房 杰，孟永宏，張 英，尤毅娜，郭玉蓉

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

關(guān)鍵字：高通量測(cè)序；三文魚片；菌相分析；優(yōu)勢(shì)菌

目前，食源性疾病和食物中毒是食品行業(yè)的兩個(gè)主要問題，威脅著消費(fèi)者的身體健康和食品工業(yè)的發(fā)展[1]。許多類型的微生物都可以感染食物，從而增加食物中毒和食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。即食食品由于在食用前不進(jìn)行加熱，導(dǎo)致其被致病菌感染的概率大大增加。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們對(duì)海產(chǎn)品的消費(fèi)不斷增加，三文魚以其鮮美的肉質(zhì)、獨(dú)特的口味和豐富的營養(yǎng)深受消費(fèi)者的青睞。

由于三文魚肉質(zhì)細(xì)膩、口感爽滑、色澤鮮艷，主要以生食為主。此外，目前中國市場(chǎng)上的三文魚多為挪威三文魚，在挪威養(yǎng)殖捕撈、冷鏈運(yùn)輸后以冰藏方式銷售[3]。冰藏溫度并不足以完全抑制有害微生物的生長繁殖，生食冰鮮三文魚的質(zhì)量狀況受到廣泛關(guān)注。魚的腐敗是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，涉及物理、化學(xué)及微生物三個(gè)方面[4]，其中微生物是導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)的主要原因[5]。因此，對(duì)三文魚的菌相進(jìn)行分析，探明其優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)提高其防腐保鮮效果，降低食物中毒及食源性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。但是，目前對(duì)三文魚的菌相分析報(bào)道較少，且主要是通過傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離和鑒定的方法來進(jìn)行研究[6]。然而傳統(tǒng)的方法不能真正反映菌群多樣性[7]，難以對(duì)微生物的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。此外，研究人員推測(cè)在自然界中有85%～90%的微生物目前還無法培養(yǎng)[8]，大大限制了傳統(tǒng)方法研究細(xì)菌群落的能力。變性梯度凝膠電泳（DGGE）雖屬常規(guī)的分子生物學(xué)方法，但因操作復(fù)雜、成本高、DNA分離及測(cè)序的局限性等影響因素?zé)o法達(dá)到深入分析微生物多樣性的目的[9]。2005 年，Margulies等在《Nature》上報(bào)道了一種快速、簡單、成本低的測(cè)序方法—高通量測(cè)序技術(shù)（High throughput sequencing），在學(xué)術(shù)界引起了很大的反響。該方法測(cè)序信息豐富、速度快，僅100多天就可以完成對(duì)人類基因組的測(cè)序[10]。目前，許多科學(xué)家都在使用這種技術(shù)，是目前公認(rèn)的分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、確定優(yōu)勢(shì)菌的工具，已廣泛應(yīng)用于土壤[11-13]、水[14]、牛瘤胃[15]、腸道[16-17]等細(xì)菌群落的分析。雖然該技術(shù)已具有廣泛的應(yīng)用背景，但其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用較少。

作者以三文魚片為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)，研究了其在冷藏過程中的群落多樣性、菌相構(gòu)成及菌相變化規(guī)律，并確定了優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、設(shè)備及試劑

高速離心機(jī) （1-14型）：Sigma公司；PCR儀：BIO-RAD公司；電泳儀（DYY-6C型）：北京市六一儀器廠；培清JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀（JS-680B型）：上海培清科技有限公司。

Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒：上海生工生物有限公司；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒：Life；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生工生物有限公司；引物合成及高通量測(cè)序：上海生工生物有限公司進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三文魚樣品的處理采購于麥德龍超市的新鮮挪威三文魚，將其分割為均勻的三文魚片（3 cm×5 cm×0.3 cm）。放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用聚氯乙烯保鮮膜密封，置于4℃冰箱內(nèi)保存，分別于第0、1、2、3、4 天取樣進(jìn)行分析。

1.2.2 細(xì)菌總DNA的提取精確稱取25 g肉樣，用無菌剪刀剪碎放入50 mL離心管中，加入25 mL無菌水振蕩混勻。4℃下2 500g離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至10 mL離心管中，12 000g離心5 min，棄上清液。離心所得沉淀，采用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒，方法稍作調(diào)整。沉淀加入400 μL的SCL緩沖液，振蕩混勻后，置于65℃水浴10 min，然后繼續(xù)按照說明書上的操作步驟進(jìn)行提取。提取的總DNA溶于40 μL TE緩沖液中，Qubit2.0檢測(cè)DNA濃度，1 g/dL瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性，置于-20℃保存。

