樊欣鈺，陸敏,任杰

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是胃腸功能紊亂的一種腹痛伴隨著排便或者其他腸道習慣改變的綜合征[1-2]。腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)是其最常見的一個亞型。目前，尚未有權(quán)威機構(gòu)對其發(fā)病原因及發(fā)病機制做出明確解釋，也未有明確療效的治療藥物，只知其可能與內(nèi)臟的敏感性增高、腦-腸軸的功能異常、消化道微生物的紊亂、胃腸道動力學的異常、精神心理等有關(guān)。近年來，隨著研究的深入，針對IBS的治療已經(jīng)從針對胃腸道自身的治療上升為針對與其相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)，即羅馬IV所指出的腦-腸軸調(diào)控系統(tǒng)，同時將精神心理等因素納入研究范圍，從局部逐漸向整體入手，中醫(yī)優(yōu)勢更為凸顯。

5-HT3受體，作為5-羥色胺(serotonin，5-HT)受體的亞型之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸神經(jīng)系統(tǒng)周邊出現(xiàn)的配體門控離子通道，可同時調(diào)節(jié)興奮性和抑制性神經(jīng)傳導物質(zhì)的傳遞。5-HT參與調(diào)節(jié)消化道感覺、運動和分泌功能，在神經(jīng)突觸間隙與突出后膜5-HT3受體結(jié)合后迅速分離后，大部分被突觸前膜的受體再次攝取回收、儲存[3]。5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，SERT)是對5-HT有高度親和力的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，能夠重新攝取細胞間隙內(nèi)的5-HT，從而起到滅活5-HT的作用，影響胃腸道的運動，引起腹痛、腹瀉等臨床癥狀。

近年來，中醫(yī)藥在治療IBS方面取得了良好的治療效果，并且毒副作用低，其開發(fā)前景。本研究采用名醫(yī)驗方“腸康方”干預內(nèi)臟高敏感IBS-D模型大鼠(番瀉葉疊加束縛刺激法)，解析其中藥復方的多成分多靶點的的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，挖掘并傳承名老中醫(yī)驗方。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

成年健康清潔級Wistar大鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(上海)2013-0016)，在江蘇省中醫(yī)藥研究院SPF級實驗動物中心喂養(yǎng)，許可證號：SYXK(蘇)2016-0018，環(huán)境溫度(23±3)℃，濕度(55±5)%，自然光照，自由進食。

1.2 實驗藥物

番瀉葉、白芍、防風、熟地黃、菟絲子、黃連、金蕎麥、蟬蛻，由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。

匹維溴銨片，生產(chǎn)廠家：Abbott Products SAS，規(guī)格：每片50 mg，批號：H20120127。

1.3 實驗試劑及儀器

水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精-伊紅染色液，武漢Boster生物工程有限公司；10%甲醛，西隴化工股份有限公司；Anti-ACTH抗體，英國Abcam公司(ab74976)；Anti-VIP抗體，英國Abcam公司(ab22736)；Anti-Substance P抗體，英國Abcam公司(SP-DE4-21)。

石蠟切片機，德國zeiss公司Microm-340E；組織脫水機，英國shandon公司Hypercenter-xp；組織包埋機，英國shandon公司Histocentre-2；電子顯微鏡，Olympus公司；電子秤，上海浦春計量儀器有限公司；Image Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)；Logene PA9000病理圖像分析系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 IBS-D模型建立

造模組造模：參考[4]造模方法，番瀉葉5倍體積的開水中浸泡一夜取濾液，濃縮至濃度為0.3 g/mL，灌胃體積為10 mL/kg，1次/日，在番瀉葉水灌胃1 h后用自制容器及繃帶束縛大鼠的四肢，限制大鼠運動的同時產(chǎn)生一定的刺激，束縛大鼠使得其煩躁不安，持續(xù)2 h，持續(xù)2周?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不采取任何措施。

