P< 0.01)，而rAAV組較Tg組肝細(xì)胞核HBcAg陽性數(shù)量明顯增多(P< 0.01)；兩種復(fù)合模型組相比，HBsAg在肝組織中的表達(dá)未見明顯差異(P> 0.05)，但rAAV+CCl4組肝細(xì)胞核HBcAg陽性數(shù)量顯著高于Tg+CCl4組(P< 0.01)(圖2B、2C)。

注：**P< 0.01 vs WT，ΔΔP< 0.01 vs rAAV，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4，n=5。圖2 小鼠肝組織HBsAg、HBeAg免疫組化染色與半定量分析Note. **P< 0.01 vs WT，ΔΔP< 0.01 vs rAAV，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4，n=5.Figure 2 Immunohistochemical staining(A) and semi-quantitative analysis of HBsAg(B) and HBeAg(C) in the mouse liver tissues

2.3 兩種復(fù)合模型小鼠肝組織炎癥與纖維化生化學(xué)指標(biāo)的比較

血清生化檢測結(jié)果顯示(表1)，與WT組比較，CCl4復(fù)合造模12周后，CCl4組、Tg+CCl4組與rAAV+CCl4組血清ALT與AST水平均明顯上升(P< 0.01)，Tg組與rAAV組對比WT組沒有明顯變化(P> 0.05)。Tg組與rAAV組ALT水平具有差異(P< 0.01)。兩種復(fù)合模型組相比；Tg+CCl4組與rAAV+CCl4組ALT、AST水平均未見顯著差異(P> 0.05)；各組AKP水平均未見明顯差異(P> 0.05)。肝組織Hyp含量檢測結(jié)果顯示，與WT組比較，CCl4復(fù)合造模12周后，CCl4組、Tg+CCl4組與rAAV+CCl4組肝組織中Hyp含量均顯著升高(P< 0.01)，兩種復(fù)合模型組相比，Tg+CCl4組對比rAAV+CCl4組肝內(nèi)Hyp含量具有明顯差異(P< 0.01)。

表1 小鼠血清肝功能及肝組織羥脯胺酸含量的測定Table 1 Serum ALT, AST, AKP levels and Hyp levels in the mouse liver tissues

注：*P< 0.05，**P< 0.01vsWT，ΔΔP< 0.01vsrAAV，▲▲P< 0.01vsrAAV+CCl4，n=5。

Note.*P< 0.05，**P< 0.01vsWT，ΔΔP< 0.01vsrAAV，▲▲P< 0.01vsrAAV+CCl4，n=5.

2.4 兩種復(fù)合模型小鼠肝組織炎癥與纖維化病理特點(diǎn)的比較

HE染色結(jié)果顯示，WT組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞呈條索狀排列整齊，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，Tg組與rAAV組肝小葉排列整齊，僅可觀察到肝細(xì)胞核增大，其中rAAV組存在少量炎細(xì)胞浸潤，CCl4組、rAAV+CCl4組、Tg+CCl4組均出現(xiàn)大量肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)明顯氣球樣變和脂肪變，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤。天狼猩紅染色結(jié)果顯示，WT組肝組織未見明顯膠原沉積，Tg組和rAAV組匯管區(qū)及小葉間出現(xiàn)少量膠原沉積，呈細(xì)線狀，未見明顯的橋接和假小葉，CCl4組、rAAV+CCl4組、Tg+CCl4組肝組織出現(xiàn)明顯膠原纖維沉積，由匯管區(qū)向周圍延伸，形成纖維間隔，其中Tg+CCl4組可見到明顯的假小葉形成(圖3A)。通過膠原半定量分析后發(fā)現(xiàn)；Tg+CCl4組膠原含量高于rAAV+CCl4組(P< 0.01)(圖3B)。

注：**P< 0.01 vs WT，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4，n=5。圖3 肝組織病理HE、天狼猩紅染色與膠原半定量分析Note. **P< 0.01 vs WT，▲▲P< 0.01 vs rAAV+CCl4 ,n=5.Figure 3 Pathological changes (A) and semi-quantitative analysis of collagen content (B) in the mouse liver tissues

