王雪飛 ， 任洪艷 *，阮文權(quán) ， 徐 倩

（1.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省厭氧生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫214122）

微藻細胞富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖等，在食品、醫(yī)藥以及化工等方面應(yīng)用越來越廣泛[1-4]。螺旋藻是一種多細胞絲狀藍藻（Blue Green Algae），又稱藍細菌（Cyanobacteria），是微藻培養(yǎng)的典型藻種，具有生長速度快、不易被污染、營養(yǎng)物質(zhì)豐富等特點[5]。

限制微藻大規(guī)模工業(yè)化利用的主要因素是藻產(chǎn)品成本較高，尤其是在微藻培養(yǎng)和采收方面[6-7]。微藻培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)鹽成本占微藻培養(yǎng)成本比重很大，其中碳源、氮源及磷源成本占微藻培養(yǎng)總成本的20%～30%[8]；同時，微藻培養(yǎng)需要消耗大量的水資源。此外，藻細胞的采收問題也是限制微藻技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用的瓶頸之一。采收過程中存在微藻生物量偏低、藻水分離難度大、藻細胞不易收獲等技術(shù)問題[9]，這與微藻細胞微小、帶負電荷、在水中處于穩(wěn)定的懸浮狀態(tài)、很難通過重力沉降實現(xiàn)固液分離[10]有關(guān)。因此，降低微藻培養(yǎng)過程中營養(yǎng)鹽和水資源消耗，尋求高效率的微藻分離采收技術(shù)是當前亟需解決的問題。

目前微藻培養(yǎng)系統(tǒng)的兩種主要類型是開放式跑道池和封閉式光生物反應(yīng)器（photobioreactor，PBR）[11]。傳統(tǒng)的PBR沒有固液分離功能，反應(yīng)器中的水力停留時間 （hydraulic retention time，HRT）和微藻停留時間（microalgae retention time，MRT）是相同的，獲得的生物質(zhì)濃度較低，給后續(xù)采收過程帶來很大的難度。為解決這個問題，可在膜光生物反應(yīng)器（membrane photobioreactor，MPBR）模式下培養(yǎng)微藻。MPBR是微藻培養(yǎng)和采收的一種全新的方法，它將光生物反應(yīng)器同過濾器相耦合，進而將HRT和MRT分開，實現(xiàn)固液分離[12]。且膜過濾操作簡單，在微藻培養(yǎng)和采收方面的應(yīng)用越來越多，Su[13]等人在MPBR中利用電廠污水培養(yǎng)柵藻；Bilad[14]等人利用浸沒式微濾膜采收微藻生物質(zhì)；同時MPBR中過濾液可以再循環(huán)用作微藻培養(yǎng)液[15]。此外通過膜的過濾作用，提高藻產(chǎn)品生物量濃度，在采收過程中無需使用助凝劑和絮凝劑等化學(xué)藥品。

作者選取鈍頂螺旋藻作為培養(yǎng)對象，在PBR和MPBR中進行培養(yǎng)和預(yù)采收，考察不同初始藻密度和稀釋率下螺旋藻的生長及其對營養(yǎng)鹽消耗利用情況，比較得出MPBR在提高藻產(chǎn)品質(zhì)量濃度，節(jié)約水資源，節(jié)約營養(yǎng)鹽等方面的有效性，為規(guī)?；呙芏扰囵B(yǎng)和預(yù)采收微藻提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藻種：采用鈍頂螺旋藻，編號FACHB-901，購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫。

培養(yǎng)基：采用的改良的Zarrouk培養(yǎng)基配方[16]，見表 1、表 2。

表1 改良的Zarrouk培養(yǎng)基Table 1 Modified Zarrouk medium

表2 微量元素儲備液A5Table 2 Trace element stock solution A5

1.2 實驗裝置

采用光生物反應(yīng)器（PBR）作為鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)容器，實驗裝置見圖1。反應(yīng)器為中空柱體，由有機玻璃制成，壁厚6 mm，內(nèi)徑144 mm，總高575 mm，有效容積為7.4 L，微藻培養(yǎng)時放置于GXZ-380B光照培養(yǎng)箱中。