1.2.3 PCR反應(yīng)采用PCR擴(kuò)增肉樣細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)。第一輪PCR采用引物341F和 805R 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系 （50 μL）：10×PCR 緩沖液 5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，基因組總 DNA 0.5 μL（20 ng/μL），Bar-PCR 引物 F（50 μmol/L）0.5 μL，引物 R（50 μmol/L） 0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL） 0.5 μL，ddH2O 42.5 μL。 PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性30 s，45℃退火 20 s，65 ℃延伸 30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性 20 s，55℃退火 20 s，72℃延伸 30 s，20個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，第二輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR 體系 （50 μL）：10×PCR 緩沖液5 μL，dNTP（10 mmol/L each）0.5 μL， 基因組總 DNA 1 μL（20 ng/μL），引物 F（50 μmol/L）0.5 μL，引 物 R（50 μmol/L）0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL） 0.5 μL，ddH2O 42 μL。 PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 30 s；95℃變性 15 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，5個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)后，對(duì)DNA進(jìn)行回收。

1.2.4 DNA回收及高通量測(cè)序以PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳后，在凝膠圖像系統(tǒng)的紫外燈照射下切割高亮度條帶所在位置的凝膠，稱質(zhì)量，進(jìn)行膠回收。切下的凝膠置入1.5 mL EP管稱重，然后加入質(zhì)量∶體積=1∶1的連接緩沖液，置于56℃ 孵育，直至凝膠完全融化。取上述溶液 700 μL加入帶有Hibind DNA柱子的 2 mL收集管中，室溫10 000g離心 1 min。棄收集管中的液體，再加入300 μL的連接緩沖液，室溫10 000g離心1 min。再次棄收集管中的液體，再加入700 μL的用無水乙醇稀釋的SPW 洗脫緩沖液，室溫10 000g離心 1 min。再次倒掉液體，將收集管空管室溫13 000g離心 2 min，除去柱子中的無水乙醇。將Hibind DNA柱子置入新的1.5 mL離心管中，加入30 μL預(yù)熱60℃的洗脫緩沖液，室溫下13 000g離心1 min。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。采用高通量測(cè)序技術(shù)，在Miseq測(cè)序平臺(tái)上對(duì)回收DNA進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌總DNA的提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取三文魚片上的細(xì)菌總DNA，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明在第 0、1、2、3、4 天從三文魚片中均提取出了細(xì)菌總DNA且其完整性較好。以細(xì)菌總DNA為模板，采用引物341F和805R進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，再以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，直接對(duì)目的片段進(jìn)行割膠回收，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1，產(chǎn)物約為600多bp，其中包含了約為120 bp的測(cè)序接頭和10 bp左右的標(biāo)簽，表明PCR擴(kuò)增后獲得約450 bp的特異性擴(kuò)增片段。各樣品均有較亮的帶，擴(kuò)增產(chǎn)量大，無副帶或拖帶，說明各樣品總DNA提取成功，PCR擴(kuò)增條件合適，可用于后續(xù)的高通量測(cè)序分析。

圖1 樣品中細(xì)菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification products of V3-V4regions of sample DNA

2.2 測(cè)序基本數(shù)據(jù)分析

作者通過高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)三文魚片細(xì)菌群落微生物細(xì)胞內(nèi)特定的遺傳物質(zhì)16S rRNA，這些特定的遺傳物質(zhì)具有一定的保守性，保守區(qū)序列為同類微生物所共有，可變區(qū)序列反映了物種之間的序列差異[18-20]。因此，通過對(duì)可變區(qū)域序列的檢測(cè)和對(duì)比分析，可以揭示三文魚片的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性。此外，作者主要在屬水平對(duì)冷藏條件下三文魚片的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，使用boot strapping方法估計(jì)分類的可信度。當(dāng)可信度設(shè)為80%時(shí)，V3、V4區(qū)的序列可以正確分配到屬的概率分別為98.1%和95.7%，滿足分析需要。

