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(1.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所,湖北武漢 430014;2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA),假單胞菌屬,對(duì)營養(yǎng)條件要求較低,且易在潮濕環(huán)境中存活,因而在自然界中分布很廣泛,不論土壤還是水環(huán)境都能檢測(cè)到,甚至在人體的皮膚、呼吸道以及消化道等部位都有定植。在蔡雙福等[1]的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),在食品領(lǐng)域,涼拌菜、熟肉制品、飲用水等產(chǎn)品經(jīng)常存在被PA污染的狀況。此外,由于PA能產(chǎn)生多種致病因子,很容易引起免疫力低下的病人感染。在治療過程中若不合理地使用抗生素,還會(huì)引發(fā)PA耐藥性問題,因此PA引起的感染以及其耐藥性都會(huì)給人類健康帶來很大的潛在危害,如何有效檢測(cè)耐藥性PA也成為醫(yī)學(xué)界重點(diǎn)關(guān)注的問題[2]。

GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》[3]和GB 19298-2014《包裝飲用水》[4]都明確要求PA不得檢出,最新版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年)[5]也要求化妝品中的PA不得檢出。然而多個(gè)學(xué)者研究表明,在PA的檢驗(yàn)過程中存在一些問題,比如漏檢[6]、傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢驗(yàn)效率不高[7]等問題,因此PA的有效檢測(cè)問題也越來越受到學(xué)者的關(guān)注。

在微生物檢測(cè)領(lǐng)域,分子檢驗(yàn)技術(shù)日趨成熟,以蛋白分析為基礎(chǔ)的免疫法、質(zhì)譜、光譜等大型儀器分析方法,隨著信息技術(shù)、光電技術(shù)和儀器制造業(yè)的發(fā)展,在實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化微生物鑒定中的優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn)。由于PA自身的其基因組龐大,能依據(jù)環(huán)境的變化精密調(diào)節(jié)各種毒力因子的合成[8],因此無論是以鑒定特定基因?yàn)榛A(chǔ)的檢驗(yàn)技術(shù),或是以識(shí)別特異性蛋白為基礎(chǔ)的檢驗(yàn)技術(shù),在分離鑒定PA的過程中都存在一定的局限性。近些年學(xué)者們?nèi)栽诓粩鄧L試,以期實(shí)現(xiàn)迅速并準(zhǔn)確地分析各類樣品中的PA污染狀況。本文將從傳統(tǒng)檢測(cè)方法，以核酸、蛋白質(zhì)、全細(xì)胞為研究對(duì)象的檢驗(yàn)方法，對(duì)近幾年P(guān)A的檢測(cè)方法的發(fā)展進(jìn)行綜述。

1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法

鑒定特定微生物的傳統(tǒng)方法一般是先觀察微生物的形態(tài)學(xué)特征,再輔以生理生化確認(rèn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判斷菌種類型。傳統(tǒng)培養(yǎng)法雖然實(shí)驗(yàn)周期長,但因其實(shí)用性、可靠性強(qiáng),依然是不可忽視的檢測(cè)方法[9]。許潘健等[10]從分析PA的代謝產(chǎn)物入手,將紅棗、黨參、枸杞子等中藥加入營養(yǎng)瓊脂以觀察對(duì)PA綠膿素產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明與金氏B培養(yǎng)基相比,中藥瓊脂更能有效地促進(jìn)PA綠膿素的產(chǎn)生,從而使傳統(tǒng)培養(yǎng)檢驗(yàn)PA方法的效率有了進(jìn)一步提升。Akoglu等[11]在十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基中加入苯扎溴銨,改良后的培養(yǎng)基應(yīng)用于乳制品的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)苯扎溴銨對(duì)熒光假單胞具有良好的抑制作用,有效地提高了原培養(yǎng)基對(duì)PA的選擇性。Weiser等[12]評(píng)價(jià)了四種培養(yǎng)基(乙酰胺瓊脂、假單胞CN培養(yǎng)基、假單胞分離培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基)對(duì)PA的分離效果,結(jié)果表明,乙酰胺瓊脂選擇性較差,而顯色培養(yǎng)基選擇性最高可達(dá)70%,靈敏度可達(dá)到95%。高飛等[13]利用PA產(chǎn)生一種特殊酶來水解Pseudalert試劑中熒光底物,并依據(jù)酶在水解底物的同時(shí)產(chǎn)生的熒光變化來判斷樣本中是否存在PA。在實(shí)驗(yàn)過程中采用含Pseudalert試劑的生理鹽水稀釋樣本,加入97孔無菌定量盤內(nèi)在(36±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,對(duì)有黃色反應(yīng)且有藍(lán)色熒光的樣本,通過查相關(guān)MPN表對(duì)PA進(jìn)行定量,將該方法用于化妝品中可在24 h內(nèi)即可得到結(jié)果,無需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。Sartory等[14]也評(píng)價(jià)了基于Pseudalert試劑的MPN法與濾膜法定量檢測(cè)方面的差異,結(jié)果同樣顯示Pseudalert-MPN法在檢測(cè)泳池水樣中的PA時(shí)表現(xiàn)出較好的時(shí)效性。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高,同時(shí)可以直觀地觀察結(jié)果,很適合基層實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn),但PA檢測(cè)中亟待解決的問題仍然是培養(yǎng)時(shí)間長,且在同一種培養(yǎng)基上PA的菌落形態(tài)也呈多樣性,需要確認(rèn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果[7]。目前市面的選擇性培養(yǎng)基特異性仍然有待提高,尤其是不能避免其他革蘭氏陰性菌的生長,選擇更具特異性的生化特征作為PA分離標(biāo)準(zhǔn),以區(qū)別樣品中其他類似菌如熒光假單胞、惡臭假單胞菌,依舊是未來培養(yǎng)法研究的主要方向。