膜光生物反應(yīng)器（MPBR）實驗裝置見圖2。膜組件為PVDF微濾膜，孔徑1 μm，膜面積為0.025 m2。將膜組件放入過濾槽中，一端與蠕動泵相連，對藻液進行抽濾、濃縮。

1.3 實驗設(shè)置

考察鈍頂螺旋藻在PBR中生物量的變化，將培養(yǎng)至對數(shù)期的藻種接入PBR中，使其初始光密度值約為 0.5，于光強 3 000 Lux、溫度（30±1） ℃、光周期16/8（day/night）條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間利用空氣泵以曝氣的方式向PBR中不間斷通入空氣，氣速為1.63 L/min，氣體流量采用轉(zhuǎn)子流量計控制。每天測培養(yǎng)初始和結(jié)束時測定硝態(tài)氮、磷酸鹽和溶解性無機碳濃度等指標，初步確定微藻在PBR中生物量變化和營養(yǎng)鹽消耗情況，為后期實驗選取合適的生物量進行培養(yǎng)和采收提供參考。實驗設(shè)置3組平行樣，結(jié)果取平均值。

圖1 光生物反應(yīng)器實驗裝置Fig.1 Schematic illustration of PBR

圖2 膜光生物反應(yīng)器實驗裝置Fig.2 Schematic illustration of MPBR

考察PBR中不同稀釋率和生物量對鈍頂螺旋藻生長和預(yù)采收的影響，根據(jù)初步確定的鈍頂螺旋藻在PBR中生物量的變化情況，選擇不同生長時期的螺旋藻進行研究。實驗采用半連續(xù)操作，稀釋率分別選取D＝0.05、0.08、0.10、0.13 d-1。每天采收一定體積的藻液作為藻產(chǎn)品，同時加入相同體積的Zarrouk培養(yǎng)基，維持PBR中藻液體積不變，不同稀釋率下每天采收藻液和補加Zarrouk培養(yǎng)基的體積見表3。每天測定采收藻產(chǎn)品的OD560值。光強、溫度等培養(yǎng)條件同上。實驗設(shè)置3組平行樣，結(jié)果取平均值。

表3 不同稀釋率下PBR中每天采收藻液和補加Zarrouk培養(yǎng)基的體積Table 3 Volumes of harvesting algae suspension and Zarrouk medium during different dilution rates in PBR every day

考察利用MPBR培養(yǎng)和預(yù)采收鈍頂螺旋藻，根據(jù)PBR實驗結(jié)果，選擇合適的生物量進行實驗。將膜組件安裝在過濾槽中，利用蠕動泵將反應(yīng)器中藻液抽至過濾槽中，通過膜組件對其進行過濾濃縮。蠕動泵轉(zhuǎn)速設(shè)置為100 r/min，每5分鐘測量抽得的過濾液體積，過濾槽中濃藻液體積，計算膜通量和體積濃縮系數(shù)，確定一定藻質(zhì)量濃度下適宜的體積濃縮系數(shù)。MPBR不同稀釋率對螺旋藻生長和預(yù)采收的影響實驗中，采用半連續(xù)操作，稀釋率分別選取D＝0.08、0.10、0.13 d-1。 通過膜組件的過濾作用，實現(xiàn)藻液濃縮得到藻產(chǎn)品，同時將過濾液循環(huán)至光生物反應(yīng)器中重復(fù)利用。每天對藻產(chǎn)品進行采收，同時利用一定體積的去離子水代替Zarrouk培養(yǎng)基補加至光生物反應(yīng)器中，維持反應(yīng)器中藻液體積不變，不同稀釋率下每天采收藻液、過濾液，藻產(chǎn)品和補加去離子水的體積見表4。每天測定反應(yīng)器中藻液、藻產(chǎn)品OD560值，計算得生物量質(zhì)量濃度；培養(yǎng)初始每天取藻液30 mL，測定培養(yǎng)初始和結(jié)束時反應(yīng)器中藻液pH值、硝態(tài)氮和磷酸鹽濃度。光強、溫度等培養(yǎng)條件同上。 實驗設(shè)置3組平行樣，結(jié)果取平均值。

