高瑩瑩，胡 鵬，劉新富，黃 濱，劉 濱

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.內(nèi)江師范學(xué)院，四川內(nèi)江 641100）

暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）又名河鲀，是我國長江中下游地區(qū)重要淡水養(yǎng)殖種類，其營養(yǎng)價值豐富、肉質(zhì)鮮美，名列長江“四大名魚”之首。過去因受國內(nèi)市場禁止銷售的限制，大多數(shù)養(yǎng)殖河鲀以出口貿(mào)易的方式進(jìn)行銷售，因此養(yǎng)殖產(chǎn)量多年以來一直在10 000 t左右徘徊［1］，但隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的不斷優(yōu)化，養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，2015年養(yǎng)殖產(chǎn)量首次突破23 000 t［2］。2016年9月農(nóng)業(yè)部辦公廳和國家食品藥品監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布《關(guān)于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營的通知》，解除了自1990年開始實施的暗紋東方鲀不準(zhǔn)市場流通的禁令，國內(nèi)市場的開放為暗紋東方鲀產(chǎn)業(yè)的二次創(chuàng)業(yè)和可持續(xù)發(fā)展提供了新的契機(jī)。

暗紋東方鲀雌雄個體體長生長規(guī)律相似，但在2.5齡前雄魚體質(zhì)量生長速度大于雌魚［3］，且雄魚精巢被認(rèn)為是難得的珍貴食材，有“西施乳”的美譽(yù)。一對精巢的價值甚至超過雄魚本身，養(yǎng)殖全雄苗種的利潤是養(yǎng)殖普通苗種的1.5倍以上。因此，生產(chǎn)和養(yǎng)殖全雄暗紋東方鲀，可以大幅度提高我國暗紋東方鲀的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。但目前有關(guān)暗紋東方鲀的性別調(diào)控機(jī)制及其性控技術(shù)的研究還較少。

抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體（anti-Müllerian hormone receptorⅡ，Amhr2）基因?qū)儆?β-轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員，其編碼的是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶受體。Amhr2在抗苗勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，Amh）信號傳遞通路中起到關(guān)鍵的介導(dǎo)作用［4-6］，Amh只有與具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的Amhr2結(jié)合后才能進(jìn)一步結(jié)合并激活下游信號Smad蛋白，從而發(fā)揮生理功能［6-7］，如在哺乳動物中參與早期性別決定和性別分化的調(diào)控 等 過 程［4，8-9］，在 日 本 鰻 鱺 （Anguilla japonica）［10］、青 鳉 （Oryzias latipes）［11］和 黑 鯛（Sparus macrocephlus）［12］等魚類中通過抑制生殖細(xì)胞增殖和類固醇激素的合成等過程參與性腺的發(fā)育。在紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，amhr2基因激酶結(jié)構(gòu)域中的一個SNP位點與其性別決定相關(guān)，雌性個體為純合子 （His／His384），雄 性 個 體 為 雜 合 子 （His／Asp384）［13］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，暗紋東方鲀amhr2基因同樣存在一個類似的與性別相關(guān)的SNP位點，并據(jù)此建立了暗紋東方鲀的雌雄幼魚性別鑒定技術(shù)［14］。金武等［15］的研究也證實了在暗紋東方鲀1齡成魚的amhr2中，該SNP位點與性別表型存在顯著的相關(guān)性，雌性個體基因型為純合子CC，雄性個體基因型為雜合子CG。在此基礎(chǔ)上，本實驗以暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，?yīng)用RACE克隆技術(shù)，克隆得到amhr2的全長cDNA序列，并通過對暗紋東方鲀amhr2基因的序列結(jié)構(gòu)、相關(guān)生物信息學(xué)特征及不同組織和不同發(fā)育期中mRNA表達(dá)情況的研究，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)，同時為暗紋東方鲀性別調(diào)控過程中的分子機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用暗紋東方鲀樣本來源于江蘇省南通市中洋集團(tuán)股份有限公司，暗紋東方鲀親魚促熟培育后，采用LHRHa催產(chǎn)，人工授精獲得受精卵，受精卵在17.5～18.5℃水溫孵化7 d后，將孵化的仔魚布池培育，培育水溫為18.0～22.0℃。采用車間內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖，每日投喂2～3次，水溫為22～26℃。分別采集孵化后60、90、120、150日齡幼魚，每個日齡各取3尾魚，體長分別為（7.2±0.8）cm、（8.5±0.6）cm、（10.3±0.9）cm和（14.4±1.1）cm，分別剖取卵巢和精巢組織，保存在RNA Store液中備用，另外每個個體（或每尾魚）取少量肌肉組織，-20℃冷凍保存，用于DNA提取。

