吳 芹，臧 嘉，胡 蝶，王 瑞，鄔敏辰

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122）

木聚糖酶（xylanases，EC 3.2.1.8）從木聚糖主鏈的內部水解β-1，4-D-木糖苷鍵，是木聚糖降解酶系中的關鍵組分，廣泛存在于各種生物體中。隨著低聚木糖生理功能的發(fā)現(xiàn)、加酶飼料的興起及人類環(huán)保意識的增強，木聚糖酶在許多工業(yè)領域如食品、飼料、紡織和造紙等中的應用潛力日趨凸顯[1-2]。目前商品化的木聚糖酶多為中溫酶，最適溫度在45～55℃范圍內，然而酶在使用過程中經常會遭遇或需要高溫環(huán)境，如在紙漿漂白和飼料造粒工藝中需要60～80℃的溫度，因此耐熱性差已成為制約木聚糖酶發(fā)展的瓶頸。

木聚糖酶主要歸屬糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase families，GHFs） 10 和 11，GHF11 木聚糖酶的三維結構由一個α-螺旋、兩個反向平行的β-折疊片A和B及若干loops構成，呈右手半握形狀[3]。隨著人們對木聚糖酶的結構與功能及作用機理的認識不斷深入，采用基因工程技術改造酶分子以獲得具有優(yōu)良酶學性質的耐熱木聚糖酶的研究得到了快速發(fā)展。Zhang等[4]將Streptomyces olivaceoviridis木聚糖酶 SoxB的 N端與Thermomonospora fusca耐熱酶TfxA的對應區(qū)域互換，獲得最適溫度和溫度穩(wěn)定性大幅度提高的雜合木聚糖酶STxAB。Ayadia等[5]將位于Trichoderma reesei木聚糖酶三維結構表面的Ser單點和雙點突變?yōu)門hr，其中雙點突變酶（S80T-S149T）在55℃的半衰期由野生型酶的20 min延長至37 min。Qian等[6]對白蟻GHF11木聚糖酶XYL7實施定點飽和突變，獲得了兩個最適溫度均比野生型酶提高10℃的突變酶（XYL7-TC和XYL7-TS）。

Aspergillus oryzaeGHF11木聚糖酶AoXyn11A（GenBank：AFA51067）是一種具有優(yōu)良酶學性質的生物催化劑，但其耐熱性較差[7]。本研究基于其三維結構的同源建模和分子動力學模擬，擬將Gly21隨機替換為其他氨基酸。以pET-28a-Aoxyn11A為對象，對Aoxyn11A中編碼Gly21的密碼子實施飽和突變，構建突變轉化子文庫，并從中獲得表達最高溫度穩(wěn)定性木聚糖酶的最優(yōu)突變轉化子。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒米曲霉 （Aspergillus oryzae）CICC40186：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；大腸桿菌（Escherichia coli） BL21（DE3） 和表達質粒pET-28a（+）：購自Novagen公司；重組表達質粒pET-28a-Aoxyn11A和大腸桿菌轉化子E.coli/Aoxyn11A：由作者所在實驗室構建和保藏。

1.1.2 主要試劑和引物 PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性內切酶 DpnⅠ、DNA Marker和蛋白質Marker：購自大連TaKaRa公司；IPTG、胰蛋白胨和酵母提取物：購自上海Sangon公司；D-木糖、樺木木聚糖和考馬斯亮藍R-250：Sigma公司產品；其他試劑均為分析純。PCR引物委托Sangon公司合成見表1，用于Aoxyn11A的定點飽和突變。

表1 Aoxyn11A定點飽和突變的PCR引物Table 1 PCR primers for the site-saturated mutagenesis of Aoxyn11A

1.1.3 培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：1 g/dL胰蛋白胨、0.5 g/dL 酵母提取物和 1 g/dL NaCl，pH 7.2；LB 固體培養(yǎng)基：添加1.8 g/dL的瓊脂粉；LB抗性培養(yǎng)基：添加終濃度為100 μg/mL的卡那霉素。

1.2 實驗方法

1.2.1 同源建模和分子動力學模擬在PDB數(shù)據(jù)庫中搜索與AoXyn11A一級結構同源性高的且已知晶體結構的GHF11木聚糖酶，選取其中的3種晶體結構 （PBD：1TE1，2VUL和 1ENX）為模板， 運用SALIGN多空間結構比對程序（http：//salilab.org/DBAli/?page=tools_&action=f_salign）和 MODELLER 9.11 建模程 序 （http：//salilab.org/modeller/） 進行AoXyn11A三維結構的多模板同源建模及優(yōu)化。運用 GROMACS 4.5 程序包（http：//www.gromacs.org/）并參照Yin等[8]的方法對AoXyn11A的三維結構進行分子動力學（molecular dynamics，MD） 模擬，選擇將最高溫度因子B-factor值位點處的Gly21隨機替換為其他氨基酸。