1.4 指標測定及計算方法

生物量質(zhì)量濃度：通過已知干質(zhì)量鈍頂螺旋藻液在560 nm下的光密度值，做生物量質(zhì)量濃度與OD560的相關(guān)性曲線，通過每天測定螺旋藻液OD560，計算生物量質(zhì)量濃度[17]。

pH值：使用Delta 320型數(shù)字式酸度計（Mettler-Toledo，德國）測定。

硝態(tài)氮質(zhì)量濃度：采用紫外分光光度法測定[18]。

磷酸鹽質(zhì)量濃度：采用鉬銻抗分光光度法測定[18]。

表4 不同稀釋率下MPBR中每天采收藻液、獲得過濾液，藻產(chǎn)品體積和補加去離子水的體積Table 4 Volumes ofharvesting algae suspension，penetrant，algae product and added deionized water every day during different dilution rates in MPBR

溶解性無機碳濃度：采用酸堿指示劑滴定法[19]。

稀釋率：每天加入至反應(yīng)器中Zarrouk培養(yǎng)基的體積與反應(yīng)器中培養(yǎng)基總體積之比即為稀釋率（dilution rate，D），計算公式：

式中：D為稀釋率（d-1）；Vin為PBR中每天加入新鮮Zarrouk培養(yǎng)基的體積 （L/d）；V為PBR中培養(yǎng)基總體積（7.4 L）。

膜通量：

式中：J為膜通量（L/（m2·min））；Q為流量（L/min）；A為膜表面積（m2）。

體積濃縮系數(shù)：

式中：υ為體積濃縮系數(shù)；Fin為加入至過濾槽中藻液體積（L）；Fretentate為過濾槽中剩余藻液體積（L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBR中鈍頂螺旋藻的生長情況

考察鈍頂螺旋藻在PBR中的生物量變化，結(jié)果見圖3（a）。隨著培養(yǎng)時間的進行，藻密度逐漸增大，第1～10天螺旋藻生長較快，生物量達到1.837 g/L；培養(yǎng)至第16天，生物量穩(wěn)定在2.122 g/L左右；從3（b）中可以看出，隨著螺旋藻的生長，pH值從初始9.14升高至9.88，在螺旋藻生長的適合范圍內(nèi)[20]。為維持PBR中適宜的藻濃度，保證較高生物量質(zhì)量濃度下螺旋藻的快速生長，提高生物量產(chǎn)率，同時避免PBR中藻質(zhì)量濃度太高而產(chǎn)生光遮蔽現(xiàn)象，根據(jù)生長曲線知，螺旋藻在第7～10天生長較快，生物量較高，所以選擇螺旋藻生物量質(zhì)量濃度在1.5～1.8 g/L范圍內(nèi)進行后續(xù)實驗。

圖3 鈍頂螺旋藻在PBR中生物量和pH變化Fig.3 Changes of Spirulina platensis biomass concentration and pH in PBR

分析培養(yǎng)始末培養(yǎng)液的營養(yǎng)鹽濃度，結(jié)果見表5。經(jīng)過16 d的培養(yǎng)，HCO3-和NO3--N濃度明顯減小，分別減少了83.13 mmol/L和124.34 mg/L，表明藻類利用HCO3-和NO3--N作為生長的碳源和氮源；CO32-濃度從初始30.60 mmol/L升高至77.75 mmol/L；培養(yǎng)過程中HCO3-濃度減少，CO32-濃度升高的原因是在水溶液中無機碳以 CO2、HCO3-、CO32-這3種碳源形式存在，三者存在相互轉(zhuǎn)化的動態(tài)平衡：