此外，隨機(jī)選取1齡雌魚和雄魚各3尾，分別剖取下丘腦 、腦、垂體、性腺、心臟、肝臟 、膽、胃、腸、肌肉、眼等組織，保存在RNA Store液中備用。

1.2 暗紋東方鲀遺傳性別鑒定

采用天根TIANamp Marine Animals DNA kit提取樣品肌肉的基因組DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度計測量DNA的濃度和OD260／OD280比值，1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性。根據(jù)暗紋東方鲀amhr2激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在一個與性別連鎖的錯義突變SNP位點，分別設(shè)計了擴(kuò)增雌雄性別差異基因序列的引物和含有針對SNP位點的錯配堿基的下游PCR引物，上游引物為 5′-GATGTTCCGCCATCCTGCATTC-3′，下游引 物 為 5′-CTGCCTGCTGCACAGAGCACCTG-3′，含錯配堿基的下游引物為 5′-GATACCATTTGTTGTGAAACTC-3′，采用雙重 PCR方法鑒定暗紋東方鲀幼魚的遺傳性別，其中第一輪PCR擴(kuò)增得到的基因片段送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，雄性個體在270 bp處出現(xiàn)條帶，而雌性個體不存在條帶（圖1），以此來判斷各個樣品的遺傳性別。

圖1 暗紋東方鲀PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig．1 The electrophoresis of PCR products in T．obscures

1.3 暗紋東方鲀amhr2全長cDNA序列的克隆

提取精巢組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，NanoDrop2000超微量分光光度計測量RNA的濃度。根據(jù)已知魚類amhr2的保守序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計擴(kuò)增引物，上游 引 物 為 5′-GGCTACCAGAGAAGCTACAAC-3′，下游引物為 5′-TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC-3′，克隆得到暗紋東方鲀amhr2基因的核心片斷序列。根據(jù)獲得的片段設(shè)計特異性引物，5′-RACE 的 特 異 性 引 物 為 5′-TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC-3′， 5′-TGGACTGGATGGCAACAATCA-3′，3′-RACE的特異性引物為 5′-GATGTTCCGCCTTCCTGCATTC-3′，5′-ACGTTGCGCTACATGTCCCCTG-3′，進(jìn)行全長序列擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)膠回收試劑盒（天根，北京）說明書對目的條帶切膠后進(jìn)行純化回收。切膠回收的PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體（全式金生物，北京）連接，采用熱激法將5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至20μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞（全式金生物，北京），在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單一克隆菌落繼續(xù)培養(yǎng)2 h。菌液PCR鑒定后，將含有目的條帶的菌液送至上海生工生物工程有限公司測序。

采用DNAstar軟件將5′-RACE、保守片段和3′-RACE的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得暗紋東方鲀amhr2基因的cDNA全長序列。