2 以核酸為分析目標(biāo)的檢測(cè)方法

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)憑借強(qiáng)特異性、高靈敏度、簡便省時(shí)等特點(diǎn),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在PA的檢測(cè)中,甚至針對(duì)PA基因組的測(cè)序工作也已經(jīng)完成[15],但全基因測(cè)序方法在日常檢驗(yàn)工作中仍過于繁瑣,目前常用的分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法主要有以下幾類:以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)為基礎(chǔ)的單一PCR、多重PCR、定量PCR技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)和新興的核酸生物傳感器技術(shù)[16]。

2.1 PCR技術(shù)

從普通PCR、單一定量PCR、多重定量PCR到熒光定量PCR,這一類的檢驗(yàn)技術(shù)都已經(jīng)應(yīng)用在PA的檢驗(yàn)中。由于PCR法對(duì)DNA片段濃度有一定要求,為了提高檢測(cè)靈敏度,很多研究者在預(yù)處理過程中采用預(yù)增菌[17]、磁珠富集、巢式PCR方法來獲得較高濃度的目標(biāo)DNA片段[18]。此外普通PCR法不能區(qū)分死菌與活菌,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示假陽性[19],在發(fā)現(xiàn)疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide,EMA)和疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)能與死細(xì)菌基因組DNA結(jié)合后,已經(jīng)有學(xué)者建立了EMA-PCR[20]或PMA-PCR方法[21],并將該方法應(yīng)用到樣品中PA活菌的檢測(cè)中。為了進(jìn)一步提高檢驗(yàn)靈敏度和特異性,在普通PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或染料,通過擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的累積來反映體系中模板濃度變化的熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)檢測(cè)法發(fā)展起來。基于熒光定量PA檢測(cè)方法也已經(jīng)有很多學(xué)者進(jìn)行了嘗試[22]。依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?qPCR又可以分為單重定量和多重定量法。在利用多重定量PCR檢測(cè)PA主要有兩個(gè)研究方向,一種是在同一反應(yīng)體系中針對(duì)包括PA在內(nèi)多種微生物的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,可以同時(shí)完成幾種微生物的檢驗(yàn)[23];另一種是在一個(gè)體系內(nèi)對(duì)PA的多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增[24],以提供更準(zhǔn)確的檢測(cè)信息。與常規(guī)的核酸擴(kuò)增法相比,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)利用4個(gè)引物識(shí)別靶基因6個(gè)區(qū)域,能在恒溫條件下快速完成核酸擴(kuò)增,因此是一種靈敏度更好、效率更高、結(jié)果判定更簡單而且經(jīng)濟(jì)有效的檢驗(yàn)方法[25]。表1列舉了近幾年應(yīng)用分子生物方法檢驗(yàn)PA不同靶點(diǎn)的部分實(shí)例。