2.2 模型評價

大鼠一般情況：造模期間精神狀態(tài)、活動、大鼠毛發(fā)、食欲、體質(zhì)量和糞便等。腹壁撤退反射評分(abdominal withdrawal reflex,AWR)；結(jié)腸組織病理學檢查：空白組及模型組分別隨機選取雌雄各1只。

2.3 動物分組與干預方法

采用隨機分組法將造模成功的大鼠分成5組，模型對照組、陽性藥物組、腸康方高劑量組(H-CKF)、腸康方中劑量組(M-CKF)和腸康方低劑量組(L-CKF)，每組10只。

將“腸康方”七味中藥飲片(白芍15 g，防風6 g，熟地黃5 g，菟絲子5 g，金蕎麥8 g，黃連3 g，蟬蛻3 g)先加入10倍水中煎煮1.5 h，倒出煎液再加入8倍體積的水中煎煮同樣時間，合并2次煎液濃縮，根據(jù)60 kg/200 g人鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)w=6.25計算等效劑量，配成0.47 g/mL、0.94 g/mL、1.88 g/mL藥液，給藥體積為2 mL/只。

陽性藥濃度：參照文獻[5]配成濃度為1.5 mg/mL的藥液，給藥體積為2 mL/只。

正常組及模型對照組予等體積蒸餾水。

給藥頻次：每日1次，固定在上午8:00～10:00點間，持續(xù)2周。

2.4 觀察指標及檢測方法

2.4.1 一般情況

觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、飲食、活動和體質(zhì)量變化、排便情況等。

2.4.2 AWR評分

對各組大鼠造模后及藥物干預后進行AWR評分。具體操作如下[6]：操作前禁食不禁水12 h，操作時將大鼠放入玻璃容器(自制)中，限制其運動，使其只能前后運動。先將2 mL注射器連接到血壓計上，向血壓計中注氣，分別記下10、20、40、60、80 mmHg所對應(yīng)的刻度，探后將注射器連接到8F導尿管。由注射器向?qū)蚬苤凶猓⑦_到相應(yīng)的刻度，表示導尿管前端球囊內(nèi)的壓力為相應(yīng)的壓強。將導尿管(型號：8F)自肛門插入，待球囊末端伸入肛門約1 cm。待大鼠平穩(wěn)安靜后，向?qū)蚬軆?nèi)注氣，使球囊內(nèi)壓強分別為10、20、40、60、80 mmHg。每個壓強分別持續(xù)20 s，觀察大鼠在各個壓強下的反應(yīng)，對其進行半定量評分。每個壓力下重復3次并評分，取其平均值并記錄。

評分標準參照文獻[7]，按照刺激大鼠時的表現(xiàn)評分：0分，無行為反應(yīng)；1分，僅頭部短暫運動，身體不動；2分，腹部肌肉收縮，但未抬離底面；3分，腹肌收縮并抬離底面；4分，骨盆抬起，身體呈弓形。

2.4.3 5-HT3受體及5-HT轉(zhuǎn)運體平均光密度值

處死動物后，取全腦和近直腸端約1 cm結(jié)腸，固定在甲醛中，石蠟包埋，切片后行免疫組化染色。免疫組化染色后，顯微鏡下觀察，每個標本隨機選取5個視野，以細胞核出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性反應(yīng)，無棕黃染色為陰性，每個視野利用拍攝器截取圖像。應(yīng)用Image Pro Plus 軟件測定其陽性表達的光密度(optical density,OD)值進行半定量分析，取其平均值。以測定結(jié)腸組織中5-HT受體及轉(zhuǎn)運體水平。棕黃染色越多，OD值越大，5-HT受體及轉(zhuǎn)運體表達水平越高。

2.5 統(tǒng)計分析

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠一般情況觀察

空白組大鼠精神良好，毛色亮白，體型適中，活動敏捷，體質(zhì)量增長率25.22%，造模及藥物干預期間大便正常，造模后大便變軟，或成稀狀、稀水狀，隨著時間推移情況無明顯好轉(zhuǎn)。

