彭孟云，陳然，朱曉寧，汪靜*

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽病科，四川 瀘州 646000； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指各種致病因子長(zhǎng)期反復(fù)刺激肝，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積于肝的一種慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，是導(dǎo)致肝硬化、肝癌等終末期肝病的主要原因[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β1被認(rèn)為是HSCs激活過(guò)程中最重要的因子，在肝纖維化形成中發(fā)揮重要作用，Smad 蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)是TGF-β1 信號(hào)傳至核內(nèi)關(guān)鍵的下游信號(hào)分子， TGF-β1通過(guò)激活下游介質(zhì)Smad2和Smad3發(fā)揮其促肝纖維化的作用，研究表明四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中Smad2/3表達(dá)明顯升高[2]。而Smad7作為TGF-β1/Smad信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，主要通過(guò)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)性抑制中斷TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以抑制肝纖維化進(jìn)展，敲除Smad7基因可促進(jìn)小鼠肝纖維化的發(fā)生[3]，表明TGF-β1/Smad 信號(hào)通路及相關(guān)的細(xì)胞因子在肝纖維化中發(fā)揮重要作用。

中醫(yī)并無(wú)“肝纖維化”這一病名，常將其隸屬“積聚”范疇。全國(guó)名中醫(yī)孫同郊教授根據(jù)數(shù)十年治療肝纖維化的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為氣虛血瘀是本病的基本病機(jī)，以補(bǔ)氣扶正、活血化瘀為基本治療，在此基礎(chǔ)上自擬了具有益氣活血化瘀功效的的參仁活血顆粒用于治療肝纖維化，臨床療效顯著。本研究采用參仁活血顆粒治療肝纖維化大鼠，觀察參仁活血顆粒對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1/Smad信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，探討參仁活血顆粒治療肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體重(200 ± 20) g，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(川) 2018-065】，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(川) 2018-065】，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。大鼠均分籠飼養(yǎng)，每籠5只，光照與黑暗各12 h交替處理，濕度為50% ～ 60%，溫度為20 ～ 22°C，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

參仁活血顆粒由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備(規(guī)格：10 g/袋，批號(hào)：20150814)；四氯化碳(批號(hào):2016062301)購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；TGF-β1抗體、Smad3抗體、Smad7抗體、CollagenⅠ抗體及Collagen Ⅲ抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；總RNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)自日本Toyobo公司；RIPA裂解液(強(qiáng))及PMSF購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要設(shè)備與儀器

超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR擴(kuò)增儀、全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、凝膠掃描成像系統(tǒng)及熒光化學(xué)發(fā)光圖像分析儀均來(lái)自美國(guó)Bio-Bod公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為參仁活血顆粒低劑量組、參仁活血顆粒中劑量組、參仁活血顆粒高劑量組、正常組及模型組，每組10只，均予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，均正常自由活動(dòng)和飲用自來(lái)水。正常組腹腔注射生理鹽水1 mL/kg，2次/周，共8周；模型對(duì)照組及中藥各組均給予40%四氯化碳0.2 mL/100 g，腹腔注射，2次/周，共8周。于第4周開(kāi)始分別給予參仁活血顆粒低[每日1.575 g/(kg·bw)]、中[每日3.15 g/(kg·bw)]、高 [每日6.3 g/(kg·bw)) 劑量灌胃，于第8周犧牲。

1.2.2 肝病理學(xué)與免疫組化觀察

取新鮮肝固定脫水包埋后切片，HE染色及Masson染色觀察大鼠肝纖維化程度。免疫組化檢測(cè)大鼠肝TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ的表達(dá)。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA的表達(dá)

引物由上海生工生物公司合成，TGF-β1(120 bp)上游5’ATTCCTGGCGTTACCTTGG3’，下游5’AGCCCTGTATTCCGTCTC CT3’；Smad3(110 bp)上游5’GAGACATTCCACGCTTCACA3’，下游5’GCTGCATTCCGGTTAACATT3’；Smad7(128 bp)上游5’GTGGC ATACTGGGAGGAGAA3’，下游5’TTGTTGTCCGAATTGAGCTG3’； β-actin(150 bp)上游5’CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，下游5’TTT AATGTCACGCACGATTTC3’。提取肝組織RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)條件：95℃ 15 s(變性)、55℃ 10 s(退火)、72℃ 20 s(延伸)，循環(huán)40次，目的基因的表達(dá)量使用2-△△ct法計(jì)算。

1.2.4 Western blot檢測(cè)大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)

100 mg的肝組織加入900 μL配置好的RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白熱變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h, TBST搖洗膜，加入稀釋好的一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，稀釋好的二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜，于PVDF膜正面加適量HRP substrate顯影液，在BioRad GelDocXR儀器上進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，利用Gel-Pro Analyzer 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色及Masson染色觀察大鼠肝病理改變