由表1可以看出,憑借高靈敏度、便攜性好、檢驗(yàn)條件要求低等特點(diǎn),LAMP技術(shù)成為繼PCR技術(shù)后近些年受研究人員青睞的PA檢測(cè)方法之一?？傮w來說,以核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法能夠達(dá)到快速、靈敏、高精確度的檢測(cè),但反應(yīng)難以控制因DNA污染出現(xiàn)的假陽性和樣品中其他物質(zhì)干擾出現(xiàn)的假陰性。

2.2 高通量核酸分析技術(shù)

近些年發(fā)展的基因芯片技術(shù),通過集成定量PCR同一反應(yīng)體系,實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)PA的多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,又可以同時(shí)針對(duì)包括PA在內(nèi)的不同微生物的目的基因擴(kuò)增,在檢驗(yàn)效率及PA陽性檢出率方面有了進(jìn)一步的提高。董進(jìn)浪等[31]以酶顯色技術(shù)為基礎(chǔ),根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因特點(diǎn),構(gòu)建了能同時(shí)針對(duì)包括PA在內(nèi)的8種細(xì)菌性肺炎常見的病原菌進(jìn)行檢驗(yàn)的基因芯片,這種基因芯片法檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、通量高,還具有特別的診斷價(jià)值,但制作過程較繁瑣復(fù)雜,成本偏高。

表1 不同靶點(diǎn)檢測(cè)PA應(yīng)用實(shí)例Table 1 Application of different target gene used for detection of Pseudomonas aeruginosa

最近發(fā)展起來的高通量測(cè)序技術(shù)使得微生物檢驗(yàn)?zāi)軌蛞愿叩乃俣冗M(jìn)行大規(guī)模的平行分析,并進(jìn)一步帶動(dòng)了檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。美國FDA發(fā)布的“全基因組測(cè)序技術(shù)(WGS)應(yīng)用問答”更有助于研究人員在疾病暴發(fā)時(shí)可以更快地鑒定致病微生物,明確致病菌的毒力因子,確認(rèn)疫情的源頭,起到預(yù)防食源性疾病暴發(fā)的作用。在防治PA引發(fā)的感染方面,Witney等[32]通過對(duì)英國兩家醫(yī)院中引起泛耐藥性PA進(jìn)行的全基因組測(cè)序分析,不但確定了該菌株的耐藥基因、毒力因子,并且發(fā)現(xiàn)該菌株的基因組與近期感染者、水槽及下水道中菌株具有高度相似的序列,從而得出該菌株已經(jīng)在醫(yī)院中流行多年的結(jié)論。

2.3 DNA生物傳感技術(shù)

隨著人們對(duì)低成本高精度檢測(cè)器的進(jìn)一步追求,利用DNA為感應(yīng)元件,通過將DNA與其他元器件相互作用的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換成物理信號(hào)的生物傳感器也在PA的檢測(cè)中廣泛應(yīng)用起來。Amini等[33]以ETA基因?yàn)榘谢?設(shè)計(jì)出一種以DNA條形碼技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)PA的熒光生物傳感器。該傳感器以納米金粒子(GNPS)連接特異性識(shí)別ETA基因的探針和條碼DNA,納米磁性粒子(MNPs)連接特異性捕獲探針識(shí)別ETA基因另一部分序列。將兩種納米粒子與ETA基因混合后,ETA基因與MNPs復(fù)合物(MNPs-2ndDNA探針-ETA基因)結(jié)合在基底表面,再結(jié)合GNPS形成三明治結(jié)構(gòu)(MNPs-2ndDNA探針-ETA基因-1stDNA探針-GNPs-條形碼DNA)。采用二硫蘇糖醇(DTT)處理后,三明治結(jié)構(gòu)中的條形碼DNA被釋放,通過檢測(cè)此過程中產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào),可以間接得到ETA基因的含量。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌以及霍亂弧菌并無交叉反應(yīng),在最佳條件下,該方法檢出限為1.2 ng/mL。同樣采用納米技術(shù),Amini等[34]還設(shè)計(jì)出另一種以核酸內(nèi)切酶為基礎(chǔ)的生物傳感器,該技術(shù)采用檸檬酸鹽還原法制備GNPS,使其形成帶負(fù)電荷的納米粒子,因無法聚集而使其表面呈紅色。將紅色GNPS連接特異性探針后再與ETA基因雜交,此時(shí)在反應(yīng)體系中加入BamHI核酸內(nèi)切酶,直至將GNPS上目的基因全部切掉。在NaCl存在的條件下,GNPS不再帶負(fù)電荷而發(fā)生聚集而呈紫色,通過檢測(cè)過程中的顏色變化可以實(shí)現(xiàn)PA的定量檢測(cè)。在目標(biāo)基因濃度達(dá)12.5 ng/mL時(shí),可以憑肉眼觀察到明顯顏色變化。Ji等[35]研制出一種水平剪切表面聲波(SH-SAW)生物傳感器,其基本原理是在交流電信號(hào)刺激下,SH-SAW會(huì)沿壓電基片表面?zhèn)鞑ァ．?dāng)傳播路徑上載荷的質(zhì)量發(fā)生變化,SH-SAW的振幅和相速度將隨之變化,進(jìn)而用這些變化來量化生物探針及其目標(biāo)序列的特定雜交情況。該傳感器采用LiTaO3壓電基片,通過測(cè)定特異性ss-DNA探針與PA互補(bǔ)序列的結(jié)合產(chǎn)生的相位漂移來檢測(cè)PA,該傳感器對(duì)PA核酸的檢出限達(dá)9.5 ng/mL。雖然壓電晶體型生物傳感器有著操作簡單、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn),但靈敏度還需要進(jìn)一步提高。