1.4 暗紋東方鲀Amhr2序列分析

采用BLAST程序?qū)Λ@得的全長序列進(jìn)行同源性分析并推斷其開放閱讀框序列；借助ExPASy ProtParam工具推斷Amhr2蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，包括相對分子質(zhì)量、等電點、氨基酸組成和總平均親水性等；利用PSORTⅡ Prediction工具定位蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞；利用SignalIP 4.1程序預(yù)測信號肽結(jié)構(gòu)；利用NetPhos 3.1 Server程序預(yù)測磷酸化位點；利用NetNGlyc 1.0程序預(yù)測糖基化位點；采用ExPASy ProtScale工具分析Amhr2蛋白質(zhì)的疏水性；采用TMHMM Server 2.0工具分析跨膜區(qū)；采用SMART和PROSITE工具分別分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域及其功能域位點；借助SOPMA和SWISS-ODLE工具分別預(yù)測Amhr2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。使用DNAMAN軟件進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)的氨基酸多重序列比對分析；利用MEGA 5.1軟件基于鄰位相接法（1 000 runs）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 暗紋東方鲀amhr2基因表達(dá)分析

采用Real-Time PCR方法檢測amhr2在暗紋東方鲀雌魚和雄魚不同組織和不同發(fā)育期性腺組織中的表達(dá)量。取出RNA Store保存液中保存的雌魚和雄魚各組織及不同發(fā)育期的性腺組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA。設(shè)計特異 性 引 物， 上 游 引 物 為 5′-GTGCTTGTGAGAGCCGATG-3′，下游 引 物 為 5′-AACTGATGCCGTGGAGGAG-3′，以第一鏈 cDNA稀釋梯度作模板，β-actin作內(nèi)參基因，內(nèi)參基因上游引物為 5′-CAGGGAGAAGATGACCCAGA-3′，下游引物為 5′-CATCACCAGAGTCCATGACG-3′，做模板cDNA稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，尋找最佳模板稀釋倍數(shù)，隨后以最佳稀釋倍數(shù)cDNA為模板，檢測amhr2在暗紋東方鲀雌魚和雄魚不同組織和不同發(fā)育期中的表達(dá)變化。實驗步驟參照SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒實驗操作說明，在Line Gene 9600型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

實時熒光定量PCR獲得一系列CT值，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法，用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，分析方法為單因素方差分析，即當(dāng)P＜0.05時為差異顯著，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀amhr2基因全長cDNA序列克隆

通過PCR反應(yīng)得到336 bp長度的CDS片段，采用RACE技術(shù)獲得暗紋東方鲀amhr2基因的5′和3′序列，序列拼接后得到 1 868 bp的cDNA全長序列。此序列編碼513個氨基酸，包括5′非編碼區(qū)133 bp和3′非編碼區(qū)193 bp，開放閱讀框1 542 bp（圖2）。且雄性個體amhr2H384是一個SNP位點，在第384位氨基酸處由組氨酸突變?yōu)樘於彼?，位于激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)（圖3）。預(yù)測的蛋白相對分子量為56.87 Ku，等電點為6.73，分子式為C2497H3952N706O753S30。成熟蛋白質(zhì)中含有帶負(fù)電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）和帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）分別為52和49個。不穩(wěn)定系數(shù)為52.14，屬于不穩(wěn)定蛋白。GRAVY（grand average of hydropathicity）為 -0.118，屬于親水性蛋白。

2.2 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及功能預(yù)測

圖2 暗紋東方鲀amhr2基因cDNA及其編碼的氨基酸序列Fig．2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of amhr2 gene in T．obscures

亞細(xì)胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Amhr2蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、分泌系統(tǒng)小泡、細(xì)胞膜、細(xì)胞外（包括細(xì)胞壁）的概率分別為44.4%、11.1%、11.1%、11.1%、11.1%、11.1%，由此可推測Amhr2蛋白質(zhì)最有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，屬于分泌蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，Amhr2蛋白質(zhì)在近N-端含有長度為21個氨基酸（1aa～21aa）的信號肽結(jié)構(gòu)（圖4-a）。糖基化位點預(yù)測的結(jié)果表明，其可能存在3個潛在的N-糖基化位點。磷酸化位點預(yù)測的結(jié)果表明，43個絲氨酸（Ser）、16個蘇氨酸（Thr）和8個酪氨酸（Tyr）可能會成為蛋白激酶磷酸化的位點。疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，Amhr2蛋白質(zhì)在100～200氨基酸處含有1個典型的疏水性區(qū)域。跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白在137～154氨基酸處含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，1～136位氨基酸在胞內(nèi)，155～513位氨基酸在胞外（圖4-b）。

