腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)已被認(rèn)為是蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)產(chǎn)生不良預(yù)后的最主要危險(xiǎn)因素。如何早期診斷腦血管痙攣以及明確治療的靶點(diǎn)，成為目前急需解決的問題。本研究通過建立蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的大鼠模型，監(jiān)測(cè)大鼠腦循環(huán)的改變、腦微環(huán)境中致痙攣相關(guān)因子的監(jiān)測(cè)，研究龍琥醒腦顆粒在影響腦大動(dòng)脈及微環(huán)境方面的作用，嘗試闡明龍琥醒腦顆粒中有效成分影響腦內(nèi)環(huán)境的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與鑒定 選用80只成年SD雄性大鼠(均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí))，(275±25)g，建立蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣動(dòng)物模型。用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(40 mg/kg)后固定于腦立體定位儀上，使動(dòng)物保持30°的頭低位。沿中線縱行剪開長約3 cm的項(xiàng)部皮膚，鈍性分離皮下軟組織和肌層，暴露寰枕筋膜。用1 mL空針抽取股動(dòng)脈血約0.2 mL，換上PE10管制作的特殊針頭，行寰枕筋膜穿刺，垂直進(jìn)針約2 mm后回抽見有清亮腦脊液回流，緩慢將自體動(dòng)脈血按1 mL/kg在5～10 min內(nèi)緩慢注入枕大池。保持大鼠頭低位30°約30 min。筋膜穿刺處用明膠海綿加ZT膠修補(bǔ)封閉，并消毒縫合傷口。48 h后重復(fù)上述操作注入不抗凝的自體動(dòng)脈血約0.2 mL。隨機(jī)選取造模后大鼠進(jìn)行斷頭，取腦組織在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢查，按改良Fisher分級(jí)法[1]，確定造模后大鼠均達(dá)到≥Fisher分級(jí)1級(jí)。

1.2 藥物的制備與質(zhì)控 由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制劑室提供統(tǒng)一批號(hào)濃縮顆粒。 龍琥醒腦顆粒劑為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院傳統(tǒng)自制藥，有完善的流程及質(zhì)量控制章程，使用同一批號(hào)(201702028879)保證了復(fù)方藥效的穩(wěn)定，且質(zhì)量可控。

1.3 藥物處理及分組 將大鼠分為空白對(duì)照組20只、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH組)20只、和蛛網(wǎng)膜下腔出血+龍琥醒腦顆粒組(SAH+LH組)20只和蛛網(wǎng)膜下腔出血+尼莫地平對(duì)照組(SAH+Nimo組)20只。 以上每組再分別分成微循環(huán)監(jiān)測(cè)組(10只)與微透析組(10只)。SAH+LH組造模后予以龍琥醒腦顆粒劑溶液灌胃治療干預(yù)，SAH+Nimo組每日以尼莫地平片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)溶液灌胃，用藥量均根據(jù)體表面積計(jì)算，計(jì)算出相當(dāng)于成人等效治療量，每日2次給藥，連續(xù)給藥14 d?？瞻讓?duì)照組、SAH組每日以蒸餾水灌胃，大鼠均以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 運(yùn)用激光散斑襯比成像技術(shù)檢測(cè)微循環(huán)血流 將大鼠固定于腦立體定位儀上，調(diào)整成像的位置和焦距。用(635±2)nm波長的半導(dǎo)體激光源(Model KL5650，F(xiàn)orward Co.Ltd.Shanghai，China)照射被大鼠右頂部磨薄的頭骨觀察區(qū)域，通過架設(shè)在體視顯微鏡(XYH-05，Yongheng，Shanghai，China)上的12bit CCD(Pixelfly QE，Cooke，U.S)記錄激光散斑圖像。機(jī)分辨率為640(H)×480(V)像素。原始圖像通過實(shí)時(shí)在線的血流算法處理直接轉(zhuǎn)成流速信息，成像軟件為在線激光血流成像系統(tǒng)。CCD采集圖像時(shí)采用2×2 “Binning” 模式。采樣頻率為23 幀/s，曝光時(shí)間為5 ms。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的每一次圖像記錄點(diǎn)，連續(xù)采集400幀散斑圖像作為一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)于每一組記錄的400幀散斑圖像數(shù)據(jù)，選取中間的200幀進(jìn)行時(shí)間激光散斑襯比值的計(jì)算，得到腦皮層血流流速的二維分布圖。