從表1的實(shí)例中觀察,在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域,各項(xiàng)研究中應(yīng)用的樣本類型比較集中,樣本主要為血液、尿液或拭子樣本,LAMP方法和多重定量PCR方法在醫(yī)學(xué)樣本中應(yīng)用已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)不經(jīng)過增菌直接檢驗(yàn),常用的靶基因都有較好的靈敏度,大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的檢驗(yàn)方法都在這幾類樣本中應(yīng)用較好,而Ertugrul等[36]的研究進(jìn)一步表明,各個(gè)毒素基因中fliC和toxA基因保守性更好;環(huán)境領(lǐng)域的樣本,主要樣本類型為水樣,因?yàn)闃颖境煞窒鄬?duì)簡單,因此各類檢測(cè)方法也有較好的應(yīng)用效果;但在食品領(lǐng)域中,高脂肪、高蛋白和高鹽的環(huán)境會(huì)對(duì)分子方法的應(yīng)用造成一定阻礙[37],因此針對(duì)這一領(lǐng)域的研究主要是液體類樣本,但由于菌體濃度限制,增菌或磁珠富集步驟仍然不可避免突破食品領(lǐng)域這一限制,如何最快富集PA,提高快速檢測(cè)的周期,方便監(jiān)督機(jī)構(gòu)迅速作出判斷,評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)就顯得尤為重要。

3 以多肽、蛋白質(zhì)為分析目標(biāo)的檢測(cè)方法

目前,以多肽、蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)開展的檢測(cè)研究主要包括基于抗原抗體結(jié)合的免疫法和基于細(xì)菌胞膜成分或表達(dá)的特異蛋白進(jìn)行鑒別的質(zhì)譜、光譜分析法。

3.1 免疫傳感器

免疫分析法是通過用酶、熒光或放射性物質(zhì)對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記,在發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)后放大免疫信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。Bekir等[38]設(shè)計(jì)的免疫傳感器將多克隆抗PA抗體固定于吡咯-3-羧酸玻碳電極上,并采用循環(huán)伏安法、阻抗譜法監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器靈敏度范圍達(dá)10～107CFU/mL。納米金(AuNPs)材料因能與之結(jié)合的生物大分子種類多,催化活性高且對(duì)電子的傳遞效率能有所提高,也廣泛應(yīng)用在各類生物傳感器中。Krithiga等[39]將新型納米技術(shù)與傳感器技術(shù)相結(jié)合,研制的PA免疫傳感器采用鈣/果膠-納米金粒子修飾的玻碳電極固定單克隆抗體,檢出限達(dá)9×102CFU/mL,靈敏度范圍為10～107CFU/mL,并具有高穩(wěn)定性、高選擇性、高重現(xiàn)性及高復(fù)用性等特點(diǎn)。Ellairaja等[40]根據(jù)熒光探針與葡萄糖-銀納米粒子結(jié)合時(shí)熒光信號(hào)減弱、熒光探針-葡萄糖-銀納米粒子-IgG結(jié)合時(shí)信號(hào)增強(qiáng)的原理,研制以納米銀技術(shù)為基礎(chǔ)的傳感器,通過監(jiān)測(cè)與納米銀顆粒-探針復(fù)合物結(jié)合時(shí)增強(qiáng)的熒光信號(hào)完成PA的檢測(cè),該傳感器最低檢測(cè)限達(dá)1.5 CFU/mL,并成功地完成水、土壤以及牛奶、果汁等食物中的PA檢測(cè)。

