,*

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003;2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003;3.國家葡萄酒及白酒、露酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,山東煙臺(tái) 264003)

紅樹莓(RubusideausL.)為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)漿果,顏色鮮艷、口感細(xì)膩且風(fēng)味獨(dú)特,但常溫下不耐貯藏且運(yùn)輸困難,極易腐爛,一般加工成果汁、果醬、果酒等產(chǎn)品[1-3],且加工后殘留果渣的45%均為纖維素部分,其中可能含有纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等[4]。目前,食品工業(yè)越來越重視回收和利用副產(chǎn)品以改善有機(jī)廢棄物對(duì)環(huán)境的影響[5]。食品加工后的廢渣所占比重較高,尤其是水果加工業(yè),榨汁后的果渣比重范圍為15%～50%[6],回收再利用這些植物加工廢棄物,不但可以提高食品加工的總利潤,還可以實(shí)現(xiàn)食品工業(yè)的綠色生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展。鑒于此,蘋果、刺梨和石榴等果渣中膳食纖維的提取再利用近期受到較多的關(guān)注[7-11]。

膳食纖維是20世紀(jì)80年代最早明確的與健康相關(guān)的成分之一,是由一組異質(zhì)性化合物組成的混合物,在人類上消化道系統(tǒng)不能被消化酶消化[12],其中,果膠和樹膠為可溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber,SDF),纖維素、大部分半纖維素和木質(zhì)素為不可溶性膳食纖維(Insoluble Dietary Fibre,IDF)[12-14]。國內(nèi)外研究表明,SDF具有降低血液膽固醇、改善葡萄糖耐受性以及降低血糖反應(yīng)的功效[15-16],IDF具有增加糞便體積、促進(jìn)正常通便、減少腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的能力[17-18]。鑒于此,富含膳食纖維的紅樹莓果渣可直接作為添加劑應(yīng)用于食品生產(chǎn),如替代50%的面粉進(jìn)行糕點(diǎn)烘焙提升糕點(diǎn)的膳食纖維含量[19]。

截止目前,國內(nèi)外對(duì)紅樹莓果渣膳食纖維提取工藝的系統(tǒng)優(yōu)化尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以紅樹莓酒精發(fā)酵后的果渣為原料,分別以酸法(鹽酸)和堿法(氫氧化鈉)提取SDF,通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取紅樹莓果渣SDF的最佳工藝參數(shù),以期使用較少的提取溶劑、較短的提取時(shí)間和較低的提取溫度獲得可觀的SDF,為紅樹莓果渣膳食纖維的提取及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓果渣 山東黑尚莓生物技術(shù)發(fā)展有限公司;氫氧化鈉 天津市鼎盛鑫化工有限公司;濃鹽酸 石家莊市銳博科技有限公司;95%乙醇 北京北化福瑞科技有限公司;濃硫酸 萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠;硫酸銅 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硼酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸鎂 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;以上試劑皆為分析純。

KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司;Synergy UV超純水制備儀器 法國Millipore公司;TGL16 M凱達(dá)離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;GR-240熱空氣消毒箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HH-6恒溫水浴鍋 北京華瑞新成科技有限公司;BJ-400多功能粉碎機(jī) 德清拜杰電器有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ME204E電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;KSW-40-11箱式馬弗爐 龍口市文太電爐制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.1.1 酸法提取步驟 紅樹莓果渣烘干、粉碎、過0.22 mm(60目)篩后,準(zhǔn)確稱取0.5 g果渣,以一定料液比加入一定體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%和5%的鹽酸溶液,以一定的提取溫度水浴提取一定時(shí)間后過濾,濾液在熱空氣消毒箱中60 ℃溫度下加熱蒸發(fā)至原體積的1/5,然后用4倍體積的95%乙醇沉淀,靜置過夜,5000 r/min離心15 min,離心后棄掉上清液,將沉淀在70 ℃環(huán)境下烘干至恒定的重量得SDF[20-22]。

1.2.1.2 堿法提取步驟 紅樹莓果渣烘干、粉碎、過0.22 mm(60目)篩后,準(zhǔn)確稱取0.5 g果渣加入一定體積的濃度分別為2、5、8、11、14 g/L的氫氧化鈉溶液,以一定的提取溫度水浴提取一定時(shí)間后過濾,使用鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH為4.5后再次抽濾,然后調(diào)節(jié)濾液pH為中性并濃縮至原體積的1/5,用4倍體積的95%乙醇沉淀,靜置過夜,5000 r/min離心15 min,離心后棄掉上清液,將沉淀在70 ℃環(huán)境下烘干至恒定的重量得SDF[23]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 膳食纖維化學(xué)提取法的得率主要受提取液成分、pH、液料比、提取溫度和提取時(shí)間等工藝因素的影響[8],因此本實(shí)驗(yàn)分別選取鹽酸和氫氧化鈉溶液為提取液,以提取液濃度、液料比、提取溫度和提取時(shí)間為影響因素設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 酸水解單因素實(shí)驗(yàn) 選取鹽酸濃度為4%,液料比為20∶1 (mL/g),提取溫度為60 ℃,提取時(shí)間為20 min作為各因素的固定水平,分別以鹽酸提取濃度(1%、2%、3%、4%、5%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g),提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)和提取時(shí)間(20、40、60、80、100 min)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),探討酸法提取對(duì)紅樹莓果渣SDF得率的影響。

