王齡焓,陳 辰,萬(wàn)洋靈,郭順堂

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,植物蛋白與谷物加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

豆乳營(yíng)養(yǎng)豐富,其含有的大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),氨基酸組成合理,能滿(mǎn)足人體營(yíng)養(yǎng)的需求,且不含膽固醇。豆乳中還含有大豆異黃酮、大豆低聚糖等成分。然而豆乳也存在一些問(wèn)題和缺陷,如具有豆腥味,含有難消化的棉籽糖和水蘇糖,還含有胰蛋白酶抑制因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子[1]。乳酸菌發(fā)酵的豆乳不僅保留了大豆的營(yíng)養(yǎng)成分,而且還具有促進(jìn)人體腸胃蠕動(dòng)、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防癌癥等作用[2-3],可滿(mǎn)足乳糖不耐癥、控制膽固醇含量及蛋白質(zhì)過(guò)敏等人群的需求[4]。歐洲國(guó)家及日韓等國(guó)對(duì)酸豆乳的研究較為深入,但我國(guó)在酸豆乳科學(xué)研究和工業(yè)化等方面仍存在差距,目前還未出現(xiàn)具有代表性的酸豆乳產(chǎn)品[1]。

乳酸菌以單糖為碳源和能源,經(jīng)發(fā)酵將其轉(zhuǎn)變成乳酸或其它有機(jī)酸。乳酸菌代謝產(chǎn)物包括各種氨基酸、脂肪酸、寡糖、維生素、小肽、增味劑以及芳香物質(zhì)等[5]。因此乳酸菌發(fā)酵豆乳的作用主要是產(chǎn)生乳酸,使豆乳形成特有的組織結(jié)構(gòu)和風(fēng)味[6]。目前豆乳發(fā)酵的乳酸菌大多來(lái)自酸奶發(fā)酵劑,但豆乳發(fā)酵時(shí),發(fā)酵活力方面存在很多問(wèn)題,如保加利亞乳桿菌不能利用蔗糖,產(chǎn)酸少、活菌數(shù)低;嗜熱鏈球菌雖然能利用蔗糖但產(chǎn)酸能力較差;雙歧桿菌需要嚴(yán)格的厭氧條件,生產(chǎn)應(yīng)用難度較高[7-8]。

開(kāi)菲爾粒是一種由乳酸菌和酵母菌共同組成的復(fù)雜菌系,發(fā)酵后的乳制品中含有大量黏性多糖、少量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等成分[9]。開(kāi)菲爾具有一定的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值,其乳酸菌和酵母菌之間的相互作用關(guān)系是十分重要的研究?jī)?nèi)容。酵母菌能夠利用乳中的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和檸檬酸鹽[10],賦予乳制品酒香味和二氧化碳?xì)怏w,使其具有良好的發(fā)酵特性[11]。研究表明酵母菌除賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味外,還能與乳酸菌形成共生作用,酵母菌為乳酸菌提供了許多營(yíng)養(yǎng)因子，例如氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等物質(zhì)[12],乳酸菌的代謝產(chǎn)物又為酵母菌提供了能量來(lái)源。Tamime等[13]發(fā)現(xiàn)乳酸菌與酵母菌之間存在代謝產(chǎn)物互補(bǔ)機(jī)制。

類(lèi)比于開(kāi)菲爾粒中乳酸菌和酵母菌之間的協(xié)同發(fā)酵作用,將研究思路同樣應(yīng)用于豆乳發(fā)酵的菌種選擇。為解決乳酸菌發(fā)酵豆乳時(shí)活菌數(shù)低、產(chǎn)酸能力差、風(fēng)味寡淡等影響優(yōu)質(zhì)酸豆乳產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵問(wèn)題,本文探究了乳酸菌在豆乳中的生長(zhǎng)特性及乳酸菌和酵母菌聯(lián)合發(fā)酵豆乳時(shí)的協(xié)同效應(yīng),選擇了六種乳酸菌和一種酵母菌[14],分析它們單獨(dú)或聯(lián)合培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)酸、碳源利用、氮源利用及產(chǎn)胞外多糖的能力，以期為豆乳發(fā)酵的菌種選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);植物乳桿菌45(Lactobacillusplantarum45,L.pl45)、植物乳桿菌571(Lactobacillusplantarum571,L.pl571)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,L.acid)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus,L.rh)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei,L.casei)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lac)凍干粉 河北一然生物科技有限公司;增香酵母PL09(ViniflorapreludePL09) 丹麥CHR-HANSE集團(tuán);MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯及其他培養(yǎng)基原料 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他試劑均為分析純。

