肖懷秋 ，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉 軍，周 全，姜明姣

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；4.湖南中威制藥有限公司，湖南 株洲 412000）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有調(diào)節(jié)腸道菌群失衡、增強(qiáng)免疫和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的益生菌[1]，其活菌制劑口服液可用于腸炎和腹瀉等疾病及燒傷感染的治療[2-4]。近年來，益生菌固態(tài)制劑因儲(chǔ)存運(yùn)輸、質(zhì)量控制及生產(chǎn)便捷而受到廣泛關(guān)注。然而，關(guān)于高生物活性和高存活率的固態(tài)制劑的保存鮮見報(bào)道[5]。噴霧干燥因熱干燥時(shí)間短、料液溫度低和生物活性損失小而廣泛應(yīng)用于益生菌菌體干燥[6-7]，但噴霧干燥大規(guī)模制備高活性益生菌固體制劑的抗熱性保護(hù)研究較少[8]，研制高活性益生菌固態(tài)制劑的關(guān)鍵就是抗熱保護(hù)劑的選擇與使用[9]，常用保護(hù)劑有低聚糖、糖醇、蛋白質(zhì)、多肽和多糖等[10]。保護(hù)劑的使用能減輕噴霧干燥熱損傷和脫水干燥對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與胞內(nèi)生物大分子及細(xì)胞器的破壞[6]。低聚糖等小分子保護(hù)劑為多羥基化合物，具有很好的親水性，可與細(xì)胞膜磷脂或蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵或水化層，保護(hù)細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜及胞內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)的完整性，而蛋白質(zhì)等大分子保護(hù)劑則主要通過“包埋”形成天然“隔熱屏障”，兩種保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制不同，可聯(lián)合使用[11]。研究表明，單一保護(hù)劑相比未添加保護(hù)劑能增強(qiáng)益生菌菌體熱耐受性，復(fù)合保護(hù)劑抗熱保護(hù)效果更好[12]。范娜等[8]研究發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑之間存在協(xié)同作用，復(fù)合使用抗熱保護(hù)效果更好；JACQUELINE A等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖或海藻糖能提高保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）菌體存活率，復(fù)合型保護(hù)劑能將菌體存活率提高780倍[14]；ZDENEK H等[9，15]等研究表明，蛋白質(zhì)比糖類抗熱保護(hù)效果要好，兩者聯(lián)用抗熱保護(hù)效果更佳；ANANTA E等[16]也認(rèn)為復(fù)合保護(hù)劑能提高益生菌存活率。

本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Prob1822為研究對(duì)象，研究了熱誘激溫度與時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌噴霧干燥菌體存活影響，確定了熱誘激處理?xiàng)l件；研究單一抗熱保護(hù)劑對(duì)菌體存活率的影響，優(yōu)選單一抗熱保護(hù)劑；以穩(wěn)定期菌體存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）響應(yīng)面法優(yōu)化技術(shù)對(duì)海藻糖、蔗糖和脫脂奶粉復(fù)配的復(fù)合抗熱保護(hù)劑的配方，旨在可為枯草芽孢桿菌的噴霧干燥提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Prob1822：湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

牛肉膏、胰蛋白胨（均為生化試劑）：北京博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；海藻糖（食品級(jí)）：海北鵬宇生物科技有限公司；甘露醇、麥芽糖（均為食品級(jí)）：鄭州百思特食品添加劑有限公司；山梨醇（食品級(jí)）：江蘇采薇生物科技股份有限公司；乳糖（食品級(jí)）：鄭州裕和食品添加劑有限公司；脫脂奶粉（食品級(jí)）：伊利集團(tuán)；乳清粉（食品級(jí)）：河北鵬宇生物科技有限公司；大豆分離蛋白（食品級(jí)）：山西中諾生物科技有限公司；蔗糖（食品級(jí)）：市售；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：在上述培養(yǎng)基中添加2%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：冷榨花生粕蛋白胨（自制）12 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-11A型電熱恒溫水浴箱：天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2500紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；AL204分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；BBS-SSC超凈工作臺(tái)：濟(jì)南騰覽儀器有限公司；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；LDZX-50FAS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；KRH-PJ-10L發(fā)酵罐：江蘇鎮(zhèn)江科海生物工程設(shè)備有限公司；SP-1500噴霧干燥機(jī)：上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 噴霧干燥菌體的制備