3.2 質(zhì)譜分析技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)主要通過分析細(xì)菌胞膜成分或表達(dá)的特異蛋白對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種群的鑒別。第一版使用MALDI-TOF-MS鑒定微生物的指導(dǎo)方針CLSI M58已于2017年4月發(fā)布,這標(biāo)志著業(yè)界已經(jīng)認(rèn)可將質(zhì)譜技術(shù)作為主流技術(shù)用于微生物常規(guī)鑒定。崔學(xué)文等[41]用MALDI-TOF-MS對(duì)15株P(guān)A和8株干擾菌進(jìn)行圖譜采集,應(yīng)用BioTyper和FlexAnalysis對(duì)圖譜進(jìn)行離子分析和比對(duì)鑒定,通過比較,MALDI-TOF-MS對(duì)15株P(guān)A鑒定結(jié)果和VITEK完全一致,這充分證明了這一技術(shù)的可靠性。Lüthje等[42]也成功地利用MALDI-TOF-MS對(duì)顯色培養(yǎng)基上386株菌(含PA)進(jìn)行分析,檢測(cè)結(jié)果基本不會(huì)受到顯色培養(yǎng)基中特殊成分的干擾。Lin等[43]將血液PA陽性培養(yǎng)物經(jīng)過兩段離心、溶血處理,利用MALDI-TOF-MS技術(shù)成功檢測(cè)到PA,大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間,降低了實(shí)驗(yàn)成本。Pereira等[44]先利用掃描電子顯微鏡和原子顯微鏡來觀察玻璃及聚丙烯上形成的生物膜不同時(shí)期的形態(tài)變化,再利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)不同材料上PA進(jìn)行分析,根據(jù)樹狀圖進(jìn)行聚類分析,結(jié)果表明,MALDI-TOF-MS技術(shù)能夠成功區(qū)分不同階段生長的PA。表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)也是通過檢測(cè)特異性蛋白來實(shí)現(xiàn)菌株的鑒別。肖代雯等[45]利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜采集20株P(guān)A的蛋白指紋圖譜,在相對(duì)分子量4000～11000 Da范圍內(nèi)進(jìn)行篩選,初步建立以19個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的蛋白峰構(gòu)成的蛋白指紋模型。對(duì)43株P(guān)A鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定方法及分子生物學(xué)結(jié)果相比符合率為97.7%。

4 以代謝產(chǎn)物為分析目標(biāo)的檢驗(yàn)技術(shù)

PA生長過程中分泌的次生代謝產(chǎn)物種類繁多,如鼠李糖脂、胞外多糖、酶類化合物幾丁質(zhì)酶、酸性磷酸酶[46]、碳青霉烯酶[47]。但在檢測(cè)領(lǐng)域,最受關(guān)注的次級(jí)代謝物是一類具有氧化還原活性的含雜氮環(huán)的小分子物質(zhì),統(tǒng)稱為吩嗪[48]。吩嗪類物質(zhì)主要包括綠膿菌素(PYO)、吩嗪-1-羧酸、吩嗪1-甲酰胺、5-甲基吩嗪-1-羧酸等。但由于很多細(xì)菌都會(huì)產(chǎn)生吩嗪類物質(zhì),唯有PYO,不但具有特殊的氧化還原活性和有特殊的顏色,而且是一種僅由PA特異性產(chǎn)生的化合物[49],所以成為PA最理想的標(biāo)志物之一。