GF-300電子天平 日本ND公司;TCYQ培養(yǎng)箱 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PP-25酸度計(jì) 德國(guó)賽多利斯;BCD-23AF冰箱 合肥榮事達(dá)電冰箱有限公司;UV-1800分光光度計(jì) 日本島津公司;SHJ-A水浴恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇華峰儀器有限公司;YX-24LDJ型手提式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;TA DHR-1流變儀 美國(guó)TA公司;MOEDL BE-210N電泳槽 日本BIO-CRAFT公司;BYY-Ⅲ8B穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 采用比濁法[15]測(cè)定生長(zhǎng)曲線(xiàn)。向每支試管中加入5 mL MRS肉湯,121 ℃滅菌15 min,冷卻后將活化一次的菌種按照5%(V/V)接種到培養(yǎng)基中,不接入菌種的樣品做空白對(duì)照。放置到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每隔1.5 h在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定菌液的吸光值,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。并且根據(jù)國(guó)標(biāo)GB4789.35-2016方法[16]對(duì)二次活化時(shí)生長(zhǎng)末期活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 乳酸菌在豆乳中產(chǎn)酸情況的研究

1.2.2.1 豆乳制備 挑選市售大豆50 g,以大豆∶水(W/V)=1∶3在4 ℃條件下浸泡13 h。將浸泡過(guò)的大豆加入到80 ℃ 150 mL的0.3%(W/V)的碳酸氫鈉溶液中,保溫5 min,并按大豆∶水(W/V)(80 ℃)=1∶7打漿3 min。在布氏漏斗中加入脫脂棉抽真空過(guò)濾,收集豆?jié){,沸水浴20 min得到豆乳。冷卻后,將豆乳在115 ℃條件下滅菌15 min,冷卻至室溫備用[17]。

1.2.2.2 乳酸菌發(fā)酵豆乳制備 將MRS肉湯培養(yǎng)基在121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫后,接種萬(wàn)分之五(W/V)乳酸菌凍干粉,放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h為活化一次,再取活化液同條件5%(V/V)培養(yǎng)12 h為活化二次。

豆乳中分別接入6種5%(V/V)乳酸菌二次活化液,放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),得到發(fā)酵時(shí)間不同的酸豆乳。

1.2.2.3 豆乳酸度分析 每隔2 h測(cè)定酸豆乳的酸度和pH,共測(cè)定8 h。酸度根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.239-2016[18],用濃度為0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,以滴定酸度(°T)表示。pH直接用酸度計(jì)測(cè)定。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵對(duì)碳源利用情況的研究

1.2.3.1 外加碳源對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸的影響 豆乳中分別添加5%(W/V)蔗糖、乳糖和葡萄糖,再分別接種5%(V/V)乳酸菌的二次活化液,放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),得到不同外加碳源的酸豆乳,然后分別測(cè)定發(fā)酵豆乳的pH并計(jì)算每發(fā)酵2 h的酸豆乳pH與初始pH的差值,記為ΔpH。

1.2.3.2 酸豆乳中總糖含量的測(cè)定 用100 mL的燒杯稱(chēng)取酸豆乳約5.000 g,加入50 mL蒸餾水60 ℃水浴10 min,冷卻至室溫后加入5 mL 21.9%乙酸鋅和5 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液,混勻后定容到100 mL,靜置30 min后過(guò)濾。取50 mL濾液加入5 mL濃鹽酸于100 ℃水浴30 min,冷卻至室溫后用4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至5.0,再定容到100 mL,得到樣品處理液[19],用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定總糖含量[20]。