保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，Amhr2蛋白在1～21、137～154和194～490氨基酸殘基處分別存在信號肽、跨膜區(qū)域和STYKc保守結(jié)構(gòu)域（圖5-a）。功能域預(yù)測結(jié)果表明，194～497氨基酸殘基處為蛋白激酶區(qū)域；200～208氨基酸處為核苷酸磷酸鹽結(jié)合位點；221位氨基酸為ATP配體結(jié)合位點；321位氨基酸為質(zhì)子受體活性位點（圖5-b）。

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，Amhr2二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（h）占38.40%，β-折疊（e）占 14.81%，β-轉(zhuǎn)角（t）占 5.46%，無規(guī)卷曲（c）占 41.33%（圖6），這種二級結(jié)構(gòu)組成可使得Amhr2蛋白的構(gòu)象多樣化。三級結(jié)構(gòu)同源建模分析結(jié)果顯示，建模范圍為188～498位氨基酸，覆蓋率為60%，這表明該結(jié)構(gòu)域的保守性比較高。由于到目前為止數(shù)據(jù)庫中還沒有其他物種Amhr2蛋白的三維模型，因此將暗紋東方鲀Amhr2蛋白的三維模型（圖7-a）與屬于同一家族的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPR2的三維模型（圖7-b）相比較，發(fā)現(xiàn)其構(gòu)型比較相似，這說明Amhr2具有類似于BMPR2構(gòu)型的三級結(jié)構(gòu)，且在不同的物種中具有保守性。

圖3 暗紋東方鲀PCR產(chǎn)物的測序峰圖Fig．3 The PCR product sequencing peak figures of T．obscures

圖4 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質(zhì)的信號肽剪切位點（a）和跨膜區(qū)域（b）Fig．4 Signal peptide splice site（a）and transmembrane region（b）of Amhr2 protein in T．obscures

圖5 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域（a）和功能域（b）Fig．5 Amhr2 protein conserved domain（a）and functional domain（b）in T．obscures

圖6 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)Fig．6 Secondary structure of Amhr2 protein in T．obscures

圖7 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質(zhì)（a）和人類BMPR2蛋白質(zhì)（b）的三級結(jié)構(gòu)模型Fig．7 Amhr2 protein of T．obscures（a）and BMPR2 protein of Homo sapiens（b）tertiary structure

2.3 暗紋東方鲀amhr2基因的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

登錄NCBI數(shù)據(jù)庫，將暗紋東方鲀amhr2的核苷酸序列與已知魚類的序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示暗紋東方鲀amhr2與紅鰭東方鲀（GeneBank： NM_001280009.1）、舌 齒 鱸（Dicentrarchus labrax，GeneBank：JQ801443.1）和青鳉（GeneBank：NM_001104896.1）的相似度分別為99%、73%和69%，這說明克隆得到的序列是amhr2基因。同時利用DNAMAN軟件對暗紋東方鲀amhr2編碼的氨基酸序列與GeneBank上其他8種動物的序列進(jìn)行氨基酸多重序列比對與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)近C-末端區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列比較保守，這表明此區(qū)域可能與amhr2生理功能的發(fā)揮有關(guān)（圖8）。根據(jù)暗紋東方鲀和其他物種的Amhr2氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為兩個大支：哺乳類聚為一大支，所有魚類聚為另一大支，其中暗紋東方鲀位于魚類這個分支中，且與紅鰭東方鲀緊密聚為一個小分支，親緣關(guān)系最近，與人和鼠等較高等脊椎動物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這表明暗紋東方鲀amhr2基因的系統(tǒng)進(jìn)化地位與傳統(tǒng)的物種進(jìn)化基本一致（圖9）。

