張志東，陳愛華，吳楊平，張 雨陳素華，曹 奕，曹廣勇，田 鎮(zhèn)

（江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇省文蛤良種場，江蘇省海洋經(jīng)濟貝類研發(fā)中心，江蘇南通 226007）

文蛤?qū)伲∕eretrix）貝類隸屬于軟體動物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibrabchia），簾蛤目（Veneroida），簾蛤科（Veneridae），廣泛分布于中國、朝鮮半島、日本、亞丁灣和阿曼灣等海域。據(jù)報道，文蛤?qū)儇愵愒谖覈饕形母颍∕.meretrix）、麗文蛤 （M.lusoria）、斧文蛤 （M.lamarckii）、短文蛤（M.petechialis）和皺肋文蛤（M.lyrata）等幾種［1］，但其外形相似度高，故很多人將文蛤?qū)儇愵惢\統(tǒng)地稱為“文蛤”，忽略了種間進化的差異。長期以來，文蛤分類存在著分歧和混亂現(xiàn)象，已影響和制約了我國文蛤的水產(chǎn)養(yǎng)殖和遺傳育種等相關(guān)研究［2］。

密碼子的偏好性不僅能夠反映物種的進化關(guān)系，也對研究自然選擇、遺傳漂變以及基因重組等［3-6］普遍現(xiàn)象具有重要意義。密碼子是生命遺傳信息傳遞過程中的基本單位。密碼子共有64種，但是實際上編碼成的氨基酸只有20種，這就存在某些多個密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象，被稱為密碼子的簡并性［7］。正是由于該特性，每個氨基酸至少對應(yīng)1種密碼子（如 Met、Trp），最多可以有1種氨基酸對應(yīng)6種密碼子（如Leu、Ser等）。但這些編碼相同氨基酸的不同密碼子，在不同物種、不同生物體中使用的頻率并非完全地平均分布，僅有一部分為常用的密碼子，該現(xiàn)象也稱為密碼子的偏好性。

不同基因密碼子使用的偏好性存在一定的差異［2］。線粒體 DNA（mtDNA）基因組是獨立于核基因組之外的雙鏈DNA分子，記載著豐富的生物進化過程信息，與核基因組相比，其具有進化速度快、無組內(nèi)特異性等特點，可作為鑒定物種起源與進化最有利的工具［8］。一般情況下線粒體基因組包含13個蛋白質(zhì)編碼基因，即COX1、COX2、COX3、ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、Cytb、ATP6以及 ATP8［9-10］。然而據(jù)王健等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，文蛤線粒體中無ATP8基因，且ND4L與ND3序列長度較短，為保證序列比對的準(zhǔn)確性，本文取5種文蛤?qū)儇愵惻c青蛤（Cyclina sinensis）（青蛤作為參照）線粒體基因組COX1、COX2、COX3、ND1、ND2、ND4、ND5、ND6、Cytb、ATP6基因編碼蛋白（CDS）序列進行密碼子偏好性分析，為探討種屬差異和近緣種之間的親緣關(guān)系提供不同視角，以期為進一步開展文蛤功能基因表達調(diào)控研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測以及分子育種等工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

貝類線粒體基因組CDS序列均來源于NCBI數(shù)據(jù)庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）。選取各物種mtDNA編碼蛋白質(zhì)的基因序列中長度大于400 bp的 CDS序列，每物種各10個基因（COX1、COX2、COX3、Cytb、ATP6、ND1、ND2、ND4、ND5、ND6）。

表1 6種貝類基因序列號Tab．1 Accession of gene in six species of clams

1.2 分析指標(biāo)

相對同義密碼子使用頻率（relative synonymous codon usage，RSCU）是指對某種特定密碼子在編碼對應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的使用概率［12］。當(dāng)密碼子RSCU值大于1時，代表該密碼子為使用較多的密碼子；當(dāng)密碼子RSCU值小于或等于1時，表示該密碼子使用頻率偏低。計算公式如下：