1.2.2.2 堿水解單因素實(shí)驗(yàn) 選取氫氧化鈉濃度為8 g/L,液料比為20∶1 (mL/g),提取溫度為45 ℃,提取時(shí)間為20 min作為各因素的固定水平,分別以氫氧化鈉溶液提取濃度(2、5、8、11、14 g/L)、液料比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 (mL/g)、提取溫度(30、35、40、45、50 ℃)和提取時(shí)間(20、40、60、80、100 min)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),探討堿法提取對(duì)紅樹莓果渣SDF得率的影響。

1.2.3 兩種提取工藝的比較 根據(jù)GB 5009.88-2014分別測定酸法和堿法提取物中SDF的含量,其中蛋白質(zhì)的測定依據(jù)GB 5009.5-2016,灰分的測定依據(jù)GB 5009.4-2016,比較分析兩種提取方法獲得產(chǎn)品的純度;結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)獲得的不同提取條件下酸法和堿法的平均實(shí)際得率,確定一種較優(yōu)的化學(xué)提取法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化堿法提取工藝試驗(yàn) 在堿法單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken 4因素3水平的設(shè)計(jì)方案,以紅樹莓果渣SDF得率為響應(yīng)值,以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、氫氧化鈉濃度(C)和液料比(D)為考察因素做優(yōu)化試驗(yàn),因素和水平詳見表1。

1.2.5 指標(biāo)計(jì)算

圖1 提取溫度、提取時(shí)間、鹽酸濃度和液料比對(duì)SDF得率的影響Fig.1 Effects of temperature,time,concentration of HCl and liquid-solid ratio on the yield of SDF

1.2.5.1 SDF得率計(jì)算公式

式中:m是稱重的紅樹莓果渣粉的質(zhì)量,g;m1是干燥的空離心管的重量,mg;m2是離心管和干燥稱重的SDF質(zhì)量之和,mg。

1.2.5.2 SDF提取物純度計(jì)算公式

式中:M是稱重的SDF提取物的質(zhì)量,mg;M1是提取物中蛋白質(zhì)的質(zhì)量,mg;M2是提取物中灰分的質(zhì)量,mg。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù),Microsoft excel 2012處理數(shù)據(jù);SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析,并進(jìn)行LSD多重比較;Design-Expert 8.0完成響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅樹莓果渣SDF酸解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1a可知,隨著提取溫度的升高,SDF得率呈上升趨勢,尤其是60～70 ℃范圍內(nèi)SDF得率大幅度增長,但80 ℃時(shí)并沒有顯著(P>0.05)提高SDF得率,說明此時(shí)高溫一方面加大了溶液的黏度,限制了膳食纖維的進(jìn)一步溶出;另一方面高溫在一定程度上改變了膳食纖維的結(jié)構(gòu),降低了其醇沉效果[8]?？紤]到溫度越高,能耗越大,最終選取70 ℃為最佳提取溫度。

2.1.2 提取時(shí)間的影響 由圖1b可知,隨著提取時(shí)間延長,SDF得率呈先上升后下降的趨勢,在60 min時(shí)SDF得率顯著增加(P<0.05);超過60 min后SDF得率開始下降,說明60 min后部分多糖開始被酸水解而不能被乙醇沉淀。最終選取60 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.3 鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由圖1c可知,鹽酸濃度在1%～2%范圍內(nèi)SDF得率顯著增加(P<0.05),當(dāng)濃度大于2%時(shí),SDF得率隨鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈下降趨勢,且濃度為4%時(shí)得率顯著降低(P<0.05),4%以后提取效果趨于穩(wěn)定。由于酸性條件下原果膠水解而變成水溶性果膠,隨著酸濃度增加SDF得率不斷增加,當(dāng)酸濃度達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),會(huì)引起果渣中蛋白質(zhì)變性而凝固,包裹水溶性膳食纖維阻礙其釋出[8],導(dǎo)致SDF得率下降;另外,當(dāng)酸度過高時(shí),可溶性膳食纖維自身也會(huì)發(fā)生降解[20]。因此,當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到2%時(shí),SDF得率已經(jīng)達(dá)到最大值,不宜提升鹽酸濃度進(jìn)行SDF的提取。最終選取2%為最佳鹽酸濃度。