Zarrouk培養(yǎng)基中采用碳酸氫鈉作為無機碳源，主要以HCO3-形式存在，此時微藻同化來自HCO3-中的CO2，當CO2被利用后，再不斷從HCO3-中重新釋出CO2，使得上述平衡向左移動[20]。PO43--P濃度變化不大，分析磷源利用較少的原因可能是需要磷元素參與合成的核酸，ATP等含磷化合物在藻細胞中的含量較低[8]。同時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)結(jié)束時培養(yǎng)液中仍有一定濃度的HCO3-，NO3--N以及PO43--P剩余，表明初始添加量完全可以滿足藻體的生長需要，因此基于成本考慮，可適當減少Zarrouk培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽濃度。

2.2 PBR中不同稀釋率和生物量質(zhì)量濃度對鈍頂螺旋藻生長和采收的影響

當PBR中螺旋藻生物量質(zhì)量濃度達到1.540 g/L時，進行不同稀釋率對螺旋藻生長和采收的影響實驗，結(jié)果見圖 4。當D＝0.05 d-1和D＝0.08 d-1時，PBR中螺旋藻生物量能夠保持穩(wěn)定，即采收一定藻液后，一天時間內(nèi)PBR中螺旋藻生物量質(zhì)量濃度能夠恢復(fù)到初始值1.540 g/L左右；當稀釋率增大到0.10 d-1時，PBR中生物量質(zhì)量濃度開始出現(xiàn)下降；當D＝0.13 d-1時，藻產(chǎn)品生物量質(zhì)量濃度明顯下降，至1.270 g/L，PBR中出現(xiàn)明顯的沖刷現(xiàn)象，表明在一定時間內(nèi)，采收的生物量大于反應(yīng)器中微藻的增殖量，導(dǎo)致反應(yīng)器中生物量質(zhì)量濃度不斷降低，無法穩(wěn)定運行。據(jù)此得到螺旋藻初始生物量質(zhì)量濃度為1.540 g/L，最佳稀釋率為0.08 d-1。

表5 培養(yǎng)初始和結(jié)束時營養(yǎng)鹽濃度變化Table 5 Changes of nutrient concentrations in medium at the initial and final of cultivation

為進一步增加螺旋藻的生物量產(chǎn)率，考察PBR中螺旋藻生物量質(zhì)量濃度為1.802 g/L時稀釋率為D＝0.05、0.08、0.10、0.13 d-1時的螺旋藻的生長情況，結(jié)果見圖 4。 當D＝0.05 d-1和D＝0.08 d-1時，PBR 中螺旋藻的生物量質(zhì)量濃度能夠穩(wěn)定在1.8 g/L左右，表明此時較高的藻質(zhì)量濃度下，并未產(chǎn)生明顯的光遮蔽而影響螺旋藻生長速率；當D增大到0.10 d-1和0.13 d-1時，PBR中生物量質(zhì)量濃度逐漸下降，出現(xiàn)沖刷現(xiàn)象，導(dǎo)致反應(yīng)器中生物量質(zhì)量濃度不斷降低。因此，螺旋藻初始生物量質(zhì)量濃度為1.802 g/L時，PBR的最佳稀釋率為0.08 d-1。為提高螺旋藻的采收量，選擇螺旋藻初始生物量質(zhì)量濃度為1.8 g/L左右進行后續(xù)MPBR的相關(guān)實驗。

2.3 MPBR中培養(yǎng)和預(yù)采收鈍頂螺旋藻

2.3.1 體積濃縮系數(shù)的確定MPBR中利用膜組件對藻液進行過濾，濃縮時，增大藻液的體積濃縮系數(shù)可提高藻產(chǎn)品生物量濃度，但體積濃縮系數(shù)太高會加重膜污染，因此需選擇合適的體積濃縮系數(shù)。藻液質(zhì)量濃度為1.855 g/L時，于過濾槽中進行實驗，結(jié)果見圖5。隨著體積濃縮系數(shù)的增大，藻液質(zhì)量濃度變大，膜通量逐漸降低；第30分鐘時藻液體積濃縮系數(shù)達到2.082，此時膜通量由初始值3.803 L/（m2·min） 下 降 至 2.970 L/（m2·min）， 下 降 了21.92%。在膜組件使用過程中，為保持較高的膜通量水平，提高膜的使用壽命，防止膜污染加重對膜造成損壞以及增加運行成本，在一定壓力下，當膜通量下降20%左右時，需進行膜清洗[22]。因此，利用PVDF膜組件過濾，濃縮生物量質(zhì)量濃度約為1.8 g/L的藻液時，體積濃縮系數(shù)最大為2，可最大程度濃縮藻液。