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)細(xì)胞壞死。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞排列錯(cuò)亂，存在不同程度的小葉內(nèi)壞死、碎屑樣壞死及橋接壞死，大量膠原沉積，假小葉形成。參仁活血顆粒低、中劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)分別呈中-重度、輕-中度破壞，肝細(xì)胞排列不整齊，存在不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞壞死，纖維結(jié)締組織增生，其中低劑量組膠原較多沉積，中劑量組膠原沉積較前減少。而高劑量組可見(jiàn)部分接近正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，少量纖維結(jié)締組織增生，纖維化程度較模型組明顯改善。(圖1、圖2)。

2.2 各組大鼠肝TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ的表達(dá)

正常組大鼠肝TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ無(wú)陽(yáng)性表達(dá)意義，模型組大鼠肝collagenⅠ、collagen Ⅲ及TGF-β1較正常組顯著表達(dá)，而參仁活血顆粒各劑量TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ表達(dá)均較模型組降低，且表達(dá)程度與劑量呈負(fù)相關(guān)，以參仁活血顆粒高劑量組療效最顯著(圖3、圖4、圖5)。

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥低劑量組；D 中藥中劑量組；E 中藥高劑量組。(下圖同)圖1 各組大鼠肝HE染色Note. A. Control group. B. Model group. C. Low-dose SRHX group. D. Middle-dose SRHX group. E. High-dose SRHX group.(The same in the following figures)Figure 1 Pathological changes in liver tissues of the rats in each group(HE staining)

圖2 各組大鼠肝Masson染色Figure 2 Liver fibrosis in the rats of different groups(Masson staining)

圖3 各組大鼠肝collagenⅠ的表達(dá)Figure 3 Expression of collagenⅠin liver tissues of the rats in each group

圖4 各組大鼠肝collagenⅢ的表達(dá)Figure 4 Expression of collagen Ⅲ in liver tissues of the rats in each group

圖5 各組大鼠肝TGF-β1的表達(dá)Figure 5 Expression of TGF-β1 in liver tissues of the rats in each group

2.3 各組大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)

與正常組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)明顯升高而Smad7 mRNA的表達(dá)明顯降低(P< 0.05)；參仁活血顆粒各劑量組TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)較模型組均不同程度降低，以高劑量組效果最佳(P< 0.05)。而參仁活血顆粒各劑量組Smad7 mRNA的表達(dá)較模型組明顯升高，呈現(xiàn)出與劑量成正相關(guān)的上調(diào)趨勢(shì)，以高劑量組表達(dá)升高最為顯著(P< 0.05)。(見(jiàn)圖6)

注：與正常組比較,ΔP< 0.05。與模型組比較，*P< 0.05。處理間比較，°P> 0.05。處理間比較，■P< 0.05。(下圖同)圖6 各組大鼠肝TGF-β1、Smad 3、Smad 7 mRNA表達(dá)水平Note. Compared with the normal group, ΔP< 0.05. Compared with the model group, *P< 0.05. Compared between treatments, °P> 0.05. Compared between treatments, ■P< 0.05.(The same in the following figure)Figure 6 Expression of TGF-β1, Smad 3 and Smad 7 mRNA in liver tissues of the rats in each group

2.4 各組大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)

與正常組相比，模型組大鼠肝組織中TGF-β1 蛋白的表達(dá)明顯增加(P< 0.05)，與模型組相比，參仁活血顆粒各劑量組大鼠肝組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)減少(P< 0.05)，但參仁活血顆粒高、中、低劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。與正常組相比，模型組大鼠肝組織中Smad3 蛋白的表達(dá)明顯升高而Smad7 蛋白的表達(dá)顯著下降(P< 0.05)；參仁活血顆粒各劑量組大鼠肝組織中Smad3 蛋白的表達(dá)較模型組降低而Smad7 蛋白的表達(dá)較模型組明顯升高，以參仁活血顆粒高劑量組療效最佳(P< 0.05)。(見(jiàn)圖7)

圖7 各組大鼠肝TGF-β1、Smad 3、Smad 7蛋白表達(dá)Figure 7 Expression of TGF-β1, Smad 3 and Smad 7 proteins in liver tissues of the rats

3 討論

肝纖維化是肝對(duì)各種慢性損傷如肝炎、自身免疫反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、代謝綜合征和炎癥等的修復(fù)反應(yīng)，以富含I型膠原的ECM在肝內(nèi)大量合成并沉積為其主要特征，而ECM主要來(lái)源于肝星狀細(xì)胞的激活[4-5]。在各種肝損傷致病因素或血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、TGF-β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素1(interleukin，IL-1)等炎癥細(xì)胞因子的刺激下，HSCs激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6-7]，導(dǎo)致大量collagen I、collagen III和纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸等ECM成分的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致肝纖維化，其中collagen I的沉積量與肝纖維化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究采用CCl4成功構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，模型組大鼠存在大量膠原沉積，纖維間隔增多增寬，假小葉形成，collagen I及collagen III蛋白表達(dá)明顯升高，而經(jīng)參仁活血顆粒治療后，肝膠原沉積減少，肝炎癥及纖維化程度明顯降低，collagen I、collagen III蛋白的表達(dá)較模型組明顯降低，以高劑量組療效最佳，表明參仁活血顆粒具有治療大鼠肝纖維化的作用。

TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的致肝纖維化的細(xì)胞因子[8]，正常情況下肝TGF-β1 的表達(dá)極少，而肝損傷時(shí)其表達(dá)明顯增加。Smad作為TGF-β1信號(hào)傳遞的關(guān)鍵下游蛋白，將細(xì)胞外信號(hào)傳至核內(nèi)，調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮TGF-β1的生物效應(yīng)[9]。TGF-β1先后與TβR II、TβR I結(jié)合，激活TβR II磷酸化激酶，TβR I隨之磷酸化活化，活化的TβRⅠ催化其下游信號(hào)分子Smad2/3蛋白磷酸化，活化的Smad2/3 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，與Smad 4結(jié)合形成異源寡聚物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，增加金屬蛋白酶組織抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)及膠原纖維等的表達(dá)，從而激活HSCs[10]；Smad7對(duì)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)調(diào)控作用，通過(guò)同Smad2/3與Smad4競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合TβR I從而有效阻斷TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗纖維化的作用。經(jīng)BMP-7 轉(zhuǎn)染日本血吸蟲(chóng)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，α-SMA、TGF-β1、Smad2、及Smad3的表達(dá)均降低，而Smad7的表達(dá)明顯升高[11]。Smad3基因敲除小鼠肝纖維化相關(guān)因子、膠原蛋白表達(dá)明顯下降，Smad7表達(dá)則呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[12]。Smad7基因敲除大鼠的HSCs數(shù)目增多，ECM大量沉積，而Smad7蛋白表達(dá)增加可以抑制HSC增殖及Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，抑制肝纖維化的進(jìn)展[3,13-14]。因此，TGF-β1/Smad信號(hào)通路在大鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，抑制該信號(hào)通路及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)可能成為治療肝纖維化的關(guān)鍵點(diǎn)。

中醫(yī)藥在防治肝纖維化的發(fā)生發(fā)展方面取得了一些重要進(jìn)展。Yang等[15]采用復(fù)方鱉甲軟肝片治療CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠，結(jié)果顯示該藥物能有效抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活，從而達(dá)到治療肝纖維化的目的。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)由冬蟲(chóng)夏草菌絲體多糖(CS-PS)，絞股藍(lán)總皂苷和苦杏仁苷組成CGA中藥配方能顯著改善DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，其作用機(jī)制可能與CGA中藥配方能顯著降低DMN誘導(dǎo)的纖維化肝組織中α-SMA、TGF-β1、TβRI、p-TβRI、p-TβRII、p-Smad2和p-Smad3蛋白質(zhì)表達(dá)水平相關(guān)。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)扶正化瘀方能顯著降低MCD構(gòu)建的脂肪性肝炎纖維化小鼠TGF-β1，Smad3和Smad4的表達(dá)，并進(jìn)一步上調(diào)Smad7的表達(dá)，其機(jī)制可能與扶正化瘀方抑制TGF-β1/Smad通路中涉及的細(xì)胞因子的表達(dá)從而中斷肝纖維發(fā)生中的正反饋環(huán)相關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參仁活血顆粒能顯著降低肝纖維大鼠肝TGF-β1及Smad3的表達(dá)，上調(diào)Smad7的表達(dá)，說(shuō)明TGF-β1/Smad信號(hào)通路是參仁活血顆粒治療肝纖維的作用機(jī)制之一。進(jìn)一步分析研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)參仁活血顆粒中、高劑量組之間TGF-β1、Smad7 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，而兩組之間Smad7蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。這可能是由于DNA中遺傳信息的表達(dá)必須經(jīng)過(guò)中介產(chǎn)物，即轉(zhuǎn)移到mRNA上，才被用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的生物合成，而mRNA將遺傳信息轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，需經(jīng)形成起始物、活化氨基酸、合成肽鏈的起始部分、肽鏈的延伸和終止、蛋白質(zhì)的加工多個(gè)步驟最終才能完成蛋白質(zhì)的合成，若此過(guò)程中任一條件受干擾均可影響蛋白的合成，導(dǎo)致蛋白合成受阻所致。通過(guò)本次研究，可得出結(jié)論：參仁活血顆粒具有顯著的抗肝纖維化的療效，其機(jī)制可能與參仁活血顆粒抑制TGF-β1、Smad3的表達(dá)，上調(diào)Smad7的表達(dá)，抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路激活，減少HSCs的生成，從而減少collagenⅠ及collagen Ⅲ等細(xì)胞外基質(zhì)的合成相關(guān)。