（1）菌種活化與種子液制備

將冷凍保存（-18 ℃）的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Prob1822轉(zhuǎn)接于斜面牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；活化完成后，用接種環(huán)從斜面刮取兩環(huán)菌種接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，裝瓶量為100 mL/250 mL，37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，得菌株P(guān)rob1822種子液。

（2）菌體生長(zhǎng)曲線繪制

按5%（V/V）接種量將種子液接種于發(fā)酵罐中，補(bǔ)充發(fā)酵罐裝液量至7 L，37 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)48 h，每間隔2 h取出適量發(fā)酵液于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值，記為A600nm，以培養(yǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ)600nm為縱坐標(biāo)繪制菌體生長(zhǎng)曲線，確定菌體遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期及衰亡期。

（3）噴霧干燥菌懸液的制備

收集培養(yǎng)至穩(wěn)定期（26 h）的發(fā)酵液，于4 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，沉淀用無菌水洗滌并重新懸浮，操作重復(fù)3次。用無菌水重新懸浮菌體制備噴霧干燥用菌懸液。

（4）噴霧干燥

制備的菌懸液先進(jìn)行熱誘激預(yù)處理（55 ℃熱預(yù)處理10 min），根據(jù)抗熱保護(hù)劑試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，按預(yù)定比例加入保護(hù)劑，充分溶解后作為噴霧干燥用菌懸液，并將含有抗熱保護(hù)劑的益生菌懸液（100 mL）加入到噴霧干燥設(shè)備中進(jìn)行噴霧干燥。噴霧干燥條件為進(jìn)風(fēng)溫度90 ℃、進(jìn)料速率500 mL/h、通風(fēng)量60 m3/h、出口溫度50 ℃，干燥時(shí)間1.5 s，得到枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Prob1822益生菌粉劑。

1.3.2 熱誘激處理

為提高菌體熱耐受性和保持較高菌體存活率，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期（8 h）、中期（16 h）、末期（20 h）和穩(wěn)定期（26 h）的菌體100 mL于三角瓶中，分別于50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行熱誘激處理10 min、30 min和60 min，熱誘激處理完成后隨即進(jìn)行噴霧干燥。以噴霧干燥后菌體存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳熱誘激溫度與熱誘激時(shí)間。

1.3.3 活菌總數(shù)測(cè)定與菌體存活率計(jì)算

噴霧干燥前總活菌數(shù)測(cè)定方法：準(zhǔn)確移取1.0 mL噴霧干燥用菌懸液，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（10-4～10-6），吸取0.1 mL菌懸液傾入牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，涂布均勻后于37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，記錄培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的菌落數(shù)（CFU），計(jì)算噴霧干燥的活菌總數(shù)（N）。

噴霧干燥后活菌總數(shù)測(cè)定方法：準(zhǔn)確稱取1.00 g噴霧干燥后的益生菌菌粉用9 mL無菌水充分混勻溶解，系列梯度稀釋（10-7～10-9）后選取3個(gè)相鄰稀釋度的菌液0.1 mL傾入牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，涂布均勻后于37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，記錄培養(yǎng)皿上菌落數(shù)（CFU），計(jì)算噴霧干燥后活菌總數(shù)，其公式如下：

式中：N0為噴霧干燥后活菌總數(shù)，CFU/g；N為噴霧干燥前益生菌菌粉中的活菌總數(shù)，CFU/g。

1.3.4 抗熱保護(hù)劑的優(yōu)選

（1）單一抗熱保護(hù)劑優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

在查閱文獻(xiàn)[6，8，17-18]基礎(chǔ)上，選取糖和蛋白質(zhì)作為抗熱保護(hù)劑。糖類保護(hù)劑包括海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、麥芽糖和蔗糖，蛋白質(zhì)類保護(hù)劑包括脫脂奶粉、乳清粉、大豆蛋白和蛋清粉。各保護(hù)劑均設(shè)置2%、5%和8%三個(gè)水平，以菌體存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)每個(gè)抗熱保護(hù)劑菌體存活最高的組和不加任何抗熱保護(hù)劑的對(duì)照組（CK）進(jìn)行均數(shù)差異多重比較。選擇菌體存活率較高的抗熱保護(hù)劑繼續(xù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