圖4 初始生物量質(zhì)量濃度為1.540 g/L和1.802 g/L時藻產(chǎn)品生物量質(zhì)量濃度隨稀釋率的變化Fig.4 Changes of algae product biomass concentration during different dilution rates with 1.540 g/L and 1.802 g/L initial biomass concentrations

圖5 膜通量和藻液體積濃縮系數(shù)的變化Fig.5 Changesofmembraneflux and volumetric concentration factor

2.3.2 MPBR中不同稀釋率對鈍頂螺旋藻生長和預(yù)采收的影響選擇體積濃縮系數(shù)為2，初始藻液質(zhì)量濃度為1.828 g/L進行MPBR中不同稀釋率對螺旋藻生長和預(yù)采收的實驗研究。不同稀釋率下鈍頂螺旋藻生物量質(zhì)量濃度和pH變化見圖6。從圖6（a）可以看出，D＝0.08 d-1時反應(yīng)器中螺旋藻生物量質(zhì)量濃度穩(wěn)定在1.820 g/L左右；D＝0.10 d-1時生物量質(zhì)量濃度開始下降，開始出現(xiàn)沖刷現(xiàn)象；當D增大到0.13 d-1時生物量質(zhì)量濃度持續(xù)下降，出現(xiàn)了明顯的沖刷現(xiàn)象，導(dǎo)致反應(yīng)器中生物量質(zhì)量濃度不斷降低。因此，確定MPBR的最佳稀釋率為0.08 d-1。此外，膜組件的過濾作用使藻產(chǎn)品生物量質(zhì)量濃度明顯提高，最高可達3.319 g/L。本實驗中體積濃縮系數(shù)約為2，與Bilad[15]文獻報道中體積濃縮系數(shù)為4.4有一定差異，可能與膜組件，藻種等條件有關(guān)。因此，為進一步增大體積濃縮系數(shù)，后期長期連續(xù)實驗中考慮改進過濾槽結(jié)構(gòu)，合理選擇膜組件材質(zhì)、孔徑、結(jié)構(gòu)等條件；同時進行減緩膜污染的相關(guān)研究，提高膜的使用壽命，進而明顯減少后續(xù)采收過程的能耗和成本。培養(yǎng)過程中MPBR中藻液pH變化見圖6（b）。螺旋藻生長過程中pH不斷上升，波動范圍為9.4～9.8，與圖2（b）中pH變化趨勢相似，均在螺旋藻生長的適合范圍內(nèi)[20]。

在培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)液中的氮磷進行了監(jiān)測，氮磷質(zhì)量濃度變化見圖7。研究發(fā)現(xiàn)，氮磷質(zhì)量濃度均隨著培養(yǎng)時間的進行而下降，分別從初始的297.338、75.945 mg/L 分別減少至 198.908、55.105 mg/L。分析原因可能有兩個：一是螺旋藻對營養(yǎng)鹽的吸收利用作用；二是因為每天采收一定體積的藻液，同時加入去離子水，其稀釋作用使得培養(yǎng)液中離子濃度不斷下降。在第7天實驗結(jié)束時，培養(yǎng)液中均剩余一定量氮磷營養(yǎng)鹽，pH值也在螺旋藻生長的適合范圍內(nèi)，表明實驗中培養(yǎng)液中氮磷質(zhì)量濃度能夠滿足螺旋藻的生長需求，加入的去離子水并未對螺旋藻的生長產(chǎn)生不良影響。由此可見，一定時間內(nèi)可以用一定體積的去離子水代替Zarrouk培養(yǎng)基補加到光生物反應(yīng)器中，節(jié)約營養(yǎng)鹽，降低螺旋藻培養(yǎng)成本。但在長期實驗中，向Zarrouk培養(yǎng)基中加入去離子水的量要控制在保證營養(yǎng)鹽滿足螺旋藻生長需求的范圍內(nèi)。