式中，xij是第i個氨基酸的第j個密碼子的出現(xiàn)次數(shù)；n指編碼第i個氨基酸的同義密碼子的數(shù)量（n為1～6之間的整數(shù)）；x是指編碼第i個氨基酸的同義密碼子總出現(xiàn)次數(shù)的平均值。

1.3 分析方法

用Codon W軟件對5種文蛤線粒體基因組CDS序列分別進行分析，并計算相對同義密碼子使用頻率（RSCU）。用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，以SPSS 16.0對其密碼子的偏好性進行聚類分析，最后用MEGA 5.0分析序列，采用鄰接法構(gòu)建進化樹，最后將聚類結(jié)果與進化樹結(jié)果進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種貝類線粒體基因組CDS序列的密碼子偏好性

A3s、C3s、G3s、U3s分別表示密碼子的第 3位堿基中A、C、G、U的含量在第3位堿基總量中所占的比率。5種文蛤?qū)儇愵惥€粒體基因CDS序列中的 U3s分別為文蛤 57.83%、麗文蛤56.87%、皺肋文蛤63.23%、短文蛤58.03%、斧文蛤59.22%，青蛤則為60.34%，均大于 A3s、C3s、G3s（表2），可見5種文蛤?qū)儇愵惼珢凼褂靡訳結(jié)尾的密碼子。尤其是UCU、ACU、CCU和GCU，它們的RSCU值均接近3，為5種文蛤?qū)儇愵惻c青蛤最常用的密碼子。

用Codon W和Excel計算的結(jié)果表明（表3）：在文蛤?qū)儇愵惥€粒體基因組中的密碼子中UUU、UAU、CAU等24個密碼子的RSCU值均大于1，為文蛤?qū)儇愵惼眯悦艽a子。但5種文蛤?qū)儇愵惖拿艽a子偏好性有所不同：麗文蛤與短文蛤編碼異亮氨酸（Ile）的偏好密碼子只有1個AUU，其余貝類不僅有AUU，還有AUA；皺肋文蛤編碼谷氨酸（Glu）的偏好性密碼子為GAA，其余貝類為GAG；皺肋文蛤編碼甘氨酸（Gly）的偏好密碼子中無GGG，與其余貝類存在些差異；斧文蛤編碼谷氨酰胺（Gln）的偏好密碼子為CAG，其余貝類均為CAA；斧文蛤編碼甘氨酸（Gly）的偏好密碼子 GAA和 GGG，其余貝類為 GGU與GGG。青蛤編碼亮氨酸的偏好密碼子無UUG。

表2 6種貝類 CDS序列的 A3s、C3s、G3s、U3sTab．2 Values of A3s，U3s，G3s，C3s in CDS in six species of clams （%）

2.2 6種貝類RSCU值聚類分析

對5種文蛤?qū)儇愵惡颓喔虻拿艽a子RSCU值進行聚類分析，除去編碼色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）唯一的密碼子的UGG和AUG，其RSCU值始終為1。再除去3個終止密碼子UAA、UAG、UGA，取余下的59個密碼子的RSCU值對密碼子的偏好性分析。聚類結(jié)果見圖1，文蛤和短文蛤先聚為一類，再與麗文蛤聚為一類；接著和皺肋文蛤及斧文蛤聚為一類，最后與青蛤聚為一類。

表3 6種貝類線粒體基因CDS序列偏好密碼子的RSCUTab．3 RSCU values of mtDNA CDS in six species of clams

圖1 6種貝類線粒體基因CDS序列密碼子偏好性聚類圖Fig．1 Cluster tree based on RSCU values of mtDNA CDSin six species of clams

2.3 文蛤?qū)儇愵惥€粒體基因序列比對構(gòu)建進化樹

以青蛤為外群，將所研究的5種文蛤?qū)儇愵惖?0個線粒體基因（COX1、COX2、COX3、Cytb、ATP6、ND1、ND2、ND4、ND5和 ND6）CDS序列用鄰接法聚類分析，其結(jié)果如圖2：文蛤與短文蛤在COX2、COX3、Cytb、ATP6、ND1、ND2、ND4、ND5和ND6先聚為一類，再與麗文蛤聚為一類；皺肋文蛤與斧文蛤聚為一類，再與青蛤聚為一類。5種文蛤?qū)儇愵惥€粒體基因系統(tǒng)進化樹與密碼子偏好聚類分析結(jié)果相似。