4.1 電化學(xué)法

4.1.1 以綠膿菌素(PYO)為分析目標(biāo) 以分析PYO間接檢測(cè)PA的方法主要采用電化學(xué)方法。其主要是通過將特定代謝物在基質(zhì)中的電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成光電信號(hào)來實(shí)現(xiàn)的。Oziat等[50]以玻碳電極為工作電極,以Ag/AgCl電極為參比電極,以鉑箔作為對(duì)電極。利用循環(huán)伏安法和方波伏安法對(duì)4種主要代謝產(chǎn)物,2-庚基-4-喹諾酮(HHQ)、假單胞菌喹諾酮信號(hào)分子(PQS)、綠膿菌素(PYO)和2′-氨基苯乙酮(2-AA)的電化學(xué)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,在低電位條件下HHQ和2-AA反應(yīng)電位相近,較難區(qū)分,需要通過調(diào)整pH和提取樣本上清液才能達(dá)到較好的分離效果。因此PQS和PYO能在低電位下產(chǎn)生分離度較好的峰型,由此判斷這兩種代謝物是最適合電化學(xué)檢測(cè)PA的生物標(biāo)志物。Sismaet等[51]設(shè)計(jì)的一次性絲網(wǎng)印刷電極傳感器由碳基工作電極和對(duì)電極輔以Ag/AgCl材料的參比電極組成,通過分析傷口排出物的方波伏安圖可以判斷是否存在綠膿菌素成分,當(dāng)樣本中存在PA產(chǎn)生的綠膿菌素時(shí),伏安圖中會(huì)出現(xiàn)明顯的峰。這種電化學(xué)方法無需樣品制備,只需要7.5 μL樣品,不到1 min時(shí)間即可完成分析。通過與16S rRNA測(cè)序結(jié)果比較,該傳感器對(duì)假單胞菌的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到71%。Webster等[52]設(shè)計(jì)的碳電極傳感器,以人血、尿液、痰和肺泡灌洗液樣本,檢測(cè)PA綠膿菌素完成一次檢測(cè)只需要5 min左右的時(shí)間,非?？旖?而且整個(gè)檢測(cè)是直接基于樣本進(jìn)行的,不需要經(jīng)過篩選分離PA的環(huán)節(jié)。Santiveri等[53]的研究進(jìn)一步證明了綠膿菌素產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)非常明顯,即使在PA與多種致病菌混合培養(yǎng)時(shí),仍然能有效鑒別出PA。新型納米材料石墨烯因具有比表面積大、導(dǎo)電性良好、吸附力強(qiáng)、生物相容性高等特性,也被廣泛應(yīng)用在PA電化學(xué)傳感器中。Gandouzi等[54]以石墨烯-金納米顆粒搭建傳感平臺(tái)檢測(cè)綠膿菌素,檢出限為0.33 μmol/L,在實(shí)際樣品人血清、唾液和自來水的檢驗(yàn)中都有很好的應(yīng)用效果。Cernat等[55]改用納米復(fù)合材料石墨烯-聚吡咯-納米金材料搭建傳感平臺(tái)檢測(cè)綠膿菌素,這種材料在電子轉(zhuǎn)移速率和增加活性表面積方面表現(xiàn)更突出,在靈敏度、自動(dòng)化程度、價(jià)格成本等方面具有更大優(yōu)勢(shì)。

4.1.2 以揮發(fā)性物質(zhì)為分析目標(biāo) 除了以綠膿菌素為研究對(duì)象外,Suarez-Cuartina等[56]利用電子鼻技術(shù),通過對(duì)PA代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)(VOC)的分析達(dá)到檢測(cè)的目的,具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、操作簡單等特點(diǎn)。通過分析病人呼出氣體的揮發(fā)性有機(jī)成分就能確定PA的存在。但在靈敏度、穩(wěn)定性方面,電子鼻的氣體傳感技術(shù)還需進(jìn)一步提高。此外,如何在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種微生物方面還需要進(jìn)一步深入的研究。Kviatkovski等[9]設(shè)計(jì)的傳感器以PMT光電探測(cè)器捕捉由PA產(chǎn)生的2-氨基苯乙酮(2-AA)激活感應(yīng)元件而發(fā)出的波長490 nm的藍(lán)光,通過與光電倍增管的結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)2-AA的檢測(cè)。在實(shí)際樣本檢驗(yàn)中,通過收集外耳炎患者的耳中膿液樣本,該裝置能在2 nmol的水平上檢測(cè)到2-AA。因此得出揮發(fā)性2-AA可作為耳部感染PA的有效生物標(biāo)記物。