模型組大鼠造模期間精神狀態(tài)較差，毛色干枯，隨著造模的繼續(xù)，發(fā)現(xiàn)大鼠活動、飲食、飲水較正常組都略有減少且喜抱聚成團，體質(zhì)量無增加；予等體積蒸餾水2周后，體質(zhì)量增長率為10.19%。

陽性藥及各濃度腸康方干預大鼠組，造模期間及造模后狀態(tài)同模型對照組；藥物干預后，各組間大鼠差異不明顯，均表現(xiàn)出精神轉(zhuǎn)好，毛發(fā)逐漸恢復光亮，飲食、活動均增多，詳見圖1，各組增長率分別為17.14%、25.54%、29.69%、23.38%，藥物干預后，腹瀉逐漸消失，大便逐漸恢復正常。

A：空白組；B：模型對照組；C：陽性藥組；D：腸康方高劑量組；E：腸康方中劑量組；F：腸康方低劑量組圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

3.2 IBS-D大鼠造模情況

造模期間死亡3只，其中1只為束縛捆綁時死亡，分析與捆綁時姿勢、力度不當相關(guān)；另2只死亡，考慮因灌胃技術(shù)或飲食減少等導致。給藥期間，各組大鼠均無死亡。

在觀察大鼠一般情況、排便情況的同時，結(jié)合AWR評分和結(jié)腸粘膜組織形態(tài)學觀察，判斷大鼠造模成功率，各組大鼠造模情況如表1所示。分別選取空白組、造模組雌雄各1只，共4只，觀察其腸粘膜組織形態(tài)，空白組為正常粘膜；造模組腸黏膜見灶性淋巴細胞、小膿腫，提示炎癥可能，如圖2所示。

表1 各組大鼠造模情況

3.3 AWR評分結(jié)果

造模結(jié)束后，與空白組相比，造模組大鼠在10、20、40、60、80 mmHg球囊壓力下的AWR的評分均顯著升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示：模型組大鼠內(nèi)臟呈高敏感。結(jié)果見表2。

A、B：空白組；C、D：模型對照組圖2 造模后空白組和造模組腸黏膜組織

表2 造模后大鼠AWR評分

注：與空白組相比，*P<0.01

表3 大鼠AWR評分

注：與空白組相比，*P<0.01；與模型對照組相比，##P<0.05，#P<0.01

藥物干預結(jié)束后，與模型對照組相比，腸康方高中低劑量組及陽性藥組大鼠在各壓力下的AWR評分均下降。同時在10、20、40、60 mmHg球囊壓力下，各組AWR評分均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在80 mmHg壓力下，陽性藥組、腸康方高劑量組、腸康方低劑量組AWR評分低于模型對照組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示：藥物干預組大鼠內(nèi)臟高敏感均有所減輕。見表3。

3.4 5-HT3受體及5-HT轉(zhuǎn)運體的表達

與空白組相比，模型對照組大鼠腸組織中5-HT3R棕黃染色陽性表達細胞分布相對較密集，光密度OD值升高；SERT棕黃染色陽性表達細胞分布相對較分散，光密度OD值降低。

藥物干預結(jié)束后，腸康方高中低劑量組、陽性藥組大鼠腸組織中5-HT3R較模型對照組光密度OD值均降低， SERT光密度OD值均升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但在各濃度之間未見明顯相關(guān)性；

提示：腸康方高中低劑量組、陽性藥物組均能夠降低IBS-D模型大鼠腸組織中5-HT3R的表達，腸康方高中低劑量組、陽性藥物組均能夠升高IBS-D模型大鼠腸組織中SERT的表達，見表4。