1.4.2 運(yùn)用微透析法持續(xù)提取腦脊液檢驗(yàn)乳酸(lactic，Lac)、丙酮酸(pyruvic acid，Pyru)及其比值(L/P)含量 采用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(40 mg/kg)并置于立體定位儀上，在冠狀縫及矢狀縫右側(cè)各2.5 mm處用牙科磨鉆做一直徑約2 mm的骨孔，用立體定向儀將透析引導(dǎo)管經(jīng)骨孔垂直插入右側(cè)頂葉皮質(zhì)表面，將微透析探針(半透膜長2.0 mm)經(jīng)引導(dǎo)管置于右頂葉腦皮質(zhì)，使探針半透膜(2.0 mm)完全置入腦皮質(zhì)內(nèi)，透析管通過連接管分別與微量注射泵及收集器相連，每天微量注射泵向微透析管提供商品化滅菌灌注液復(fù)方氯化鈉注射液(CNS)(濃度Na+147 mmol/L，K+4 mmol/L，Ca2+2.3 mmol/L，Cl-156 mmol/L)，灌注速度為0.5 μL/min。維持灌注平衡90 min后，腦透析液行反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測(cè)。測(cè)定Lac及Pyru各組分之峰值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自相應(yīng)濃度，得出相應(yīng)透析液中Lac、Pyru的實(shí)際含量，用以實(shí)時(shí)反映腦內(nèi)能量代謝狀況。

1.4.3 腦基底動(dòng)脈血管壁的組織病理學(xué)觀察 各組大鼠在完成微透析分析后，仰臥位固定麻醉后，于升主動(dòng)脈灌注0.9%氯化鈉溶液40 mL，至沖洗液色清，再以4.0%多聚甲醛灌注液150 mL灌注，灌注壓力120 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)。灌注完成后放置約10 min，然后斷頭切取腦基底動(dòng)脈中段，10%甲醛溶液固定、梯度脫水、石蠟塊包埋，5 μm厚度切片，HE染色后行光學(xué)顯微鏡檢查，觀察并采用顯微鏡計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(NIH Program Bethesda，Maryland，USA)測(cè)量基底動(dòng)脈血管管壁厚度和管腔橫截面積。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)后大鼠腦組織、腦動(dòng)脈血管標(biāo)本的大體及組織病理學(xué)觀察

2.1.1 大體觀察 造模后可見大鼠蛛網(wǎng)膜下腔血液或血凝塊環(huán)繞在大鼠大腦前動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈分叉處，腦干背側(cè)蛛網(wǎng)膜下腔可見明顯的凝血塊，腹側(cè)基底動(dòng)脈(basilar artery，BA)周圍也可發(fā)現(xiàn)凝血塊，但隨著時(shí)間的推移，周圍凝血塊大小和范圍逐漸減少?？瞻讓?duì)照組則整個(gè)蛛網(wǎng)膜下腔包括腦干腹側(cè)基底動(dòng)脈周圍均無血凝塊。詳見圖1。

圖1 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血造模后腦組織大體觀察

2.1.2 腦基底動(dòng)脈血管壁的組織病理學(xué)觀察 基底動(dòng)脈常規(guī)病理切片HE染色顯示，空白對(duì)照組管壁內(nèi)皮完整，結(jié)構(gòu)層次清晰，血管平滑肌細(xì)胞呈扁平狀，無卷曲，外層結(jié)締組織分布均勻且無炎性細(xì)胞。SAH組及兩個(gè)治療組造模后7 d時(shí)分別出現(xiàn)動(dòng)脈痙攣明顯，內(nèi)皮皺褶明顯，平滑肌層增厚明顯，管壁厚度厚薄不均，平滑肌細(xì)胞排列紊亂、卷曲皺褶，細(xì)胞外間質(zhì)增多，外層可見炎性細(xì)胞浸潤；14 d時(shí)SAH 組及兩個(gè)治療組分別出現(xiàn)動(dòng)脈痙攣不同程度緩解，管壁褶皺改善，炎性細(xì)胞明顯減少，管壁厚度較前改變不明顯。詳見圖2。