4.1.3 以培養(yǎng)環(huán)境的變化為分析目標(biāo) 電阻抗法也是近幾年發(fā)展起來的一種新型微生物快速檢測(cè)技術(shù)。Chabowski等[57]采用電阻抗法檢測(cè)PA,其設(shè)計(jì)的阻抗傳感器具體原理為當(dāng)PA在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖時(shí),PA的新陳代謝作用導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分發(fā)生變化,隨之會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的電導(dǎo)性和電阻抗能力發(fā)生改變,根據(jù)這種變化建模，從而通過測(cè)量這種PA變化幅度進(jìn)行檢測(cè)。

4.2 色譜法

以色譜法對(duì)PA代謝物的分析也主要是圍繞PYO展開的。Fernandez等[58]以HPLC方法分析了PA的3種代謝物,包括1-羥基吩嗪(一種綠膿菌素降解物)和吩嗪-1-羧酸。該方法以PA菌液上清液為樣本,以C18柱分析可以在32.4 min處檢測(cè)到PYO出峰;董卉[59]建立了反向HPLC法,以乙酸乙酯萃取發(fā)酵液,以乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相,在保留時(shí)間8.171～8.227 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)PYO的檢測(cè),并實(shí)現(xiàn)與其他吩嗪類化合物的有效分離,PYO的最低檢出限達(dá)0.262 μg/mL;Reszka等[60]進(jìn)一步建立了LC-MS方法分析PYO。該方法采用Waters Xbridge C18色譜柱分離,以甲酸-乙腈為流動(dòng)相,保留時(shí)間3.69 min處出峰,5 kV噴霧電壓,275 ℃毛細(xì)管溫度完成PYO檢測(cè)。Hamerly等[61]采用LC-MS分析PAO1代謝產(chǎn)物,并首次應(yīng)用MALDI-IMS質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)人工模擬被PA感染小鼠熱損傷組織中化合物進(jìn)行分析,確定銅綠假單胞菌和感染組織特有的代謝特征生物標(biāo)志物,成功實(shí)現(xiàn)了原位檢測(cè)組織中PA。

5 以全細(xì)胞為分析目標(biāo)的檢驗(yàn)技術(shù)

與動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞相比,PA的單個(gè)細(xì)胞相對(duì)較小,因此適用于PA全細(xì)胞檢測(cè)的研究方法相對(duì)較少。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)PA的分離鑒定,目前收集到的分析方法主要有以下三種:采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)單個(gè)菌體染色后分析、選擇與PA細(xì)胞結(jié)合率高的適體,分析適體結(jié)合后生成的光電信號(hào)或采用拉曼光譜對(duì)含PA生物量較多的單菌落進(jìn)行分析。

流式細(xì)胞術(shù)基于熒光激活細(xì)胞法,使細(xì)菌準(zhǔn)確迅速的進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)的96或384孔板,然后將被熒光色素染色的測(cè)量菌體用高能量激光照射,通過觀察在高速流動(dòng)狀態(tài)下的菌體產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度和波長變化,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同菌株的定性或定量檢測(cè)。Chakotiya等[67]為研究生姜對(duì)PA活力的影響,利用熒光染料碘化丙啶(PI)的膜滲透能力,實(shí)現(xiàn)了用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)完整PA和細(xì)胞膜破損PA的區(qū)分。Rüger等[68]將qT-RFLP與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合,用免疫熒光單克隆抗體標(biāo)記洋蔥伯克霍爾德菌,以麥胚凝集素標(biāo)記金黃色葡萄球菌,同時(shí)利用碘化丙啶PI標(biāo)記細(xì)胞膜破損的死菌,以SYBRGreen I能選擇性地標(biāo)記雙鏈DNA的特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)區(qū)分共培養(yǎng)的PA、洋蔥伯克霍爾德菌和金黃色葡萄球菌3種菌,并能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)3種菌的死菌和活菌的比例。