在PCR擴(kuò)增過程中會(huì)產(chǎn)生嵌合體和靶區(qū)域外序列，其中嵌合體是由于不同的模板混雜產(chǎn)生的錯(cuò)誤序列，并非真實(shí)存在，而靶區(qū)域外序列則是引物非特異性靶定產(chǎn)生的序列，都會(huì)影響后續(xù)的序列分析質(zhì)量。為了得到更高質(zhì)量及更精準(zhǔn)的分析結(jié)果，需要進(jìn)行質(zhì)量控制，即對(duì)有效序列進(jìn)行去雜。如表1所示，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三文魚片在冷藏過程中的菌相進(jìn)行分析，樣品測(cè)序的總序列數(shù)為128531，其中，第 0、1、2、3、4 天五個(gè)樣品的測(cè)序的序列數(shù)分別為 22742、25858、29643、25968及24320。質(zhì)量控制后樣品的總序列數(shù)為116180，各樣品的序列數(shù)分別為21594、25356、25873、22796、20561，平均長度分別為 421.7、423.6、424.5、424.2、424.1 bp。質(zhì)量控制后所有序列長度均為420～480 bp，滿足前期設(shè)計(jì)引物時(shí)對(duì)目的片段約為465 bp的要求[21-22]。

表1 各樣品測(cè)序基本數(shù)據(jù)信息Table 1 Basic sequencing data of each sample

2.3 樣品的菌群結(jié)構(gòu)

16S rRNA基因測(cè)序用于分析不同貯藏時(shí)期三文魚樣品的群落結(jié)構(gòu)，在本研究中，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)16S rRNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序來評(píng)價(jià)三文魚片的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。測(cè)序結(jié)果表明，在三文魚片的菌群結(jié)構(gòu)中含有281種菌屬。如圖2所示，在所有的三文魚樣品群落中，其優(yōu)勢(shì)菌屬（＞1%）為假單胞菌屬 （Pseudomonas，37.20%）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium，36.08%）、 希瓦氏菌（Shewanella，11.32%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，5.19%）、黃桿菌屬 （Flavobacterium，2.48%） 和金黃桿菌屬（Chryseobacterium，1.98%）。 第 0天時(shí)，樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬依次為希瓦氏菌 （27.94%）、發(fā)光桿菌（13.74%）、假單胞菌（12.32%）、黃桿菌（12.15%）、金黃桿菌（9.54%）及不動(dòng)桿菌（4.44%）；第 1天時(shí)，各優(yōu)勢(shì)菌按其豐度大小依次為發(fā)光桿菌（40.75%）、假單胞菌（36.06%）、希瓦氏菌（10.96%）、金黃桿菌（5.44%）及不動(dòng)桿菌（0.47%）；第 2天時(shí)，依次為發(fā)光桿菌83.44%，假單胞菌9.74%、不動(dòng)桿菌3.5%和希瓦氏菌3.1%；在第3天，各優(yōu)勢(shì)菌依次為假單胞菌 （64.82%）、發(fā)光桿菌 （22.83%）、希瓦氏菌（4.80%）、金黃桿菌（3.83%）及不動(dòng)桿菌（2.97%）；在儲(chǔ)藏第4天，細(xì)菌群落中假單胞菌所占的豐度最大，為68.66%，其他的依次為希瓦氏菌11.88%、不動(dòng)桿菌9.69%和發(fā)光桿菌8.88%。結(jié)果表明，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，三文魚片樣品的細(xì)菌群落及優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度不斷地發(fā)生變化，但其主要優(yōu)勢(shì)菌的菌屬種類保持不變。同時(shí)，在儲(chǔ)藏后期，假單胞菌屬的相對(duì)豐度達(dá)到最大，成為最優(yōu)勢(shì)菌屬。水產(chǎn)品在儲(chǔ)藏過程中其菌相不斷變化，其原因可能是由于水產(chǎn)品上的微生物在不同的儲(chǔ)藏條件下，其忍耐力不同，經(jīng)過一定的適應(yīng)、生長過程后，最終成為該條件下的優(yōu)勢(shì)菌[23]。三文魚片在冷藏過程中，隨著時(shí)間的延長，pH、水分、脂肪氧化程度等條件發(fā)生改變，導(dǎo)致在不同儲(chǔ)藏時(shí)間其優(yōu)勢(shì)菌豐度的不同。

圖2 三文魚樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度分布圖Fig.2 Relative abundances of dominant bacterial genus in all salmon samples

2.4 樣品多樣性分析

選取Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）及Simpson指數(shù)初步評(píng)價(jià)樣品的菌群豐度及多樣性。Chao1指數(shù)及ACE指數(shù)常用于計(jì)算樣品的菌群豐度，估計(jì)群落中含OTU數(shù)目。Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)用于估算樣品中微生物的多樣性，Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高，Simpson指數(shù)越大，群落多樣性越低。在97%的序列相似度下，從5個(gè)三文魚樣品中共鑒定出17 382個(gè)OTU，第 0、1、2、3、4 天時(shí)，樣品 OTU 數(shù)目分別為3 322、4 053、3 259、3 412 及 3 336 個(gè)。