表4 各組大鼠腸組織中5-HT3受體及5-HT轉(zhuǎn)運體光密度值

注：與模型對照組相比，*P<0.01，**P<0.05

顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果，可見所有切片中均可見多少不等的5-HT3R、SERT陽性表達的細胞，陽性細胞大多為圓形或橢圓形，有棕黃色顆粒。圖3顯示模型對照組較空白組比棕黃染色顆粒明顯增多；給藥后與模型對照組相比，陽性藥組、腸康方高中低劑量組陽性表達顆粒明顯減少。圖4顯示與空白組比較，模型對照組陽性表達細胞明顯減少，各給藥組陽性表達細胞增多。

4 討論

IBS的病理機制目前尚未完全明確，涉及內(nèi)臟高敏感、腦-腸軸異常、消化道感染、胃腸動力異常以及精神心理等多方面。近年來，隨著羅馬Ⅳ的出臺人們越來越關(guān)注“腦-腸軸學說”，認為IBS發(fā)病與神經(jīng)免疫內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控不平衡相關(guān)，大腦接收來自胃腸道的持續(xù)內(nèi)感受輸入信號，將這些信號與來自身體的其他內(nèi)感受信號相互整合，向胃腸道內(nèi)的各種靶細胞發(fā)送。

IBS-D治療的目標是緩解癥狀和改善生活質(zhì)量，目前西醫(yī)治療以對癥治療為主。中醫(yī)在IBS-D的治療方面具有較好的療效，近年來，IBS-D已成為中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢病種之一。名老中醫(yī)驗方“腸康方”，前期在臨床反饋療效較好，已獲得國家發(fā)明專利和藥物臨床批件，方中重用白芍養(yǎng)血柔肝、收斂肝氣、減少腸蠕動，防風入肝疏肝氣、化水濕、疏脾止瀉，兩藥共用，木能疏土，健脾調(diào)肝，共為君藥。臣用熟地、菟絲子補腎陰腎陽，補腎火溫脾胃，而黃連清心降火，三藥同用，則心腎交通，情志得遂。金蕎麥、蟬蛻為佐藥，金蕎麥清肺熱，肺合大腸，肺降則腸安；蟬蛻入肝經(jīng)入肺經(jīng)，消風解痙，減輕腸道痙攣。全方調(diào)和肝脾、交通心腎、緩痛止瀉、寧神暢情?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白芍內(nèi)的主要活性成分白芍總苷可通過阻斷信號通路、抑制免疫細胞等方式緩解炎癥反應(yīng)[8-9]，減緩疼痛[10-12]；劉振清等將大鼠結(jié)腸平滑肌分離，通過對照試驗觀察防風其收縮運動的影響發(fā)現(xiàn)防風能夠抑制其平滑肌收縮[13]。熟地黃首載于《本草圖經(jīng)》，作用于人體可增加人體免疫力，具有抗腫瘤、促進血液再生、抑制機體衰老等效果[14]。菟絲子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其可以調(diào)節(jié)免疫、抗衰老保護生殖系統(tǒng)、調(diào)節(jié)代謝和內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)心血管、營養(yǎng)神經(jīng)、改善記憶、抗疲勞等作用[15]。黃連其主要有效成分小檗堿、黃連堿等能夠廣譜抗菌，并且具有緩解炎癥、清熱、抗細菌毒素、治療腹瀉、抗病原體、抑制腫瘤等藥理作用[16]。范萬里發(fā)現(xiàn)，金蕎麥提取物可降低其血清炎癥水平[17]。蟬蛻首載于《名醫(yī)別錄》[18]，具有抗腫瘤和解熱鎮(zhèn)痛的效果[19]。本實驗選擇的陽性藥為“匹維溴銨”，選擇性腸平滑肌鈣離子拮抗劑，能夠緩解患者腹痛以及整體癥狀，是《中國腸易激綜合征專家共識意見(2015)》推薦的臨床常用藥物，國際上多個指南與共識意見也將其列為一線藥物[20-21]。實際應(yīng)用中也有諸多報道[22-24]顯示選用匹維溴銨對腹痛、腹部不適、腹瀉和IBS-D其他癥狀有顯著改善。