核酸適體是一種幾乎能與抗體相媲美的單鏈核酸分子,它是由SELEX技術(shù)篩選出來的能與靶分子特異性結(jié)合的DNA或RNA,并且其適用的靶分子范圍廣泛,不僅局限于核酸、抗體、金屬離子,甚至可以和細(xì)胞體特異性結(jié)合[69]。Kim等[70]分別采用量子點(diǎn)和異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記適體生物探針,利用適體與PA菌體結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化來確定水中PA的污染程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與QD標(biāo)記的適體相比,FITC標(biāo)記的適體與菌體結(jié)合能力更高。最適孵育時(shí)間為30 min,檢出限達(dá)5.07 cell/mL。Shi等[71]以磁珠/適體/多聚腺苷DNA為一體的“三明治結(jié)構(gòu)”實(shí)現(xiàn)了對(duì)PA的選擇性結(jié)合。當(dāng)樣品中存在PA時(shí),由于適體對(duì)PA的特異性吸附,“三明治結(jié)構(gòu)”中的多聚腺苷DNA會(huì)被PA取代。被釋放的多聚腺苷DNA遇到納米金粒子時(shí)會(huì)產(chǎn)生特殊的傳感信號(hào),通過對(duì)信號(hào)的分析從而間接實(shí)現(xiàn)對(duì)PA的檢測(cè)。該方法在緩沖液中檢出限可達(dá)9 CFU/mL,模擬血樣中為52 CFU/mL。

6 結(jié)論與展望

在醫(yī)學(xué)界,對(duì)耐藥性銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)是主要關(guān)注點(diǎn),但在環(huán)境領(lǐng)域和食品化妝品檢驗(yàn)領(lǐng)域,如何能即時(shí)、快速、簡單、準(zhǔn)確地完成實(shí)驗(yàn),以達(dá)到監(jiān)測(cè)監(jiān)管領(lǐng)域?qū)z驗(yàn)時(shí)效的要求,則是研究者對(duì)檢驗(yàn)方法的終極追求。

本文主要對(duì)近幾年應(yīng)用于不同領(lǐng)域的PA檢驗(yàn)方法進(jìn)行了綜述。對(duì)于PA檢驗(yàn)而言,分子生物學(xué)方法、蛋白免疫方法,幾大類儀器分析檢測(cè)手段幾乎都已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)各類樣品的定性檢驗(yàn),但是以質(zhì)譜色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的檢驗(yàn)技術(shù)儀器成本相對(duì)較高,生物傳感器類檢驗(yàn)方法在靈敏度方面略顯不足,但隨著與各種新技術(shù)的組合優(yōu)化過程,相信各類生物傳感器在與磁珠富集法的組合后,便攜簡單快速的生物傳感檢測(cè)法會(huì)具有很好的應(yīng)用前景;在定量檢驗(yàn)方面,傳統(tǒng)方法以及發(fā)展較早的分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法依然具有很明顯的優(yōu)勢(shì)。就樣本類型而言,環(huán)境樣本和醫(yī)學(xué)樣本相對(duì)簡單,而食品類樣本具有液態(tài)、固體、凝膠等多種狀態(tài),這種特性常會(huì)對(duì)分離和確認(rèn)產(chǎn)生干擾,因而實(shí)現(xiàn)快速定量檢測(cè)食源性微生物比臨床上診斷和環(huán)境樣品檢測(cè)面臨更多的挑戰(zhàn)。Karami等[72]的研究表明,環(huán)境中分離出的和臨床分離株在傳播方面顯著相關(guān)。環(huán)境中檢出的PA也有耐藥性,這說明在環(huán)境和食品領(lǐng)域中的PA檢測(cè)需要更多的重視,尤其應(yīng)多關(guān)注建立適合的檢測(cè)耐藥性PA的方法。

隨著時(shí)代的高度發(fā)展,新技術(shù)、新儀器不斷涌現(xiàn),各種檢驗(yàn)技術(shù)融合度也不斷提高,單純地使用任何一種方法都無法滿足多方面的要求。目前新型的檢驗(yàn)方法多是在基礎(chǔ)的檢驗(yàn)方法上改進(jìn)了前處理方法或改變了數(shù)據(jù)收集方式,再或者是在各種技術(shù)融合應(yīng)用的基礎(chǔ)上開發(fā)的新方法,已經(jīng)很難定義某項(xiàng)研究具體屬于哪類檢驗(yàn)領(lǐng)域。但層出不窮的檢驗(yàn)方法也存在缺乏相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以衡量具體方法有效性、適用性的問題,因而將現(xiàn)行前沿技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際檢驗(yàn)中還有很長的路要走。在研究者不斷的探索與創(chuàng)新中,PA的檢驗(yàn)才能不再受時(shí)間、地點(diǎn)、操作人員等條件的限制,才能實(shí)現(xiàn)高效檢測(cè),由此才能實(shí)現(xiàn)最大程度地降低PA對(duì)人類身體健康帶來的危害。