如表2所示，在第0天時(shí)，樣品的Chao 1指數(shù)及ACE指數(shù)最大，表明此時(shí)三文魚片上的細(xì)菌群落的OUT數(shù)目最多，菌群豐度最大。同時(shí)，其Shannon指數(shù)數(shù)值最大，而Simpson指數(shù)數(shù)值最小，表明在第0天時(shí)，三文魚片的細(xì)菌群落的多樣性最高。此外，Simpson指數(shù)在第2天時(shí)最大，表明第2天時(shí)樣品的群落多樣性最低。結(jié)合圖2可知，可能是由于在第2天時(shí)，發(fā)光桿菌大量繁殖，其相對(duì)豐度已達(dá)到83.44%，抑制了其他微生物的生長，導(dǎo)致細(xì)菌群落多樣性降低。此外，從各樣品多樣性指標(biāo)可以看出，三文魚片在冷藏過程中，其細(xì)菌群落的OTU數(shù)目及多樣性均不斷變化。

2.5 不同時(shí)間的三文魚樣品上的菌群結(jié)構(gòu)的比較

作者采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三文魚片在冷藏過程中第 0、1、2、3、4天的細(xì)菌群落進(jìn)行深度分析，將所測(cè)得的序列按其序列間的距離進(jìn)行聚類，在97%的相似度下分為操作分類單元 （OTU）。采用VENN圖統(tǒng)計(jì)樣本中共有的和獨(dú)有的OTU數(shù)目，直觀地展現(xiàn)出樣品之間的異同。

表2 三文魚樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial richness indices of salmon samples

在97%的序列相似性條件下，各樣品的OTU數(shù)目共計(jì)17 382，每個(gè)樣品平均含有3 476個(gè)OTU。 在第 0、1、2、3、4 天五個(gè)樣品含有 502 個(gè)共有OTU，第0天與第1天、第1天與第2天、第2天與第3天以及第3天與第4天的共有OTU數(shù)目分別為 1 357、1 409、1 178 及 1 260，見圖 3。 同時(shí)，第 0、1、2、3、4天五個(gè)樣品的獨(dú)有 OTU數(shù)目分別為1 644、1 498、1 478、1 271 及 1 396。 結(jié)果表明，三文魚片在冷藏過程中，在第 0、1、2、3、4 天五個(gè)樣品既有共有OTU也有各自獨(dú)有的OTU，其細(xì)菌群落快速變化。結(jié)合前面的細(xì)菌群落豐度圖，可以看出，盡管三文魚片在冷藏過程中其菌群結(jié)構(gòu)變化很大，但其主要優(yōu)勢(shì)菌屬基本相同。

3 結(jié) 語

本研究首次應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究了三文魚片在冷藏過程中的優(yōu)勢(shì)菌及菌相變化。結(jié)果表明，高通量測(cè)序所得序列中，相似度在97%以上且其豐度大于0.1%的有16個(gè)菌屬，其中豐度大于1%的有6個(gè)菌屬，分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）、發(fā)光桿菌屬 （Photobacterium）、 希瓦氏菌（Shewanella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、黃桿菌屬 （Flavobacterium） 和 金 黃 桿 菌 屬（Chryseobacterium）。 在第 0 天時(shí)，Chao 1 指數(shù)及ACE指數(shù)表明，樣品細(xì)菌群落的豐度最高；多樣性指數(shù)表明，此時(shí)其微生物多樣性最高。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，樣品的多樣性逐漸降低，且假單胞菌的豐度逐漸增大。而第2天時(shí)，由于發(fā)光桿菌大量繁殖，其相對(duì)豐度已達(dá)到83.44%，抑制了其他微生物的生長，導(dǎo)致其微生物多樣性減少，假單胞菌的豐度降低。在第3、4天時(shí)，樣品細(xì)菌群落中發(fā)光桿菌的相對(duì)豐度減少，假單胞菌屬的相對(duì)豐度最大；在第4天時(shí)已達(dá)到68.66%，其優(yōu)勢(shì)性最強(qiáng)。高通量測(cè)序結(jié)果表明，三文魚片在儲(chǔ)藏過程中其菌相不斷變化，但其主要的優(yōu)勢(shì)菌屬保持不變。此外，在儲(chǔ)藏后期（第4天），假單胞菌屬成為三文魚片最主要的優(yōu)勢(shì)菌。

圖3 三文魚樣品維度圖Fig.3 Venn diagram of all salmon samples