A：空白組； B：模型對照組； C：陽性藥組； D：腸康方高劑量組；E：腸康方中劑量組； F：腸康方低劑量組圖3 各組大鼠腸組織5-HT3結(jié)果(免疫組化染色，×200)

A：空白組； B：模型對照組； C：陽性藥組； D：腸康方高劑量組；E：腸康方中劑量組； F：腸康方低劑量組圖4 各組大鼠腸組織SERT結(jié)果(免疫組化染色，×200)

本研究運用改良后的造模方法，來構(gòu)建IBS-D大鼠模型。研究觀察顯示“腸康方”能夠明顯改善IBS-D模型大鼠的腹瀉癥狀，能夠明顯降低其AWR評分(P<0.05)，改善腸道高敏感。5-HT3受體是一個五聚體復合體，由不同亞基組合而成的受體亞型對5-HT的反應(yīng)可能不同[25-26]，廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞。5-HT通過5-HT3受體誘導腸易激綜合征的內(nèi)臟痛覺和超敏反應(yīng)。5-HT3受體促使平滑肌收縮，并通過刺激神經(jīng)末梢乙酰膽堿的釋放增加腸道分泌[27]。腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜釋放5-HT與腹痛或不適的嚴重程度相關(guān)。此外，體外研究表明，腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜上清可提高大鼠腸系膜感覺神經(jīng)元的激活率，5-HT3受體拮抗劑格拉司瓊可使刺激作用減弱[28]。本研究中模型組大鼠較空白組大鼠5-HT3受體表達明顯增多(P<0.01)；匹維溴銨陽性對照組及“腸康方”高中低劑量組均可降低5-HT3受體OD值表達(P<0.05)。

藥理研究[29-30]和臨床研究[31-32]表明5-HT3受體拮抗劑是IBS患者的有效治療手段，內(nèi)源性5-HT失活的另一種方法依賴于內(nèi)源性生物胺的SERT。Gershon的小組通過一系列研究證明了SERT的功能作用。首先，他們證明了藥物5-羥色胺再攝取抑制劑抑制黏膜5-HT攝取，導致黏膜下神經(jīng)元對黏膜刺激反應(yīng)增強。第二，豚鼠絨毛上皮細胞失活5-HT釋放腸內(nèi)分泌細胞對黏膜刺激的反應(yīng)。上皮細胞表達SERT導致上皮細胞重新攝取5-HT，終止其對黏膜中的作用。第三，在轉(zhuǎn)基因小鼠中靶向刪除編碼SERT的基因會導致小鼠便秘和腹瀉之間腸道習慣的改變。這種轉(zhuǎn)運蛋白可以很好地調(diào)節(jié)大腦5-HT的神經(jīng)傳遞，在大腦皮層和邊緣區(qū)域有大量存在，這些區(qū)域與行為的情感方面有關(guān)。所以結(jié)合本實驗研究結(jié)果顯示，腸康方高中低劑量組、陽性藥物組均能夠升高IBS-D模型大鼠腸組織中SERT的表達(P<0.05)，從而起到緩解腸易激綜合征腹痛腹瀉等腸道癥狀。

綜上所述，“腸康方”能夠明顯改善IBS-D模型大鼠癥狀，改善其腸道高敏感狀態(tài)，明顯減少模型大鼠結(jié)腸組織中的5-HT3受體的表達、增強SERT的表達，同時，“番瀉葉灌胃+束縛刺激”的疊加復合因素造模方法可成功復制IBS-D大鼠模型，較好的模擬IBS-D的生物學特征。此外，天然藥物“腸康方”相較西藥匹維溴銨更具有副作用小、安全有效的優(yōu)勢。