田永峰，楊 柳，董高峰，段沅杏，韓 熠，張 霞，趙 楊，王昆淼，朱瑞芝，陳永寬，帥 瑤，何臘平，繆明明，劉志華

（1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650000；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院 發(fā)酵工程與生物制藥省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

口含煙是一種直接入口食用的新型無(wú)煙氣煙草制品，受到世界各煙草企業(yè)關(guān)注[1-2]。與傳統(tǒng)卷煙不同，口含煙是不經(jīng)過(guò)燃燒直接放入口中吸食的[3]，其口感和沖擊強(qiáng)度直接受煙草原料的感官特性影響，因此口含煙制品對(duì)煙葉原料的品質(zhì)要求更高。

微生物發(fā)酵是改善口含煙煙草原料品質(zhì)的有效手段[4-6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)采用人工控制微生物發(fā)酵技術(shù)可以消除煙葉的青雜氣和減輕刺激性，使煙葉香氣質(zhì)和香氣量變佳[7-8]或降解煙草中有害物質(zhì)[9-10]等。此外，微生物代謝過(guò)程中往往會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有益的功效性成分，如有助于消化的蛋白酶、可以溶解血栓的納豆激酶（nattokinase，NK）[11-12]等。因此接種合適的功能微生物于煙葉中發(fā)酵不僅可從感官上增香提質(zhì)，同時(shí)還能產(chǎn)生一些可大大提高口含煙食用價(jià)值的功能活性物質(zhì)。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種非致病性益生菌[13]，可用作多種食品工業(yè)酶的生產(chǎn)菌株[14]，能產(chǎn)生一系列抑制真菌和細(xì)菌活性的自身代謝產(chǎn)物，如多種消化酶、抗生素、抗菌蛋白或多肽類物質(zhì)等[15-16]，已廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖及蔬菜保鮮等眾多領(lǐng)域[17-20]?；诖?，初次采用實(shí)驗(yàn)室篩選出的具有優(yōu)良產(chǎn)納豆激酶和蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌GUHP-86對(duì)口含煙煙草原料進(jìn)行人工控制接種發(fā)酵，考察發(fā)酵前后煙草原料成分的改變，并進(jìn)一步考察發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酶情況及降低煙草中亞硝酸鹽的情況，為解淀粉芽孢桿菌在煙草發(fā)酵中的提質(zhì)降害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口含煙煙草原料大理紅大CL314：云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司；纖維蛋白原、水楊苷：美國(guó)Sigma公司；福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為色譜純或分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）GUHP-86：保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏編號(hào)CCTCC M 2016003）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 10 g、葡萄糖1 g，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

有糖鹽溶液：準(zhǔn)確稱取MgCl20.5 g、KCl0.5 g、CaCl20.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，補(bǔ)殼蒸餾水至1 000 mL，溶解滅菌后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gaschromatographymass spectrometry，GC-MS）（配PAL3多功能自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國(guó)Agilent公司；BSA124S-CW型電子天平：德國(guó)sartorius公司；A10超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司；Q/YXLZ82 分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SPX恒溫生化培養(yǎng)箱：上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 煙葉發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基中接入解淀粉芽孢桿菌GUHP-86于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，取出后置于滅菌的離心管內(nèi)，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清，加入無(wú)菌生理鹽水至20 mL，搖勻。稱取20 g煙葉于密封袋內(nèi)，吸取4 mL（即接種20%）離心管內(nèi)的菌液、4 mL有糖鹽溶液，直接加入煙葉中，充分混勻，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)15 d，每天對(duì)其進(jìn)行換氣。

1.3.2 酶活力測(cè)定

精確稱取磨碎的發(fā)酵煙草樣品1 g于燒杯中，用25 mL磷酸鹽（phosphate buffer saline，PBS）緩沖溶液浸提24 h，然后用慢速定性濾紙過(guò)濾，濾液待用。納豆激酶活力用紫外分光光度法測(cè)定[21-22]。蛋白酶活力參照GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》[23]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 亞硝酸鹽測(cè)定