（2）抗熱保護(hù)劑配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

利用中心組合設(shè)計(jì)（CCD）響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合抗熱劑配方[19]，各因素設(shè)計(jì)5個(gè)水平，即±r（上下星號(hào)臂），±1（上下水平點(diǎn)）和0（本試驗(yàn)中心點(diǎn)設(shè)置6個(gè)）。研究海藻糖添加量（X1）、蔗糖添加量（X2）和脫脂奶粉添加量（X3）對(duì)菌體存活率（Y）的影響。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素、水平與編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）（n=3）。采用SPSS Statistics25進(jìn)行單因素方差分析，選用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)進(jìn)行均值多重比較，顯著性水平選用α=0.05；P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。均數(shù)多重比較僅比較每種單一保護(hù)劑中菌體存活率最高的一組與沒有添加保護(hù)劑的對(duì)照組的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長(zhǎng)曲線測(cè)定

按5%（V/V）接種量將種子液接種于發(fā)酵罐中，37 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)48 h，每隔2 h取樣測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（A600nm），以培養(yǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)、A600nm為縱坐標(biāo)繪制菌體生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 枯草芽孢桿菌Prob1822生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis Prob1822

由圖1可以看出，0～4 h內(nèi)菌體數(shù)量增長(zhǎng)較為緩慢，為滯后期；6～20 h內(nèi)菌體增長(zhǎng)速度較快，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。其中8 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，16 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，20 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期。20 h之后菌體增長(zhǎng)速率放緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。菌體培養(yǎng)30 h以后數(shù)量呈下降趨勢(shì)，特別是培養(yǎng)36 h后菌體進(jìn)入衰亡期。為系統(tǒng)研究熱誘激處理對(duì)不同生長(zhǎng)階段菌體的菌體存活率影響，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期（8 h）、中期（16 h）、末期（20 h）及穩(wěn)定期（26 h）進(jìn)行熱誘激處理，以提高菌體的熱耐受性和菌體存活率。

2.2 熱誘激處理對(duì)菌體存活率的影響

試驗(yàn)考察不同熱誘激溫度（50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）和熱誘激時(shí)間（10 min、30 min、60 min）對(duì)枯草芽孢桿菌對(duì)數(shù)早（8 h）、中期（16 h）、末期（20 h）和穩(wěn)定期（26 h）菌體存活率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 熱誘激處理對(duì)菌體存活率的影響Fig.2 Effect of thermal-inducible shock treatment on cell survival rate

由圖2可以看出，在同一熱誘激溫度條件下，不同菌齡間的菌體存活率均存在顯著差異（P＜0.05）。熱誘激溫度為50 ℃時(shí)，穩(wěn)定期（26 h菌齡）菌體熱耐受性最好，特別是穩(wěn)定期菌體熱誘激處理10 min的樣本菌體存活率最高（85.59±0.17）%，與熱誘激30 min（83.73±0.26）%和60min（82.50±0.31%）的菌體存活率存在顯著差異（P＜0.05）；熱誘激溫度為55 ℃時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（20 h）和穩(wěn)定期（26 h）菌齡熱誘激10 min和30 min時(shí)，菌體存活率差異不顯著（P＞0.05），但熱誘激處理60 min時(shí)，存在顯著差異（P＜0.05）；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期與穩(wěn)定期菌株熱誘激10 min時(shí)菌體存活率分別為（87.46±0.15）%和（87.26±0.11）%，差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)熱誘激溫度為60 ℃和65 ℃時(shí)，熱誘激10 min的穩(wěn)定期菌體存活率均最高，分別為（79.96±0.13）%和（80.27±0.13）%，與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早、中期的不同熱誘激時(shí)間的樣本的菌體存活率均存在顯著差異（P＜0.05）。

對(duì)于相同菌齡的菌體在不同熱誘激溫度條件下（熱誘激時(shí)間相同），50 ℃和55 ℃溫度條件下菌體存活率相對(duì)較高，特別是熱誘激溫度為55 ℃時(shí)菌體熱耐受性最好，菌體存活率最高（87.26±0.11%）。55 ℃熱誘激30 min和60 min后，菌體存活率分別為降至（86.18±0.06）%和（83.50±0.23）%，差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)熱激溫度達(dá)60 ℃和65 ℃時(shí)，菌體熱耐受性變差，菌體存活率較低，該研究結(jié)果與TEIXEIRA P等[20]結(jié)論一致。因此，熱誘激溫度和熱誘激時(shí)間的優(yōu)選對(duì)于提高菌體熱耐受性和菌體存活率極為重要。熱誘激處理能增強(qiáng)菌體熱耐熱性主要是由于熱誘激處理可誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生高度保守?zé)釕?yīng)激蛋白，并作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)合成、折疊、裝配、運(yùn)輸和降解等生化過程，激發(fā)益生菌逆境下的熱抵抗力[21-23]。