MPBR中可將濃縮藻液過程中獲得的過濾液循環(huán)至光生物反應(yīng)器中重復(fù)利用，減少微藻培養(yǎng)過程中營養(yǎng)鹽和水資源的消耗量，降低培養(yǎng)成本。最佳稀釋率D＝0.08 d-1條件下，每天培養(yǎng)結(jié)束采收藻液后，MPBR中需補加296 mL過濾液和296 mL去離子水 （忽略培養(yǎng)初始時取藻液30 mL），PBR中需補加592 mL Zarrouk培養(yǎng)基；由此可見，與PBR相比，MPBR每天節(jié)約水資源、氮、磷營養(yǎng)鹽的使用量分別為 296 mL 水、1.48 g NaNO3、0.296 g K2HPO4；MPBR中生物質(zhì)平均采收量0.983 g/d，即獲得1 g生物量，MPBR中可節(jié)約水、氮、磷的量分別為0.301 L、0.248 g、0.053 g。此外，在后續(xù)實驗長期連續(xù)運行后，水資源和營養(yǎng)鹽的消耗量會進行具體的核算。

圖6 MPBR中不同稀釋率下鈍頂螺旋藻生物量和pH變化Fig.6 Changes of Spirulina platensis biomass concentration and pH during different dilution rates in MPBR

圖7 培養(yǎng)開始和結(jié)束時藻液中氮磷變化Fig.7 Changes of nitrogen and phosphorus in medium at the initial and final of culturing

Livansky等[23]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基循環(huán)利用會導(dǎo)致斜生柵藻生物量產(chǎn)率降低，微藻自身代謝物的積累會限制微藻的生長；可能是由于藻細胞對礦質(zhì)營養(yǎng)鹽有離子選擇性吸收的特性[8]，尤其是在長期、大量的循環(huán)利用過濾液時，過濾液中非限制性營養(yǎng)物質(zhì)的積累可能會抑制微藻的生長[15]；同時微藻在生長過程中或者細胞溶解時釋放的某些代謝物（例如脂類、多糖、蛋白質(zhì)等）[24-25]也會對微藻產(chǎn)生抑制作用[26]。但在本實驗中，過濾液循環(huán)使用沒有對微藻的生長產(chǎn)生不利影響，一方面可能是因為實驗時間較短，且每天補加去離子水對非限制性營養(yǎng)物質(zhì)的積累起到一定的稀釋作用；另一方面是因為本實驗培養(yǎng)液中生物量質(zhì)量濃度在2 g/L以下（Livansky[23]研究中斜生柵藻生物量達到了3 g/L），微藻培養(yǎng)液中非限制性營養(yǎng)物質(zhì)以及藻細胞自身代謝產(chǎn)物等積累量很低，不足以對微藻的生長產(chǎn)生抑制作用。

3 結(jié) 語

基于PBR和MPBR培養(yǎng)和預(yù)采收鈍頂螺旋藻，確定了不同初始生物量質(zhì)量濃度和稀釋率對螺旋藻生長和預(yù)采收的影響以及MPBR在提高藻產(chǎn)品質(zhì)量濃度，節(jié)約水資源，節(jié)約營養(yǎng)鹽等方面的有效性。初始生物量質(zhì)量濃度約為1.8 g/L時進行螺旋藻采收；與PBR相比，稀釋率為0.08 d-1時獲得1 g生物量，MPBR中可節(jié)約水、氮、磷的量分別為0.301 L、0.248 g、0.053 g。實驗結(jié)果表明，膜組件的加入可完全截留藻細胞，實現(xiàn)微藻培養(yǎng)和采收過程中的固液分離，提高藻產(chǎn)品質(zhì)量濃度，減輕微藻采收過程中后續(xù)脫水的能耗和成本；同時循環(huán)利用過濾液，節(jié)約水資源節(jié)約營養(yǎng)鹽，降低了微藻培養(yǎng)成本。