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品,向試管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 1 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,加蒸餾水至總體積為2.0 mL,再分別加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。將各試管搖勻后,沸水浴加熱5 min,取出后立即冷卻至室溫,再用蒸餾水定容到25 mL,混勻。在540 nm處測(cè)定顯色液的吸光值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將樣品處理液稀釋一定倍數(shù)后,以上述同樣的方法測(cè)定吸光值。

式中:m′為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查得的葡萄糖質(zhì)量,mg;V為樣品提取液總體積,mL;N為樣品提取液稀釋倍數(shù);VS為固定所取樣品提取液的體積,1 mL;m為樣品質(zhì)量,g。

1.2.4 酸豆乳中胞外多糖含量的測(cè)定 移取2.0 mL酸豆乳于燒杯中,沸水浴10 min后冷卻到室溫,4 ℃ 15000×g離心15 min,將上清液全部轉(zhuǎn)移至燒杯中,加入三氯乙酸溶液,使其濃度為4%(W/V),靜置30 min后4 ℃，15000×g離心15 min,去沉淀后,向上清液中加入3倍體積的95%(V/V)乙醇溶液,4 ℃放置過(guò)夜。再4 ℃15000×g離心30 min后取沉淀,4 ℃透析(8000～12000 Da)48 h,期間更換4次蒸餾水[21]。得到樣品處理液,用苯酚硫酸法[21-22]測(cè)定胞外多糖的含量。

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品,向試管中加入0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 40 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,加蒸餾水使總體積為2.0 mL,再加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸,混勻后室溫放置20 min于490 nm測(cè)定吸光值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將樣品處理液稀釋一定倍數(shù)后,以上述同樣的方法測(cè)定吸光值。

1.2.5 乳酸菌對(duì)豆乳中氮源利用情況的研究

1.2.5.1 SDS-PAGE及分析 用移液槍移取50 μL不同發(fā)酵時(shí)間和不同乳酸菌發(fā)酵下的酸豆乳樣品,裝入1.5 mL離心管中,加入0.5 mL含20%甘油、0.2% SDS、0.063 mol/L Tris-HCl(pH6.8)的樣品處理液,以及0.36 g尿素、20 μL飽和溴酚藍(lán)溶液,20 μL巰基乙醇,加蒸餾水至總體積為1 mL,充分混合均勻,于室溫下靜置12 h后進(jìn)行電泳。

采用垂直平板電泳裝置。膠板厚度為1 mm,分離膠濃度為12.5%,交聯(lián)度為2.7%;濃縮膠濃度為4%,交聯(lián)度為2.7%。電泳緩沖液中含5 mmol/L的Tris、38.4 mmol/L的甘氨酸和0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)。樣品上樣量為7 μL。電泳過(guò)程中,濃縮膠階段保持電流為15 mA,進(jìn)入分離膠后,電流改為25 mA。電泳結(jié)束后,電泳膠片用含33%甲醇和12%三氯乙酸的固定液固定4 h,再用考馬斯亮藍(lán)G-250染色液染色3 h。

染色結(jié)束后,用蒸餾水浸泡膠片進(jìn)行脫色,直至底色基本脫去為止。用佳能掃描儀掃描膠片得到電泳圖像[23],采用Scion Image軟件對(duì)凝膠圖像上的蛋白條帶進(jìn)行光密度掃描分析。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法分析不同乳酸菌對(duì)豆乳中氮源的利用情況。

1.2.5.2 酸豆乳中游離氨基含量的測(cè)定 游離氨基含量采用鄰苯二甲醛法[24-25]測(cè)定。首先取2.5 mL酸豆乳于試管中,加入0.5 mL蒸餾水,再加入5.0 mL 0.75 mol/L三氯乙酸溶液,混勻后室溫靜置20 min后,4000×g離心5 min得到樣品處理液。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制:分別配制0.2、0.5、1.0、2.0、2.5(×10-6mol/mL)L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液,分別取150 μL的上述溶液于試管中,再加入3 mL鄰苯二甲醛試劑,混勻后室溫反應(yīng)2 min,在340 nm處測(cè)定吸光值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),將樣品處理液稀釋一定倍數(shù)后,以上述同樣的方法測(cè)定吸光值。