1.2.2 突變轉化子文庫的構建和篩選以pET-28a-Aoxyn11A為模板、G21X-F和X11-R為引物，采用全質粒兩步PCR（two-stage whole-plasmid PCR）[9]對Gly21密碼子實施飽和突變。將pET-28a-Aoxyn11A突變體用DpnⅠ消化，轉化E.coliBL21，構建突變轉化子文庫。從文庫中挑選96個轉化子（E.coli/Aoxyn11AG21X，X代表任意氨基酸），接種于500 μL LB抗性培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，以2%接種體積分數(shù)轉接相同的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600約為0.8時，加入0.5 mmol/L IPTG，16℃誘導表達8 h。離心收集菌體，用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（50 mmol/L、pH 5.5）懸浮，反復凍融破碎細胞，上清液作為粗酶液。將酶液60℃保溫20 min，適當稀釋后取5 μL加入95 μL 0.5 g/dL樺木木聚糖溶液（相同緩沖液配制）中，借助PCR儀進行催化和顯色反應（50 ℃ 15 min，加 50 μL DNS 試劑，95 ℃5 min，冷卻至10℃）。加入96孔板中，用酶標儀測定OD540nm值。殘余酶活性大于50%的突變木聚糖酶所對應的轉化子定義為正突變子，對其進行DNA測序。延長60℃保溫時間，從正突變子中獲得最優(yōu)突變轉化子。

1.2.3 木聚糖酶的純化按上述方法分別將E.coli/Aoxyn11A和最優(yōu)突變轉化子在30 mL LB抗性培養(yǎng)基中進行誘導表達，用3 mL檸檬酸-Na2HPO4緩沖液重懸菌體，冰浴超聲波破碎細胞，上清液在4℃用Ni-NAT親和層析柱 （北京Tiandz公司）純化目的酶蛋白。采用SDS-PAGE分析重組表達產物。

1.2.4 木聚糖酶活性的測定參照Bai等[10]的方法并略作修改。在2.4 mL 0.5%樺木木聚糖溶液（pH 5.5、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）中加入0.1 mL適當稀釋的酶液，50℃反應15 min，再加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴顯色7 min，測定OD540nm值。在上述反應條件下，1個木聚糖酶活性單位（U）定義為每分鐘產生1 μmol還原糖 （以D-木糖計）所需的酶量。

1.2.5 木聚糖酶酶學性質的分析

1）溫度對酶活性的影響：在不同溫度（45～75℃）下，按1.2.4的方法測定木聚糖酶活性。最適溫度定義為最高酶活性（相對酶活性100%）所對應的溫度。將酶液在35～65℃下處理1 h，按1.2.4的方法測定殘余木聚糖酶活性，未經處理酶液的酶活性以100%計。溫度穩(wěn)定性定義為殘余酶活性大于85%所對應的溫度。

2）pH對酶活性的影響：用pH 3.5～7.5的緩沖液配制0.5%樺木木聚糖溶液，按1.2.4的方法測定木聚糖酶活性。最適pH定義為最高酶活性所對應的pH值。將酶液在pH 3.5～7.5、35℃下處理1 h，按1.2.4的方法測定殘余木聚糖酶活性。pH穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上所對應的pH范圍。

1.2.6 統(tǒng)計學分析實驗結果以 “均數(shù)±標準差”（x±s）表示，應用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和t檢驗。

2 結果與分析

2.1 AoXyn11A三維結構的同源建模

已知晶體結構的GHF11木聚糖酶與AoXyn11A的一級結構同源性均小于72%，因此本研究選取同源性相對較高、分別源自Penicillium funiculosum（1TE1）、E.coli（2VUL） 和Hypocrea jecorina（1ENX）的3種木聚糖酶晶體結構作為模板，采用SALIGN和MODELLER 9.11進行AoXyn11A三維結構的多模板同源建模及優(yōu)化，見圖1。已有研究表明，目標蛋白質三維結構同源建模的準確度主要取決于其與模板蛋白質的一級結構同源性高低，當同源性不高時，單模板同源建模的準確度較低[11]。

2.2 擬隨機替換位點的選定

蛋白質構象的剛性與其各位點處氨基酸的B-factor值成負相關性[12]。運用GROMACS 4.5對AoXyn11A三維結構進行了MD模擬，計算出各氨基酸的B-factor值，見圖2。由圖2可見，AoXyn11A中 Gly21的 B-factor值最高 （70.27 ?）， 故選定將Gly21隨機替換為其他氨基酸。

圖1 AoXyn11A的三維結構模型Fig.1 Three-dimensional structure model of AoXyn11A

圖2 AoXyn11A各位點處氨基酸殘基的溫度因子B-factor值Fig.2 B-factor values of amino acid residues in the sites of AoXyn11A