圖2 提取溫度、提取時(shí)間、氫氧化鈉濃度和液料比對(duì)SDF得率的影響Fig.2 Effects of temperature,time,NaOH concentraten and liquid-solid ratio on the yield of SDF

2.1.4 液料比的影響 圖1d結(jié)果顯示,液料比在10∶1～15∶1 (mL/g)范圍內(nèi)SDF得率顯著增加(P<0.05),但15∶1～30∶1 (mL/g)范圍內(nèi),隨著液料比降低SDF得率并沒有顯著變化(P>0.05),說明當(dāng)液料比為15∶1 (mL/g)時(shí),SDF由紅樹莓果渣向提取液擴(kuò)散速率已經(jīng)達(dá)到最大,溶解量亦達(dá)到最大,而液料比進(jìn)一步降低時(shí),水溶性膳食纖維得率變化不大,其溶解速率已達(dá)到平衡。最終選取15∶1 (mL/g)為最佳酸解的液料比。

2.2 紅樹莓果渣SDF堿解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取溫度的影響 由圖2a可知,在30～35 ℃時(shí),隨著提取溫度的升高,紅樹莓果渣SDF的得率緩慢增加,但并不顯著(P>0.05);隨著提取溫度的進(jìn)一步升高,分子熱運(yùn)動(dòng)的加快加速了SDF的溶出速度,40 ℃溫度下的得率顯著高于30 ℃的得率(P<0.05);當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí),SDF得率呈下降趨勢,說明高溫導(dǎo)致SDF的部分成分降解,導(dǎo)致SDF得率的降低[8]。因此提取溫度不宜超過40 ℃。

2.2.2 提取時(shí)間的影響 由圖2b可知,在設(shè)置的提取時(shí)間內(nèi),紅樹莓果渣SDF得率隨浸提時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。20～40 min的水解并未出現(xiàn)顯著性增加,當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí),SDF得率顯著高于40 min(P<0.05),達(dá)到最大值,提取時(shí)間為80 min,SDF得率顯著低于60 min(P<0.05),說明堿液長時(shí)間的作用破壞了紅樹莓果渣SDF的結(jié)構(gòu),使其不完全醇沉或無法醇沉,致使SDF得率減少。因此最佳提取時(shí)間在60 min左右。

2.2.3 氫氧化鈉濃度的影響 由圖2c可知,在浸提液氫氧化鈉濃度2～5 g/L范圍內(nèi),氫氧化鈉濃度的增加并未顯著(P>0.05)影響紅樹莓果渣SDF的得率,而8 g/L的得率顯著(P<0.05)高于5 g/L,達(dá)到最大值。隨著浸提液氫氧化鈉濃度的進(jìn)一步增加,SDF得率出現(xiàn)顯著降低(P<0.05),當(dāng)氫氧化鈉濃度為14 g/L時(shí),其得率比8 g/L降低了27%,說明強(qiáng)堿性條件有利于SDF的浸提,但當(dāng)氫氧化鈉濃度過高時(shí)會(huì)破壞SDF的結(jié)構(gòu)使其降解,進(jìn)而影響SDF的得率。因此浸提液氫氧化鈉濃度在8 g/L左右時(shí)是堿法提取紅樹莓果渣SDF的較適條件。

2.2.4 液料比的影響 由圖2d可知,液料比在15∶1～25∶1 (mL/g)范圍內(nèi),紅樹莓果渣SDF得率隨著液料比的增加逐漸增加,且25∶1 (mL/g)時(shí)的得率顯著高于15∶1 (mL/g)時(shí)的得率(P<0.05),之后隨著液料比的增加,SDF得率趨于穩(wěn)定,這是因?yàn)橐毫媳容^低時(shí),提取液的物料黏度較大不利于SDF的過濾造成紅樹莓果渣SDF得率較低,當(dāng)液料比增加至25∶1 (mL/g)時(shí),物料黏度對(duì)SDF的提取不再產(chǎn)生顯著影響,進(jìn)而隨著液料比的進(jìn)一步增加其SDF得率趨于穩(wěn)定。綜合考慮浸提效果和能源消耗,最終將液料比固定為25∶1 (mL/g)。

圖3 酸法和堿法提取紅樹莓果渣SDF得率Fig.3 SDF yield of raspberry pomace extracted by acid process and alkaline process