1.2.6 乳酸菌和酵母菌協(xié)同發(fā)酵作用分析

1.2.6.1 乳酸菌酵母菌聯(lián)合發(fā)酵豆乳 豆乳中依次接入5%(V/V)乳酸菌二次活化液和8×106個(gè)/mL增香酵母PL09,放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),得到發(fā)酵時(shí)間不同的聯(lián)合發(fā)酵豆乳,然后分別測(cè)定發(fā)酵豆乳的活菌數(shù)、pH、滴定酸度、產(chǎn)品黏度,同時(shí)計(jì)算每發(fā)酵2 h的酸豆乳pH(或滴定酸度)與初始時(shí)pH(或滴定酸度)的差值,記為ΔpH(或滴定酸度差)。

1.2.6.2 酸豆乳黏度的測(cè)定 將樣品攪拌均勻后加到DHR-1流變儀平行板(d=40 mm)之間的GAP(1 mm)中,刮去多余樣品,再蓋上儀器配套的蓋子。流變儀設(shè)定的測(cè)量參數(shù)為:溫度25 ℃,轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速為50.0 s-1,測(cè)定時(shí)間60 s,每隔1 s記錄黏度值[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)都重復(fù)3次,結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,數(shù)據(jù)分析運(yùn)用PASW Statistics 18和EXCEL 2010軟件,運(yùn)用Origin 8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖表[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌生長(zhǎng)情況分析

為得到生長(zhǎng)能力較好的乳酸菌,分析了六種乳酸菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線(xiàn),結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,六種乳酸菌中乳酸乳球菌在培養(yǎng)期間吸光度的變化很小,說(shuō)明其在培養(yǎng)基中僅能維持基本的生長(zhǎng)能力。相比之下,鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌571能夠較快地進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)能力較強(qiáng)。而干酪乳桿菌、植物乳桿菌45和嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)能力次于上述兩種乳酸菌。對(duì)穩(wěn)定期的活菌數(shù),分析結(jié)果顯示(表1),鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌45、植物乳桿菌571和干酪乳桿菌均達(dá)到108CFU/mL以上,其中鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌571達(dá)到了109CFU/mL以上,表現(xiàn)出較高的活菌數(shù)。因此選擇植物乳桿菌45、植物乳桿菌571、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌進(jìn)行豆乳發(fā)酵。

圖1 六種乳酸菌在MRS肉湯中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of six lactic acid bacteria in MRS broth

2.2 乳酸菌在豆乳中產(chǎn)酸能力分析

乳酸菌發(fā)酵主要產(chǎn)生乳酸,其次還有少量乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸,乳酸菌的產(chǎn)酸能力是評(píng)價(jià)菌種優(yōu)劣的重要指標(biāo)。在圖2和圖3顯示了豆乳發(fā)酵過(guò)程中不同乳酸菌的產(chǎn)酸情況,其中兩種植物乳桿菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力,滴定酸度有較快的增長(zhǎng),pH的降低也較快。植物乳桿菌571的產(chǎn)酸能力最強(qiáng),發(fā)酵結(jié)束后,酸豆乳的pH達(dá)到4.42,滴定酸度達(dá)到63.78 °T。在發(fā)酵8 h后pH接近4.5的菌種有植物乳桿菌571、植物乳桿菌45和嗜酸乳桿菌;而鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌的產(chǎn)酸能力較差,發(fā)酵結(jié)束后pH僅為5.78和5.73,滴定酸度僅為25.06和27.78 °T,說(shuō)明乳酸菌不同種屬的菌株產(chǎn)酸能力不同,而乳酸菌的產(chǎn)酸能力與菌體細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的量有關(guān)[28]。

表1 乳酸菌二次活化后的活菌數(shù)Table 1 Viable bacteria number after activation of the second generation of lactic acid bacteria

圖4 外加不同碳源后豆乳在發(fā)酵過(guò)程中pH變化Fig.4 pH change during fermentation of soymilk with adding different carbon sources注:a～d分別代表植物乳桿菌571、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌45和鼠李糖乳酸菌發(fā)酵豆乳。