2.3 最優(yōu)突變轉化子的獲得

將E.coli/Aoxyn11A和96個E.coli/Aoxyn11AG21X所表達的木聚糖酶在60℃保溫20 min，測定殘余酶活性。結果顯示，AoXyn11A活性完全喪失，而4種突 變 酶 （AoXyn11AG21I、AoXyn11AG21F、AoXyn11AG21V和AoXyn11AG21L）的殘余活性大于50%，見圖3。延長保溫時間至30 min，測得4種酶的殘余活性分別為57.3、39.3、30.5和37.1%，從而獲得了最優(yōu)突變轉化子E.coli/Aoxyn11AG21I。

2.4 木聚糖酶的純化和分析

E.coli/Aoxyn11A和E.coli/Aoxyn11AG21I經IPTG誘導表達和超聲波破碎細胞，上清液采用Ni-NAT柱純化目的酶蛋白。SDS-PAGE分析顯示，純化的AoXyn11A和AoXyn11AG21I均約在相對分子質量24 100處呈現(xiàn)單一條帶（圖4泳道2和4）。

圖3 AoXyn11A及其4種代表性突變酶N端的30個氨基酸殘基Fig.3 N-terminal 30 amino acid residues of AoXyn11A and its four representative mutants

圖4 大腸桿菌轉化子表達產物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed products in E.coli transformants

2.5 木聚糖酶酶學性質的分析

2.5.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性溫度對AoXyn11A和AoXyn11AG21I活性的影響見圖5。由圖5（a）可見，AoXyn11AG21I的最適溫度為65℃，較AoXyn11A提高了 10℃；由圖 5（b）可見，AoXyn11AG21I和AoXyn11A分別在48、55℃及以下穩(wěn)定。測定結果表明，將AoXyn11A中的Gly21替換為Ile21明顯改善了其溫度特性。

圖5 AoXyn11A和AoXyn11AG21I的最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.5 Temperature optima and stabilities of AoXyn11A and AoXyn11AG21I

2.5.2 最適pH和pH穩(wěn)定性分析了pH對AoXyn11A和AoXyn11AG21I活性的影響。AoXyn11A和AoXyn11AG21I的最適pH均為5.5；在pH 5.0～7.0范圍內殘余酶活性均大于85%。測定結果表明，Gly21替換為Ile21對AoXyn11A的pH特性改變不大。

2.6 木聚糖酶三維結構的分析

Gly側鏈僅有一個氫原子，由于缺乏長側鏈的約束，致使多肽鏈在Gly殘基位點處呈現(xiàn)柔性構象；另外，Gly具有最高的構象熵，在解折疊過程中所需能量最少。因此，將特定位點處的Gly突變?yōu)槠渌被峥捎行Ц纳艷HF11木聚糖酶溫度特性[13]。由圖1可見，Gly21使AoXyn11A在該位點處的柔性較強，導致其溫度穩(wěn)定性較差。將Gly21突變?yōu)镮le21（支鏈氨基酸）提高了AoXyn11A構象的剛性并降低了熵，對改善其溫度特性起促進作用。

AoXyn11A的Gly21位于連接β折疊股B2和A2的 loop上。運用 PIC程序（http：//pic.mbu.iisc.ernet.in/）分析AoXyn11A和AoXyn11AG21I構象中存在的作用力。結果表明，除了共同存在的疏水作用外，AoXyn11A中P3-F16和I58-V74形成了2對疏水作用； 而 AoXyn11AG21I中 I21-V41、Y34-V172、Y71-L72、A73-I87、V74-V172、Y102-I115、Y113-I115、I115-L162和W157-Y160形成了9對疏水作用。另外，AoXyn11AG21I較AoXyn11A多出了3對氫鍵和1對鹽橋（E84-R120）。許多研究表明，疏水作用、氫鍵、鹽橋和二硫鍵等對酶的熱穩(wěn)定性起重要作用[14]。

3 結 語

酶在各領域的應用常受限于其熱穩(wěn)定性差，如何獲得性質優(yōu)良的耐熱酶已成為研究人員所面臨的挑戰(zhàn)?；蚬こ碳夹g中的定點飽和突變在改善酶學性質如溫度和pH特性、比活性、對映和區(qū)域選擇性及底物特異性等方面?zhèn)涫荜P注。本研究基于生物數(shù)據(jù)庫的相關數(shù)據(jù)并借助多種生物軟件對AoXyn11A的三維結構進行多模板同源建模和分子動力學模擬，設計將其最高溫度因子B-factor值處的Gly21隨機替換為其他氨基酸，采用定點飽和突變技術構建了轉化子文庫，篩選獲得了的最優(yōu)突變酶轉化子AoXyn11A。與AoXyn11A相比，突變酶AoXyn11AG21I的最適溫度和溫度穩(wěn)定性有明顯的提高。本設計方案為木聚糖酶及其它酶蛋白的熱穩(wěn)定性定向改造提供了一種新的途徑。