圖2 腦基底動(dòng)脈HE染色(10×10)

2.1.3 各組基底動(dòng)脈橫截面積及管壁比較 基底動(dòng)脈血管管腔較大，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)較完整，SAH組、SAH+Nimo組及SAH+LH組見基底動(dòng)脈周圍有明顯的凝血塊，基底動(dòng)脈整體變細(xì)，管腔變窄伴管壁增厚，7 d時(shí)改變最明顯，14 d時(shí)管腔較前增大，但管壁仍增厚明顯。行HE染色后，圖像軟件測(cè)定基底動(dòng)脈橫截面積、血管壁厚度。詳見表1、表2。

組別只數(shù) 7 d 14 d空白對(duì)照組1010.77±1.110.92±1.21SAH組1062.64±2.611)56.16±4.271)SAH+Nimo組1024.92±2.981)2)24.24±2.521)2)SAH+LH組1026.72±2.711)2)23.79±3.531)2)F值 726.00 347.00P <0.01 <0.01

與空白對(duì)照組同期比較，1)P<0.01；與SAH組同期比較，2)P<0.01

組別只數(shù)7 d14 d空白對(duì)照組1054 523±1 70155 384±1 722SAH組1028 456±2 3761)28 076±1 9751)SAH+Nimo組1045 355±2 4611)2)43 598±2 4331)2)SAH+LH組1044 238±2 5771)2)47 435±3 0911)2)3)F值 198.00 211.00P <0.01 <0.01

與空白對(duì)照組同期比較，1)P<0.01；與SAH組同期比較，2)P<0.01；與SAH+Nimo組同期比較，3)P<0.01

2.2 激光散斑襯比成像技術(shù)檢測(cè)微循環(huán)血流 橘紅色變深表示該區(qū)域血流量。空白對(duì)照組(a、e)正常大鼠腦血流量在7 d和14 d時(shí)差別不大，SAH組大鼠7 d時(shí)(b)腦血流量明顯減少，14 d時(shí)(f)較前好轉(zhuǎn)，但仍明顯低于正常水平。而SAH+Nimo組(c)和SAH+LH組(d)在7 d時(shí)腦血流量較空白對(duì)照組減少，14 d時(shí)(g、h)較前稍有恢復(fù)，但仍低于正常腦血流量。SAH+Nimo組與SAH+LH組腦血流量在7 d和14 d時(shí)差異不明顯。詳見圖3。

圖3 腦皮層血流量的二維分布圖

2.3 各組腦脊液中Lac及Pyru含量比較(見表3)

組別只數(shù) Lac(mmol/L) 7 d 14 d Pyru(μmol/L) 7 d 14 d空白對(duì)照組100.77±0.120.74±0.1238.44±2.0637.96±2.05SAH組101.72±0.141)1.78±0.151)15.35±1.661)16.28±2.331)SAH+Nimo組101.32±0.151)2)1.03±0.161)2)20.41±2.631)2)25.24±2.241)2)SAH+LH組101.41±0.161)2)0.99±0.221)2)16.23±1.411)3)19.79±1.841)2)3)F值 71.10 66.10 263.70 172.60P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

與空白對(duì)照組同期比較，1)P<0.05；與SAH組同期比較，2)P<0.05；與SAH+Nimo組同期比較，3)P<0.05

3 討 論

腦血管痙攣是顱腦創(chuàng)傷或腦血管疾病所致蛛網(wǎng)膜下腔出血后，產(chǎn)生不良預(yù)后的最主要危險(xiǎn)因素。但因腦血管痙攣發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，早期診斷困難，幾乎50%的具有癥狀性腦血管痙攣的病人最終仍會(huì)發(fā)展為腦梗死，而15%～20%會(huì)發(fā)展為致殘的卒中或死亡[2]。