精確稱取3.0 g磨成粉末狀的發(fā)酵煙葉樣品，置于250 mL錐形瓶里，加入10 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，加入蒸餾水150 mL，70 ℃水浴加熱30 min后過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，在旋轉(zhuǎn)的同時(shí)加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻并加入5 mL醋酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度，搖勻后過(guò)濾，濾液備用。參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中分光光度法進(jìn)行亞硝酸鹽測(cè)定。

1.3.4 揮發(fā)性成分GC-MS分析

將2 g發(fā)酵煙草樣品放入10 mL頂空固相微萃取瓶，配50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取條件為70 ℃保持5 min，70 ℃吸附30 min。待萃取結(jié)束后，在GC進(jìn)樣口解吸，解吸溫度250 ℃，時(shí)間5 min。

GC-MS條件：DB-wax毛細(xì)管柱（60m×0.25mm×0.25mm）；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣：氦氣（He），流速1.5 mL/min；分流比2∶1；升溫程序：初始溫度40℃，保持1min，以10℃/min升至120 ℃，保持1 min；以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。傳輸線溫度：240 ℃；電離方式：電子電離源（electron ionization，EI）；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：33～350 amu；數(shù)據(jù)采集模式：全掃描。采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）譜庫(kù)檢索定性。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS version 19.0進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GUHP-86發(fā)酵煙絲揮發(fā)性物質(zhì)的變化

采用GC-MS考察了菌株GUHP-86接種煙葉發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)的變化，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，發(fā)酵后口含煙草的揮發(fā)性物質(zhì)的種類及相對(duì)含量均發(fā)生了變化。發(fā)酵后煙葉中出現(xiàn)了新的物質(zhì)如哌啶類和喹啉類，而嘧啶類物質(zhì)消失，酮類、烴類含量基本不變，醇類、醛類、烷烴類物質(zhì)明顯增加，但酯類含量稍有降低，酸類物質(zhì)大幅度減少。發(fā)酵后煙葉中消失了一些成分，如植醋酸、糠醇、丁內(nèi)酯、乙酸、大馬酮等，但也產(chǎn)生了一些成分，如2-哌嗪酮、3-羥基-N-甲基哌啶、鄰苯二甲酸、4-嘧啶酮、有鮮清甜香的苯乙醛、植醇，具有果香和酒香香氣的癸酸乙酯，具有柑橘和檸檬似香氣的萜品烯等。發(fā)酵后醇類物質(zhì)的相對(duì)含量大大增加，主要表現(xiàn)為植醇的增加，而植醇是具有芳香氣味的物質(zhì)。此外，酸類物質(zhì)含量大大降低，酸在口腔中呈味作用主要表現(xiàn)在貢獻(xiàn)H+使人感覺(jué)到酸味覺(jué)，并同時(shí)有酸刺激感覺(jué)。作為在口腔中食用的口含煙，酸含量的下降會(huì)提高其食用的舒適感，降低刺激性。其他種類如酮類、醛類、酯類、烯烴類等的變化不大。

表1 發(fā)酵前后煙草揮發(fā)性物質(zhì)比較Table 1 Comparison of volatile substances in tobacco before and after fermentation

2.2 發(fā)酵煙葉納豆激酶活力測(cè)定

自然發(fā)酵煙葉和菌株GUHP-86發(fā)酵煙葉的提取液在纖維蛋白平板的水解效果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，自然發(fā)酵的煙葉沒(méi)有水解圈，只有發(fā)酵煙草樣品提取液顏色擴(kuò)散所產(chǎn)生的顏色圈，而經(jīng)菌株GUHP-86發(fā)酵的煙葉出現(xiàn)了水解圈，說(shuō)明菌株GUHP-86在煙葉發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)納豆激酶，由紫外法測(cè)得納豆激酶活力為（10.53±0.21）FU/g。納豆激酶（nattokinase，NK）是一種蛋白激酶，具有溶解血栓，降低血黏度等作用[24]。煙葉發(fā)酵后納豆激酶的產(chǎn)生無(wú)疑可以提高口含煙的食用價(jià)值?？诤瑹煱l(fā)酵后產(chǎn)納豆激酶，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。