2.3 紅樹莓果渣SDF兩種提取工藝比較分析

單因素實(shí)驗(yàn)中堿法和酸法工藝條件下的平均得率分別是21.45%±2.30%和3.39%±0.68%,前者是后者的6.33倍,說明堿性條件比酸性條件更有利于紅樹莓果渣原果膠的水解而變成水溶性果膠,此外堿液破壞氫共價(jià)鍵也會(huì)促進(jìn)各種多糖的溶出,提高SDF得率[8];依據(jù)GB5009.88-2014中SDF測定方法分別分析堿法和酸法SDF提取物純度,結(jié)果表明兩種工藝條件獲得的SDF中蛋白質(zhì)含量分別為3.66%和3.69%,灰分含量分別為22.56%和20.14%,由此得出平均純度分別為73.84%和76.17%,堿法的純度與酸法相近。綜合考慮SDF平均得率和純度,堿法工藝條件SDF提取效果整體優(yōu)于酸法,因此,本試驗(yàn)以堿法提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表2 堿法響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of response surface methodology of alkaline process

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression equation by response surface

注:**,極顯著(P<0.01);*,顯著(P<0.05)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化堿法提取工藝參數(shù)試驗(yàn)

2.4.1 堿法Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。使用Design Expert 8.0對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合,建立紅樹莓果渣SDF得率和影響因素之間的回歸方程模型為:

SDF得率=24.45-0.22A+0.27B+0.19C+0.24D+0.06AB+0.02AC-0.24AD-0.28BC-0.43BD-0.26CD-1.89A2-1.45B2-1.70C2-2.08D2

試驗(yàn)中B對(duì)紅樹莓果渣SDF得率的影響極顯著(P<0.01),而A、C和D的影響為顯著(P<0.05);B和D交互項(xiàng)的P值均小于0.05,說明兩因素間的交互作用對(duì)SDF得率的影響顯著(P<0.05),而其它因素間的相互影響均大于0.05,對(duì)SDF得率的影響為不顯著;F值的比較結(jié)果顯示,4個(gè)因素對(duì)SDF得率影響的程度由大至小依次為B、D、A和C。

2.4.2 最佳堿法提取SDF工藝條件的確定 根據(jù)回歸方程,提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、氫氧化鈉濃度(C)和液料比(D)四個(gè)因素間交互作用下的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖4所示。三維響應(yīng)面可以反映每兩個(gè)因素間的交互作用,等高線形狀越趨向于橢圓形,其交互作用越顯著[25-26]。由圖4e可知提取時(shí)間和液料比之間交互作用顯著。隨著提取時(shí)間和液料比的增加,紅樹莓果渣SDF得率不斷升高;當(dāng)提取時(shí)間延長至61.65 min后,SDF得率達(dá)到最大值;當(dāng)提取時(shí)間和液料比繼續(xù)增加時(shí),SDF得率趨于穩(wěn)定。當(dāng)提取時(shí)間控制在61.65 min,液料比為25.25∶1 (mL/g)時(shí),能夠提高SDF得率。圖4a～4d和圖4f中各因素在所選取的條件范圍內(nèi)也均有極大值,通過該響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析可以得到提取紅樹莓果渣SDF的最優(yōu)工藝參數(shù)。

由此確定最佳提取工藝條件為:提取溫度是39.71 ℃,提取時(shí)間是61.65 min,氫氧化鈉濃度是8.13 g/L,液料比是25.25∶1 (mL/g),此時(shí)的紅樹莓果渣預(yù)測SDF得率為24.48%。將以上條件校正為:提取溫度40 ℃,提取時(shí)間62 min,氫氧化鈉濃度是8.13 g/L,液料比是25∶1 (mL/g)。紅樹莓果渣烘干、粉碎、過0.22 mm(60目)篩后,準(zhǔn)確稱取0.5 g果渣在該提取條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),紅樹莓果渣的平均得率為 24.03%±1.01%,與理論預(yù)測值相差0.45%,說明該回歸模型與實(shí)際情況的擬合較好,充分驗(yàn)證了所建模型的準(zhǔn)確性,得到的響應(yīng)曲面優(yōu)化的工藝條件可行,具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

酸法和堿法均可應(yīng)用于紅樹莓果渣SDF的提取,提取物SDF純度較高,平均純度分別為73.84%和76.17%,但是堿法得率明顯高于酸法,分別為21.45%±2.30%和3.39%±0.68%。因此,堿法提取效果整體優(yōu)于酸法。

通過對(duì)堿法提取進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析,所獲得紅樹莓果渣SDF提取優(yōu)化工藝參數(shù)最終確定為:提取溫度40 ℃,提取時(shí)間62 min,氫氧化鈉濃度8.13 g/L,液料比25∶1 (mL/g)。在此工藝參數(shù)條件下進(jìn)行驗(yàn)證,紅樹莓果渣的SDF平均得率為 24.03%±1.01%,與理論預(yù)測值24.48%基本相符,充分驗(yàn)證了所建模型的準(zhǔn)確性,得到的響應(yīng)曲面優(yōu)化的工藝條件可行,可為紅樹莓果渣SDF的提取及應(yīng)用提供一定的理論參考。