近年來，蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣發(fā)生的機(jī)制開始逐漸被闡明，有關(guān)其研究也已將注意力集中在血管內(nèi)皮的生理和病理生理過程。生理?xiàng)l件下血管平滑肌張力受內(nèi)皮依賴性舒張因子(EDRFs)和內(nèi)皮源性抑制因子(EDCFs)調(diào)節(jié)控制，腦血管阻力和腦血流量的相互關(guān)系主要取決于舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì)之間的平衡狀態(tài)。腦血管痙攣后腦循環(huán)動(dòng)力學(xué)明顯紊亂、腦血流循環(huán)障礙則導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[3]。研究表明，腦血管痙攣常發(fā)生在Willis主干動(dòng)脈和蛛網(wǎng)膜下腔積血較厚的區(qū)域，表現(xiàn)為局限性、節(jié)段性或彌漫性痙攣[4]。這與本研究結(jié)果一致，SAH組、SAH+Nimo組及SAH+LH組造模后7 d時(shí)分別出現(xiàn)了明顯的動(dòng)脈痙攣，內(nèi)皮皺褶明顯，平滑肌層增厚明顯，管壁厚度厚薄不均，平滑肌細(xì)胞排列紊亂、卷曲皺褶，細(xì)胞外間質(zhì)增多，外層可見炎性細(xì)胞浸潤；而14 d時(shí)SAH 組、SAH+Nimo組及SAH+LH組分別出現(xiàn)動(dòng)脈痙攣不同程度緩解，管壁褶皺改善，炎性細(xì)胞明顯減少。

目前針對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣這一并發(fā)癥，仍然沒有統(tǒng)一的治療方法。西醫(yī)治療目前主要集中在改善血流動(dòng)力學(xué)(擴(kuò)容升壓)、應(yīng)用氧自由基清除劑、鈣離子拮抗劑擴(kuò)張腦血管等方面，試圖對(duì)抗或逆轉(zhuǎn)腦血管痙攣。尼莫地平是鈣通道阻滯劑，是目前唯一被美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于腦血管痙攣治療的藥物，其通過阻滯L-型鈣通道而阻斷鈣離子內(nèi)流，以提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性，在一定程度上逆轉(zhuǎn)腦血管痙攣[5-6]。“3H療法”則被認(rèn)為是臨床上治療腦血管痙攣的基本方法，其提倡高血容量治療，以提高腦血流灌注，旨在改善腦循環(huán)障礙，但往往因?yàn)槌鲅竽X水腫的存在，不得不同時(shí)使用脫水藥緩解腦水腫，脫水藥物則會(huì)導(dǎo)致腦血流量、腦脊液減少，因而進(jìn)一步加重腦循環(huán)障礙[7-8]。故在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣病理過程中，腦循環(huán)的動(dòng)力學(xué)問題成為研究關(guān)鍵所在。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為顱內(nèi)出血屬“離經(jīng)之血”。《血證論》云：“既是離經(jīng)之血，雖清血、鮮血亦是淤血”。“血瘀”是蛛網(wǎng)膜下腔出血以及其后發(fā)生腦血管痙攣及其他一系列并發(fā)癥的基本病機(jī)。痰瘀互結(jié)，氣血逆亂，瘀血阻滯脈絡(luò)，氣血不得正常流布，腦失所養(yǎng)，元神失主，神機(jī)失用。國內(nèi)有學(xué)者進(jìn)行了部分中醫(yī)藥抗腦血管痙攣的研究，多集中在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及改善后遺癥方面，極少涉及腦循環(huán)動(dòng)力學(xué)研究[9-11]。我科自20世紀(jì)90年代起即嘗試從改善腦血供方面著手，對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血病人早期予以通竅活血湯加減進(jìn)行治療，并在此基礎(chǔ)上擬用龍琥醒腦湯，進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究與臨床研究，制成成藥龍琥醒腦顆粒，臨床療效佳且可靠。龍琥醒腦方中琥珀、桃仁、川芎、赤芍活血祛瘀，黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣補(bǔ)血活血，三七、白芷散瘀止痛，地龍、麝香、大黃清熱定驚、開竅通絡(luò)，共奏益氣活血、通絡(luò)安神之功用。前期研究表明龍琥醒腦顆粒能明顯促進(jìn)外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人腦血流的恢復(fù)，降低腦血管痙攣的發(fā)生率[12]；并能明顯改善創(chuàng)傷后記憶障礙[13]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明龍琥醒腦顆粒對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣有明顯的治療作用，其可緩解腦基底動(dòng)脈管壁痙攣增厚，并使管腔橫截面積增大，比較傳統(tǒng)抗腦血管痙攣的西藥尼莫地平，其在長期治療作用上更具優(yōu)勢(shì)。從激光散斑成像腦皮層血流的二維分布圖來看，龍琥醒腦顆粒在促進(jìn)腦血流恢復(fù)、改善腦循環(huán)方面具有一定的作用。