圖2 乳酸菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中滴定酸度的變化Fig.2 Titration acidity changes duringlactic acid bacteria fermented soymilk

圖3 乳酸菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中pH的變化Fig.3 pH change during lactic acid bacteria fermented soymilk

2.3 各種乳酸菌對(duì)不同能源物質(zhì)的利用情況

2.3.1 豆乳中外加碳源對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸能力的影響 向豆乳中添加5%(W/V)蔗糖、乳糖、葡萄糖,然后比較了不同菌種發(fā)酵過(guò)程中pH的變化情況,結(jié)果如圖4所示。根據(jù)圖4(a和c)可知,對(duì)于植物乳桿菌,促進(jìn)產(chǎn)酸作用最強(qiáng)的是葡萄糖。而蔗糖和乳糖的促進(jìn)作用較小;根據(jù)圖4(b)可知,三種糖類(lèi)對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的促進(jìn)作用都很小。從圖4(d)中可知,葡萄糖對(duì)鼠李糖乳桿菌在豆乳中發(fā)酵的產(chǎn)酸具有較明顯的促進(jìn)作用,這與閆麗雅[29]的研究結(jié)果一致,葡萄糖是益生菌在發(fā)酵豆乳中主要利用的糖類(lèi)。

2.3.2 不同乳酸菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中總糖的變化 豆乳中的總糖主要包括為蔗糖(5.0%)、水蘇糖(3.8%)和棉籽糖(1.1%),還有少量單糖及能在測(cè)定方法下水解的淀粉[1]。圖5顯示了不同菌種在發(fā)酵豆乳過(guò)程中總糖的變化。從圖5中可以看出,兩種植物乳桿菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中總糖含量降低較快,說(shuō)明其利用糖類(lèi)的速度是最快的,相應(yīng)地在豆乳中的產(chǎn)酸速度也較快(圖3)。而嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中糖含量變化較小,對(duì)應(yīng)的產(chǎn)酸速度也較慢(圖3)。此結(jié)果表明兩種植物乳桿菌有較強(qiáng)的糖類(lèi)代謝能力,并且乳酸菌對(duì)糖類(lèi)的利用能力與產(chǎn)酸能力存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。Champagne等[30]發(fā)現(xiàn)能利用蔗糖進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的乳酸菌,在發(fā)酵豆乳時(shí)能使豆乳的pH達(dá)到4.0,但是只利用豆乳中除蔗糖以外的糖類(lèi)則不能獲得酸奶類(lèi)產(chǎn)品的pH(4.2～4.6)。

表2 不同乳酸菌在豆乳中產(chǎn)胞外多糖的含量Table 2 Content of extracellular polysaccharides produced by different lactic acid bacteria in soymilk

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),表3、圖9同。

圖5 乳酸菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中總糖含量的變化Fig.5 Changes of total sugar inlactic acid bacteria fermented soymilk

2.3.3 乳酸菌在豆乳發(fā)酵中胞外多糖的含量 胞外多糖是部分乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的多糖。胞外多糖能夠增加產(chǎn)品黏度和保水性,延長(zhǎng)保存期,還具有多種保健功能[31-32]。目前研究報(bào)道產(chǎn)胞外多糖的乳桿菌主要有:瑞士乳桿菌、開(kāi)菲爾乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和清酒乳桿菌等,乳桿菌胞外多糖的產(chǎn)量通常不高,在25～1300 mg/L之間[33]。5種不同乳酸菌發(fā)酵豆乳時(shí)胞外多糖的含量如表2所示,從表2可以看出,鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵豆乳中多糖含量顯著高于對(duì)照和其他菌種(P<0.05),含量分別為180.82和174.45 μg/mL,說(shuō)明這兩種乳酸菌有較明顯的產(chǎn)胞外多糖的能力。而另外三種乳酸菌發(fā)酵豆乳中胞外多糖的含量與未接種乳酸菌的空白對(duì)照相似,推測(cè)這三種乳酸菌幾乎沒(méi)有產(chǎn)胞外多糖的能力。