由圖2還可看出，相同熱激溫度條件下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（20 h）和穩(wěn)定期（26 h）菌體熱耐受性相對(duì)較好，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期和中期熱耐受性相對(duì)較差[24]?？赡苁且?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)早、中期的細(xì)胞菌體代謝非常活躍，胞內(nèi)細(xì)胞器和生物大分子對(duì)熱更趨敏感，特別是在熱誘激溫度較高（如＞60 ℃）時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞器及胞內(nèi)生物大分子產(chǎn)生熱損傷?？紤]到后續(xù)的噴霧干燥過程中熱損傷和脫水干燥可能對(duì)益生菌菌體的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)生物大分子或細(xì)胞器的可逆或不可逆損傷[6，23-24]和保持較高的菌體存活率，本試驗(yàn)選擇穩(wěn)定期菌株進(jìn)行熱誘激處理，熱誘激參數(shù)為55 ℃、10 min。

2.3 抗熱保護(hù)劑優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

考察了糖類和蛋白質(zhì)類抗熱保護(hù)劑對(duì)菌體存活率的影響，以未添加抗熱保護(hù)劑的菌體存活率作對(duì)照，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，糖類保護(hù)劑與對(duì)照相比均存在顯著性差異（P＜0.05），說明糖類保護(hù)劑對(duì)菌體均存在較好的抗熱保護(hù)作用。在不同保護(hù)劑添加量的對(duì)比試驗(yàn)中，以8%海藻糖、5%蔗糖、8%甘露醇、8%山梨醇和5%麥芽糖試驗(yàn)條件下菌體存活率相對(duì)較高，特別是8%海藻糖和5%蔗糖條件下菌體存活率最高，分別為（80.92±0.17）%和（80.29±0.46）%，差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他糖類保護(hù)劑（P＜0.05）；甘露醇組（8%）、山梨醇組（8%）和麥芽糖組（5%）組間菌體存活率差異不顯著（P＞0.05），與乳糖組（5%）有顯著差異（P＜0.05）。因此，選擇海藻糖和蔗糖進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面法優(yōu)化。糖類保護(hù)劑對(duì)菌體能實(shí)現(xiàn)抗熱保護(hù)的原因是因?yàn)樘穷愇镔|(zhì)主要通過結(jié)構(gòu)中的羥基與細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜或蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成眾多氫鍵或在蛋白質(zhì)表面形成水化層，從而保護(hù)細(xì)胞（器）膜及蛋白質(zhì)生物大分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[14，25]。如海藻糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基可以極性基團(tuán)形成氫鍵，代替極性基團(tuán)周圍丟失的水分子，形成水化層，維持生物大分子天然結(jié)構(gòu)與細(xì)胞（器）膜的完整性[8，18]，糖類保護(hù)劑還可起到滲透保護(hù)[25]。

圖3 單一抗熱保護(hù)劑對(duì)枯草芽孢桿菌Prob1822菌體存活率的影響Fig.3 Effect of single anti-thermal protectant on cell survival rate of Bacillus subtilis Prob1822

由圖3還可知，蛋白質(zhì)類抗熱保護(hù)劑與對(duì)照組相比也存在顯著差異（P＜0.05），其中，以脫脂奶粉（5%）菌體存活率最高（81.36±0.23）%，與其他蛋白質(zhì)類保護(hù)劑存在顯著性差異（P＜0.05）；乳清粉組（5%）、大豆蛋白組（5%）和蛋清粉組（5%）組間差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇脫脂奶粉進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化。蛋白質(zhì)類保護(hù)劑對(duì)菌體實(shí)現(xiàn)抗熱保護(hù)的原因主要是通過“包埋”在菌體表面形成“隔熱屏障”實(shí)現(xiàn)抗熱保護(hù)[11]。脫脂奶粉的多孔結(jié)構(gòu)可使菌體干燥過程中失水更容易[26]。

糖類保護(hù)劑與蛋白質(zhì)類保護(hù)劑相比，脫脂奶粉（5%）與海藻糖（8%）和蔗糖（5%）差異不顯著（P＞0.05），均可以對(duì)枯草芽孢桿菌實(shí)現(xiàn)較好的抗熱保護(hù)并保持較高的菌體存活率。糖類和蛋白質(zhì)類抗熱保護(hù)劑的抗熱保護(hù)機(jī)制不同，兩者聯(lián)用能起到更好的抗熱保護(hù)[6，8，22]。鑒于脫脂奶粉、蔗糖和海藻糖組菌體存活率相對(duì)較高，且糖類與蛋白質(zhì)類保護(hù)劑的抗熱保護(hù)機(jī)制不同，為充分發(fā)揮復(fù)合抗熱保護(hù)劑的保護(hù)效果，選擇海藻糖、蔗糖和脫脂奶粉聯(lián)用作為復(fù)合抗熱保護(hù)劑，以進(jìn)一步提高對(duì)菌體的抗熱保護(hù)效果。