然而單純顱內(nèi)外大動(dòng)脈管腔的狹窄，這一機(jī)制仍不能完全解釋蛛網(wǎng)膜下腔出血后皮層抑制現(xiàn)象、血腦屏障機(jī)能障礙和腦血管反應(yīng)性改變，故有學(xué)者提出腦微循環(huán)機(jī)能障礙可能參與了蛛網(wǎng)膜下腔出血后的發(fā)病[14]。主要由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的血腦屏障，則是保證腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)，血腦屏障有賴于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)收縮，則導(dǎo)致血腦屏障受到破壞，從而進(jìn)一步導(dǎo)致腦內(nèi)微環(huán)境紊亂。葡萄糖作為大腦的主要供能物質(zhì)，首先需分解為Pyru再進(jìn)入有氧氧化。缺氧時(shí)，Pyru則被還原為Lac。生理情況下Lac也是中樞神經(jīng)的重要供能物質(zhì)。但當(dāng)大腦缺血與缺氧時(shí)，會(huì)出現(xiàn)Lac蓄積，Lac蓄積導(dǎo)致血腦屏障(blood brain barrier，BBB)受損和Na+-K+-ATP酶(鈉泵)活性受抑制，從而加重血管源性和細(xì)胞毒性腦水腫[15]。蛛網(wǎng)膜下腔出血病人出現(xiàn)腦缺血加重時(shí)，腦脊液中Lac含量和L/P比值增加，Pyru含量下降。故Lac和Pyru以及L/P一直被作為腦內(nèi)能量代謝相關(guān)指標(biāo)，其直接反映繼發(fā)性腦缺血性腦損害的微環(huán)境障礙情況[16]。在本研究中，SAH發(fā)生后7 d和14 d時(shí)，腦脊液中Lac含量均明顯增加，Pyru含量顯著下降，這與國內(nèi)外大部分研究的結(jié)論一致。而龍琥醒腦顆粒能明顯降低腦脊液中Lac的含量。這證明了龍琥醒腦顆粒在蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生腦血管痙攣的情況下，對(duì)腦內(nèi)微環(huán)境的改善有明顯作用。

中醫(yī)藥在腦出血及顱腦損傷治療方面的歷史悠久，有發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物的巨大潛力，如采用早期積極干預(yù)，辨證施治，中醫(yī)參與聯(lián)合治療措施，有望提高蛛網(wǎng)膜下腔出血搶救成功率，減少死亡率及后遺癥。本研究證明了龍琥醒腦顆?？梢酝高^血腦屏障，通過改變腦循環(huán)及腦內(nèi)微環(huán)境來達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減少繼發(fā)性損傷的作用。中藥復(fù)方在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣病理過程中，有改變腦循環(huán)動(dòng)力學(xué)及腦內(nèi)微環(huán)境的作用，為中醫(yī)藥在顱腦損傷方面的開發(fā)研究提供了新的思路和方法。 但龍琥醒腦顆粒為復(fù)方中藥制劑，藥理成分復(fù)雜，作用多樣，其各有效成分對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的協(xié)同作用及差別，仍有待進(jìn)一步研究。