2.3.4 乳酸菌對(duì)豆乳中氮源的利用情況 豆乳中蛋白質(zhì)是氮源的一種形式,根據(jù)沉降系數(shù)將大豆蛋白質(zhì)劃分為2S、7S、11S和15S,其中7S和11S為主要組分,占總蛋白含量的70%以上。7S組分中作為主要組分的β-伴大豆球蛋白是由3種亞基組成的三聚體:分別為α′(～72 kDa)、α(～68 kDa)及β(～52 kDa)。11S可分為酸性亞基A(～35 kDa)和堿性亞基B(～20 kDa)[34]。乳酸菌能發(fā)酵豆乳蛋白質(zhì)形成肽類(lèi)和氨基酸等物質(zhì)。本研究利用SDS-PAGE分析了乳酸菌對(duì)豆乳蛋白的利用情況。如圖6所示,隨著乳酸菌發(fā)酵豆乳時(shí)間的延長(zhǎng),條帶顏色逐漸變淺。通過(guò)光密度分析(數(shù)據(jù)未顯示),條帶的光密度值逐漸降低,說(shuō)明蛋白質(zhì)在逐漸分解,但是分解的程度較小。并且大豆蛋白中的7S和11S條帶逐漸變淺,光密度值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),因此乳酸菌對(duì)于豆乳中的多種蛋白組分都有利用能力。

圖6 乳酸菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE electropherogram oflactic acid bacteria fermented soymilk注:泳道1～5表示發(fā)酵時(shí)間為0、2、4、6、8 h得到的酸豆乳;泳道右側(cè)字母分別表示大豆蛋白中的α′、α、β、A、B亞基。

通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中豆乳的游離氨基含量,比較不同乳酸菌的蛋白質(zhì)水解能力。從圖7中可以看出,植物乳桿菌45、植物乳桿菌571發(fā)酵的豆乳中游離氨基的含量都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),這可能是由于這兩種乳酸菌對(duì)豆乳中蛋白質(zhì)的利用速率大于分解速率,利用蛋白質(zhì)用于自身生長(zhǎng)的能力較強(qiáng);鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵的豆乳中游離氨基的含量變化很小,這三種乳酸菌對(duì)豆乳中蛋白的利用和分解能力幾乎持平[35]。

圖7 乳酸菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中豆乳游離氨基的含量Fig.7 Free amino group content of soymilk during lactic acid bacteria fermentation

2.4 乳酸菌和酵母菌的協(xié)同發(fā)酵豆乳的效果

通過(guò)向豆乳中添加乳酸菌和酵母菌的混合菌種,探究酵母菌對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及發(fā)酵后豆乳黏度的影響。乳酸菌在發(fā)酵制乳品中的活菌數(shù)需達(dá)到107甚至108(CFU/mL)才能發(fā)揮對(duì)人體的有益作用,因此活菌數(shù)是評(píng)價(jià)乳酸菌性能的重要指標(biāo)。從表3可知，在單一由乳酸菌發(fā)酵的豆乳中,乳酸菌的活菌數(shù)較低,特別是鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌,僅在107CFU/mL。而添加了增香酵母PL09后,乳酸菌的活菌數(shù)都有較大地增加,其中鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌的活菌數(shù)增加的最為顯著,由原來(lái)的8.50×107和9.40×107CFU/mL增加到3.82×108和2.65×108CFU/mL,這可能是因?yàn)榻湍妇诎l(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物如肽類(lèi)和維生素等被乳酸菌所利用,促進(jìn)了其生長(zhǎng)[36]。酵母產(chǎn)生的大分子物質(zhì)能誘導(dǎo)乳酸菌中氨基肽酶的合成,使氨基酸及小分子縮氨酸含量增加,從而促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng);另外酵母自溶產(chǎn)生的吡喃甘露糖可以吸收中鏈脂肪酸,解除其對(duì)乳酸菌的毒害作用,還可能增加乳酸菌的α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙?；?葡萄糖脫水酶及肽酶的活性,使基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)豐富,間接促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)[37]。