3 討論

目前乙肝動物模型主要為：麻鴨乙型肝炎模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型、樹鼩模型等[4-5]。其中以小鼠乙肝模型為主流[6-7]。小鼠乙肝模型又可分為轉(zhuǎn)基因型、高壓水動力注射型與腺病毒轉(zhuǎn)染[8]三種。其中利用肝衰竭小鼠移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells)的人源化模型可有效模擬人體乙肝肝硬化發(fā)病過程[9]，但是此類方法實(shí)驗(yàn)難度較高且成本較為昂貴。近年來，有研究者使用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)合CCl4模型觀察慢性乙肝肝纖維化過程中自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells，NKT cells)的變化[10]。構(gòu)建慢性乙肝肝纖維化動物模型需具備兩個基本要素：首先是HBV基因的高水平表達(dá)，其次具有長期性的HBV感染及相應(yīng)的纖維化的病理特征。rAAV采用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關(guān)病毒，依其對于肝親嗜性特點(diǎn)，將HBV基因組高效導(dǎo)入肝細(xì)胞中[11]。HBV-Tg轉(zhuǎn)基因小鼠則是1.28拷貝HBV病毒基因片段或全基因組導(dǎo)入小鼠單細(xì)胞受精卵的雄原核，再植入母體使其發(fā)育[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明[13]，單純HBV-Tg小鼠在36周以上才會出現(xiàn)較為明顯的自發(fā)性病理炎癥和轉(zhuǎn)氨酶升高。通過CCl4復(fù)合造?？梢赃M(jìn)一步縮短成模時間。CCl4模型在與肝纖維化發(fā)展相關(guān)的組織學(xué)、生化學(xué)、細(xì)胞和分子變化方面具有明顯特點(diǎn)，通過誘導(dǎo)肝內(nèi)III區(qū)壞死和肝細(xì)胞凋亡，使肝星狀細(xì)胞活化導(dǎo)致纖維化產(chǎn)生[14-15]。

合理地選用小鼠慢性乙肝模型可以有效解決HBV在病毒感染、復(fù)制、免疫應(yīng)答和藥物評價方面的難題。本研究發(fā)現(xiàn)：Tg組與rAAV組在聯(lián)合CCl4染毒12周后能夠穩(wěn)定成模。兩者血清生化學(xué)差異并不明顯，其差異主要體現(xiàn)在病毒學(xué)標(biāo)志物方面。HBV-DNA結(jié)果可以看到：由于rAAV本身具有劇烈嗜肝性，注射機(jī)體后破壞肝細(xì)胞使大量HBV-DNA釋放入血，并且肝組織中HBcAg大面積表達(dá)是其典型特征。而HBV-Tg病毒主要依靠小鼠不斷表達(dá)HBV蛋白并且在肝中產(chǎn)生病毒顆粒[16]，HBV-DNA的復(fù)制則相對緩慢。rAAV8注射后，機(jī)體自身免疫應(yīng)答升高，血清中出現(xiàn)Anti-HBs，血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生，部分HBsAg被清除[17-18]，導(dǎo)致血清與肝組織中HBsAg和HBeAg水平較HBV-Tg組偏低。纖維化進(jìn)展方面；Tg+CCl4組則更為明顯，其原因和自然殺傷T細(xì)胞加速并釋放細(xì)胞因子IL-4和IL-13導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化有關(guān)[19]。

綜上所述，rAAV與HBV-Tg在建立慢性乙肝模型上具有一定優(yōu)勢，但是同時也存在一些局限性。首先兩者無法有效在體內(nèi)合成共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)。并且由于CCl4造成的脂質(zhì)過氧化損傷后部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生壞死，導(dǎo)致HBV的復(fù)制存在一定抑制[20]，但rAAV+CCl4組與Tg+CCl4組病毒學(xué)指標(biāo)仍要高于WT組。本次實(shí)驗(yàn)rAAV注射劑量為每只1E+10v.g.，增加病毒載量至5E+12v.g.時成模效率可能更高，并且rAAV由于其存在嗜肝性，需要一定的尾靜脈注射技巧，處理不當(dāng)可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)人員發(fā)生感染風(fēng)險。而HBV-Tg相對風(fēng)險性較小并且價格相對低廉。綜上所述，本研究兩種模型可以給慢性乙肝纖維化的藥物評價提供一定思路和借鑒。如需探討乙肝纖維化免疫機(jī)制等其他問題，則有待進(jìn)一步研究挖掘。