圖8 暗紋東方鲀Amhr2與其他物種氨基酸序列比對圖Fig．8 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of T．obscures Amhr2 with the corresponding sequences from other species

圖9 不同物種Amhr2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig．9 Phylogenetic tree of Amhr2 amino acid sequence from different species

2.4 暗紋東方鲀amhr2基因的表達(dá)特征分析

本研究對暗紋東方鲀amhr2的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，amhr2僅在性腺中表達(dá)，與其他組織有顯著性差異（P＜0.05），且卵巢中的表達(dá)量明顯高于精巢（圖10）。進(jìn)一步對不同發(fā)育期性腺中amhr2的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，amhr2的表達(dá)量在幼魚不同發(fā)育期精巢和卵巢中均呈現(xiàn)出先降低再迅速升高的表達(dá)趨勢，不同之處在于體長為60日齡和120日齡時精巢中amhr2的表達(dá)量大于卵巢中的表達(dá)量，90日齡和150日齡時的情況則相反（圖11）。

圖10 暗紋東方鲀amhr2在不同組織中的相對表達(dá)Fig．10 Relative expression of amhr2 in different tissues of T．obscures

圖11 暗紋東方鲀amhr2基因在不同發(fā)育期性腺組織的相對表達(dá)Fig．11 Relative expression of amhr2 in gonad tissues at different developmental stages of T．obscurus

3 討論

3.1 暗紋東方鲀Amhr2蛋白的功能域分析

Amhr2是 β-轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）超家族的Ⅱ型受體，包含一個結(jié)合Amh的N末端胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［16］。Amh信號通路在雄性性別分化過程中發(fā)揮著十分重要的作用，主要通過具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的兩種類型的受體（Ⅰ型和Ⅱ型受體）及兩種細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)物R-Smads（受體調(diào)節(jié)型蛋白Smads）和Smad4（普通型蛋白Smad）調(diào)控靶器官、組織和細(xì)胞的發(fā)育、分化以及凋亡等生物學(xué)過程［7］。其作用機(jī)理是Amhr2與配體Amh結(jié)合后，結(jié)合并磷酸化I型受體，進(jìn)一步激活下游信號R-Smads蛋白，使得RSmads蛋白發(fā)生磷酸化并與Smad4蛋白相互作用，形成異源寡聚體，將Amh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)，與靶基因啟動子上的Smad結(jié)合元件（SBE）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)哺乳動物下游基因的轉(zhuǎn)錄［16-20］。據(jù)報道，Amh／Amhr2信號通路可能存在兩種決定性別的調(diào)控機(jī)制，一種機(jī)制是通過減少生殖細(xì)胞的數(shù)量，來促進(jìn)睪丸的發(fā)育［21］，與這一假設(shè)相一致的是高溫誘導(dǎo)的河豚生殖細(xì)胞退化與卵巢體細(xì)胞的雄性化有關(guān)［22］；另一種機(jī)制是對芳香化酶活性產(chǎn)生拮抗作用［23］，眾所周知芳香化酶是一種雌性激素合成酶，對魚類卵巢分化具有十分重要的作用，因此，Amh／Amhr2信號通路抑制芳香化酶活性可能導(dǎo)致河豚的睪丸形成。經(jīng)過本研究的生物信息學(xué)分析，暗紋東方鲀的Amhr2蛋白含有一個十分保守的STYKc蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（serine／threonine／tyrosine protein kinase domain），位于第194～497位氨基酸殘基處，在此結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有23個絲氨酸、6個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點以及2個潛在的N-糖基化位點，200～208氨基酸處為核苷酸磷酸鹽結(jié)合位點，221位氨基酸為ATP配體結(jié)合位點，321位氨基酸為質(zhì)子受體活性位點，383位氨基酸為性別相關(guān)SNP位點，這些位點構(gòu)成了STYKc蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的功能元件，可能使amhr2基因的STYKc蛋白激酶結(jié)構(gòu)域在Amhr2與配體Amh結(jié)合的過程中發(fā)揮重要的作用，從而調(diào)控暗紋東方鲀性別分化和性別特征維持的過程。目前為止尚未有文獻(xiàn)報道過STYKc蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的作用機(jī)制，這需要更進(jìn)一步的探索和研究。