表3 單一乳酸菌發(fā)酵及乳酸菌和酵母菌聯(lián)合發(fā)酵豆乳中乳酸菌的活菌Table 3 Number of lactic acid bacteria in soymilk during single lactic acid fermentation and combined fermentation of lactic acid bacteria and yeast

另外,從增香酵母PL09對(duì)促進(jìn)不同乳酸菌產(chǎn)酸的結(jié)果可以看出(圖8),增香酵母PL09對(duì)于5種乳酸菌的產(chǎn)酸都有促進(jìn)作用。其中對(duì)鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌的促進(jìn)作用最強(qiáng),并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)程度逐漸增加,發(fā)酵結(jié)束后,pH分別降低1.35和1.06,滴定酸度增加了18.68和13.84 °T。Gobbetti等[38]利用不同糖類(lèi)探究酵母菌和乳酸菌的相互關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)酵母菌可以將蔗糖分解為葡萄糖和果糖為乳酸菌提供穩(wěn)定的碳源。

圖8 酵母菌對(duì)乳酸菌在豆乳中產(chǎn)酸的促進(jìn)作用Fig.8 The promoting effect of yeast on lactic acid bacteria in soybean milk注:A:滴定酸度差;B:ΔpH。

比較單一乳酸菌發(fā)酵及和增香酵母PL09聯(lián)合發(fā)酵后酸豆乳的黏度。從圖9中可以看出,加入增香酵母PL09后酸豆乳的黏度都明顯增加,其中鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌在加入酵母菌后發(fā)酵豆乳黏度由原來(lái)的158.5和230.5 mPa·s分別增加到403.7和446.7 mPa·s,這可能是由于鼠李糖乳酸菌和干酪乳桿菌單一發(fā)酵的酸豆乳的酸度不足導(dǎo)致凝乳不結(jié)實(shí),而與酵母菌聯(lián)合發(fā)酵后促進(jìn)了乳酸菌的產(chǎn)酸,使酸豆乳的黏度增加。而與植物乳桿菌45聯(lián)合發(fā)酵后,其黏度達(dá)到了529.7 mPa·s,黏度增加明顯,這一結(jié)果預(yù)示著增加酸豆乳的黏度有利于制造攪拌型酸豆乳,并且賦予產(chǎn)品更加順滑的口感。

圖9 單一乳酸菌發(fā)酵及乳酸菌和酵母菌聯(lián)合發(fā)酵豆乳的黏度Fig.9 Viscosity of single lactic acid fermented soymilk and combined fermented soymilk of lactic acid bacteria and yeast注:橫坐標(biāo)數(shù)字1～5依次表示鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌571、干酪乳桿菌、植物乳桿菌45?！?”表示與酵母菌聯(lián)合發(fā)酵豆乳的情況。

3 結(jié)論

本研究選擇的6種乳酸菌植物乳桿菌45、植物乳桿菌571、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在活化后的活菌數(shù)能達(dá)到108CFU/ml以上。將這5種乳酸菌應(yīng)用于豆乳發(fā)酵,其中植物乳桿菌45和植物乳桿菌571發(fā)酵豆乳8 h后pH分別達(dá)到4.43和4.42,活菌數(shù)分別達(dá)到3.11×108和2.78×108CFU/mL,具有較高的產(chǎn)酸能力和活菌數(shù);相應(yīng)的碳源利用能力也較強(qiáng)。鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌能夠在豆乳中發(fā)酵時(shí)顯著地產(chǎn)生胞外多糖(P<0.05),產(chǎn)生量分別為180.82和174.45 μg/mL。分別將5種乳酸菌和增香酵母PL09聯(lián)合用于豆乳發(fā)酵時(shí)能夠促進(jìn)乳酸菌的產(chǎn)酸,增加活菌數(shù)及酸豆乳產(chǎn)品的黏度。以上結(jié)果表明乳酸菌和酵母菌聯(lián)合發(fā)酵豆乳可以生產(chǎn)出具有高活菌數(shù)、快速產(chǎn)酸性能及高黏度的酸豆乳產(chǎn)品,也為發(fā)酵豆乳的菌種選擇提供了參考。