圖2 鄰接法（NJ）構(gòu)建的文蛤?qū)儇愵惻c青蛤線粒體基因CDS序列進化樹Fig．2 NJ phylogenetic tree based on mtDNA CDS in five Meretrix species and C．sinensis

3 討論

基因是生物遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)是發(fā)揮生物功能的主要分子。因此聯(lián)系兩者的密碼子使用情況必然具有重要的生物學(xué)意義。在長期進化過程中，物種的基因會逐漸形成一套適應(yīng)基因組的特定密碼子用法［13］。文蛤?qū)儇愵惥€粒體基因組CDS序列偏愛使用U結(jié)尾的密碼子，使用頻率最高的是UCU，其次是ACU，而對C結(jié)尾的密碼子使用頻率最低。以麗文蛤為例，27個偏好密碼子中以U結(jié)尾的有15個，而以C結(jié)尾為零，其余4種文蛤?qū)儇愵愐才c之相似。由于線粒體基因組存在著D-loop區(qū)，該區(qū)域富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）［14］，這可能與文蛤線粒體基因組CDS序列偏愛使用U結(jié)尾的密碼子有關(guān)。文蛤核基因組甚至全基因組是否偏愛使用U結(jié)尾的密碼子，還需待文蛤全基因組測序完成之后繼續(xù)研究。

物種的親緣關(guān)系遠近與密碼子偏好性差異大小密切相關(guān)。親緣關(guān)系近，則密碼子偏好性差異??；親緣關(guān)系遠，則密碼子偏好性差異大［15］。宋喬喬等［16］對野牦牛（Bos mutus）、普通牛（Bos taurus）、藏 羚 羊 （Pantholops hodgsonii）、山 羊（Capra hircus）和綿羊（Ovis aries）等哺乳動物線粒體基因密碼子偏好性進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)基于密碼子偏好性差異可以揭示物種間的親緣關(guān)系，并用于物種的分類研究。DUAN等［17］比較了14種鲌亞科魚類密碼子偏好性的差異，發(fā)現(xiàn)屬間物種的密碼子偏好性具有物種特異性，主要是受到進化過程中的突變與自然選擇的影響。基因突變具有低頻性，故近緣物種密碼子在使用偏好性上總體相似，又有輕微差別。本研究通過對文蛤?qū)儇愵惖拿艽a子偏好性分析發(fā)現(xiàn)，5種文蛤?qū)儇愵惷艽a子偏好性雖有輕微差別，但總體相似，符合上述近緣種密碼子使用偏好性特點。而青蛤在密碼子使用偏好性方面與文蛤?qū)儇愵愑兴町?，聚類結(jié)果和序列比對結(jié)果均顯示青蛤與文蛤?qū)儇愵愑H緣關(guān)系較遠。從密碼子使用偏好性來看，文蛤與短文蛤極為相似，與斧文蛤相似度最小，在親緣關(guān)系上很可能亦是文蛤與短文蛤親緣關(guān)系最近，與斧文蛤親緣關(guān)系最遠。潘寶平等［18］通過16SrRNA基因及ITS1序列的系統(tǒng)學(xué)分析，劉澤浩等［19］通過28SrRNA部分序列研究也得出類似結(jié)論。

本研究利用生物信息學(xué)的方法，在編碼蛋白質(zhì)水平進行了密碼子偏好性分析，明確了文蛤?qū)儇愵惖拿艽a子偏好性及特征，并比較文蛤與其近緣種的密碼子使用偏好性差異。研究結(jié)果可為文蛤?qū)儇愵愒谶M化中親緣關(guān)系遠近的判定提供一定依據(jù)，并可為未來文蛤功能基因表達調(diào)控研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測以及分子育種等工作提供理論基礎(chǔ)。