3.2 暗紋東方鲀amhr2基因的表達(dá)分析

通常情況下，目的基因的組織表達(dá)模式能夠在一定程度上反映該基因的生物學(xué)功能。據(jù)報道，amhr2位于睪丸的支持細(xì)胞（sertoli cells）和卵巢的顆粒細(xì)胞上，主要在胚胎發(fā)育時期苗勒氏管周圍的間質(zhì)細(xì)胞、胎兒性腺的管狀和卵泡結(jié)構(gòu)以及成人睪丸的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［24-28］；Amh／Amhr2信號通路參與卵巢中卵泡發(fā)育的關(guān)鍵性階段［29］；amhr2可能在雄性黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的性腺發(fā)育過程中發(fā)揮重大作用［30］，這說明 amhr2基因可能在胚胎發(fā)育、性別分化、性腺發(fā)育和性別特征維持過程中發(fā)揮重要的作用。本研究使用熒光定量PCR法檢測了暗紋東方鲀amhr2基因的組織表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)amhr2的表達(dá)模式具有組織特異性，即無論是在雄魚還是在雌魚中，amhr2僅在性腺中表達(dá)，且卵巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精巢中的表達(dá)量，這說明amhr2主要在性腺中發(fā)揮作用。據(jù)報道在金錢魚（Scatophagus argus）［16］、日本青鳉［31］和尼羅羅非魚［32］中amhr2僅在性腺中表達(dá)，這種表達(dá)模式與暗紋東方鲀的表達(dá)模式相同，唯一不同的是，amhr2在這些魚類精巢中的表達(dá)量明顯高于卵巢中的表達(dá)量，這種表達(dá)模式與黑鯛性腺分化期的表達(dá)結(jié)果一致［33］；而高長富［4］的研究結(jié)果表明，紅鰭東方鲀amhr2基因在卵巢中的表達(dá)量最高，約為精巢表達(dá)量的40倍，故此推斷amhr2在不同魚類性腺中的表達(dá)差異可能與魚的種類和發(fā)育期有關(guān)。進(jìn)一步對暗紋東方鲀不同發(fā)育期性腺中amhr2的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明暗紋東方鲀amhr2在幼魚不同發(fā)育期精巢和卵巢中的表達(dá)量均呈現(xiàn)出先降低再迅速升高的趨勢，且在60日齡和120日齡時卵巢amhr2的表達(dá)量低于精巢，而90日齡和150日齡時卵巢amhr2的表達(dá)量則高于精巢，這種情況與紅鰭東方鲀中的報道結(jié)果相似，紅鰭東方鲀在23～40日齡時卵巢amhr2的表達(dá)量略低于精巢，60～80日齡甚至3齡成魚時卵巢amhr2的表達(dá)量顯著高于精巢［5］。本研究中amhr2在暗紋東方鲀不同組織和不同發(fā)育期的表達(dá)譜分析顯示，amhr2可能參與暗紋東方鲀的早期性腺發(fā)育及性腺生理功能的發(fā)揮等過程，但amhr2在性別分化過程中的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實驗首次克隆得到了暗紋東方鲀amhr2的cDNA全長序列，并利用生物信息學(xué)方法分析了其序列結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點、相關(guān)的生物信息學(xué)特征以及基因的表達(dá)特征，這為深入探索amhr2在暗紋東方鲀性腺發(fā)育和性別分化過程中的生物學(xué)功能奠定了重要基礎(chǔ)，也為人工繁育中的性別控制工作提供了重要參考依據(jù)。