圖1 自然發(fā)酵煙葉（a）、菌株GUHP-86發(fā)酵煙葉（b）的提取液在纖維蛋白平板上的水解效果Fig.1 Hydrolysis effect of extracts from naturally fermented tobacco leaves (a) and GUHP-86 fermented tobacco leaves (b) on fibrin plate

2.3 菌株GUHP-86發(fā)酵煙葉中蛋白酶活力測(cè)定

自然發(fā)酵煙葉酶提取液（a）和菌株GUHP-86發(fā)酵煙葉酶提取液（b）在酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上水解效果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，自然發(fā)酵的煙葉水解圈較小，而經(jīng)菌株GUHP-86發(fā)酵的煙葉出現(xiàn)了明顯的水解圈并且較未發(fā)酵煙葉水解圈更大，說(shuō)明菌株GUHP-86在煙葉發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)蛋白酶。蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，可以促進(jìn)煙葉中蛋白質(zhì)的水解和進(jìn)一步形成煙草致香物質(zhì)，從而提高煙草品質(zhì)[25]。同時(shí)蛋白酶也有助于人體消化。由福林-酚試劑法測(cè)得菌株GUHP-86發(fā)酵煙葉中蛋白酶酶活為54.45 U/g。

圖2 自然發(fā)酵煙葉（a）、菌株GUHP-86發(fā)酵煙葉（b）的酶提取液在酪蛋白平板上的水解效果Fig.2 Hydrolysis effect of enzyme extracts from naturally fermented tobacco leaves (a) and strain GUHP-86 fermented tobacco leaves (b) on casein plate

2.4 菌株GUHP-86降亞硝酸鹽性能測(cè)定

煙草中特有的亞硝胺（tabacco-specific nitrosamines，TSNA）是煙葉中重要的有害成分。TSNA 的形成普遍認(rèn)為是由煙草中的生物堿和亞硝酸鹽反應(yīng)形成的，因此亞硝酸鹽是生成TSNA的前體物之一，降低煙葉中亞硝酸鹽含量有助于降低TSNA含量，提高口含煙的食用安全性。菌株GUHP-86屬于芽孢桿菌屬，國(guó)內(nèi)外大量研究表明，芽孢桿菌對(duì)亞硝酸鹽及硝酸鹽有很好的去除效果[26-27]。

由圖3可以看出，經(jīng)菌株GUHP-86處理的煙葉（a）發(fā)酵21 d后，亞硝酸鹽含量下降了73%；而自然發(fā)酵煙葉（b）中亞硝酸鹽含量?jī)H下降了18%，降亞硝酸鹽性能差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌GUHP-86具有良好的降解亞硝酸鹽作用，其機(jī)理可能是發(fā)酵過(guò)程中GUHP-86產(chǎn)生了亞硝酸鹽還原酶將亞硝酸鹽降解和被生物利用。自然發(fā)酵煙葉在發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽也下降了18%（P＜0.05），其原可能因?yàn)闊熑~表面本身含有一定微生物，對(duì)亞硝酸鹽本身也有一定的降解作用，但降解率較GUHP-86弱很多。

圖3 煙葉發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量變化曲線Fig.3 Change curve of nitrite content during the tobacco leaves fermentation

3 結(jié)論

將解淀粉芽孢桿菌GUHP-86用于口含煙煙葉原料的發(fā)酵，GC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵消除了煙葉中一些成分但又新增一些成分，其中醇含量大大提高，酸含量顯著下降。此外，發(fā)酵后煙草原料中的納豆激酶、蛋白酶含量得到提升，而亞硝酸鹽含量降低了73%。說(shuō)明將解淀粉芽孢桿菌GUHP-86用于口含煙煙草原料發(fā)酵能一定程度地提高其口含煙產(chǎn)品的食用舒適性和食用安全性。尤其是口含煙發(fā)酵后產(chǎn)納豆激酶，國(guó)內(nèi)外目前未見(jiàn)報(bào)道，富含納豆激酶的口含煙可顯著提高口含煙的功能價(jià)值。