2.4 復(fù)合抗熱保護(hù)劑的響應(yīng)面優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以菌體存活率（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化技術(shù)對(duì)海藻糖添加量（X1）、蔗糖添加量（X2）和脫脂奶粉添加量（X3）進(jìn)行配方優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

對(duì)表2數(shù)據(jù)通過Design-Expert 10.0分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立多元二次回歸方程：Y=94.22+6.53X1+3.80X2+2.01X3-3.56X1X2+0.22X1X3-2.09X2X3-8.01X12-5.32X22-0.89X32。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可看出，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.835 1＞0.05，不顯著，表明回歸方程擬合程度良好，可用此模型對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型信噪比（signal to noise ratio，SNR）是評(píng)價(jià)和應(yīng)用模型進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合和評(píng)價(jià)結(jié)果預(yù)測(cè)受干擾的程度，常要求SNR＞4[19]。本模型SNR=45.497＞4，說明模型抗干擾較好；模型變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）是衡量模型精密度和可靠性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，數(shù)值越小表示模型精密度越高，本模型=1.27%，表明模型可靠。模型決定系數(shù)R2=0.994 8，表明模型在99.48%程度上能夠解釋菌體存活率與各因素變量之間的關(guān)系，而調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.990 1，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有較好的相關(guān)性。各階系數(shù)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，模型一次項(xiàng)X1，X2，X3、交互作用項(xiàng)X1X2，X2X3以及二次項(xiàng)X12，X22對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)X1X3影響不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)X32影響顯著（P＜0.05）。

觀察兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可采用降維分析（dimension reduction analysi，DRA），即其他因素保持在零水平情況下，觀察兩個(gè)因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響并得到其響應(yīng)面及等高線見圖4。由圖4可以看出，交互作用項(xiàng)X1X2，X2X3影響顯著，而X1X3影響不顯著。

圖4 海藻糖、蔗糖和脫脂奶粉添加量交互作用對(duì)菌體存活率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of interaction between trehalose,sucrose and skimmed milk powder addition on cell survival rate

將回歸方程分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)數(shù)并令其等于零，聯(lián)立可得到三元一次方程組，通過規(guī)劃求解可求出回歸方程編碼水平最優(yōu)解，即X1=0.41，X2=0.02，X3=1.00，對(duì)應(yīng)因素實(shí)際水平為海藻糖8.975 8%、蔗糖5.023 8%及脫脂奶粉6.78%。為操作方便，將各保護(hù)劑添加量修正為海藻糖9.0%、蔗糖5.0%和脫脂奶粉6.8%。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，菌體存活率為（95.24±0.84）%，與模型預(yù)測(cè)值96.762 1%接近。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，熱誘激處理能提高菌體的熱耐受性和菌體存活率，最佳熱誘激條件為穩(wěn)定期菌體55 ℃熱處理10 min；糖類保護(hù)劑中以8%海藻糖與5%蔗糖抗熱保護(hù)效果較好；蛋白質(zhì)類抗熱保護(hù)劑以5%脫脂奶粉抗熱保護(hù)效果較好。采用中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)研究了海藻糖（X1）、蔗糖（X2）和脫脂奶粉（X3）聯(lián)用作為復(fù)合抗熱保護(hù)劑對(duì)菌體存活率的影響，并對(duì)復(fù)合抗熱保護(hù)劑配方進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了優(yōu)化的抗熱保護(hù)劑組分，即海藻糖添加量9.0%、蔗糖添加量5.0%和脫脂奶粉添加量6.8%。在此最優(yōu)條件下，菌體存活率為（95.24±0.84）%，與模型預(yù)測(cè)值96.762 1%接近。研究結(jié)果表明，糖類保護(hù)劑與蛋白質(zhì)類保護(hù)劑聯(lián)用作為復(fù)合抗熱保護(hù)劑比單一保護(hù)劑抗熱保護(hù)效果更好，可較好的實(shí)現(xiàn)對(duì)益生菌枯草芽孢桿菌的抗熱保護(hù)，能較好的提高菌體的熱耐受性。