薛美靜， 李 英， 張 靖， 高澤文， 吳文濤， 王 揚(yáng)， 喻盛甫

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明650201

擬松材線蟲Bursaphelenchus mucronatus Mamiya＆ Enda 是松材線蟲B. xylophilus 的近緣種，兩者的遺傳背景十分相似，形態(tài)上很難區(qū)分，且生活習(xí)性、生活史和侵染循環(huán)等都相近(楊寶君等，2003)。 長期以來，松材線蟲被認(rèn)為是松樹萎蔫病的唯一病原(Fukuda et al.，1992； Kiyohara ＆ Tokushige，1971；Tamura，1983)。 研究表明，用無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲接種，均能使赤松和濕地松無菌苗發(fā)生萎蔫，而松材線蟲體表細(xì)菌單獨(dú)接種未能使無菌苗發(fā)病，這為松材線蟲是引起松樹萎蔫的唯一病原提供了直接證據(jù)(葉建仁和黃麟，2012； Zhu et al.，2012)。 作為松材線蟲的近緣種擬松材線蟲，學(xué)術(shù)界長期以來認(rèn)為其致病力極弱或根本不致病(湯勤和昌世翠，1989； 吳廣超等，2006； Futaik，1980；Mamiya ＆ Enda，1979)。 魏素珍等(2010)認(rèn)為，擬松材線蟲的致病性易受環(huán)境影響，一定條件下也能造成大片松樹的死亡，且分布范圍比松材線蟲更廣，在同一地區(qū)常常是擬松材線蟲先出現(xiàn)，然后才有松材線蟲出現(xiàn)。 因此，擬松材線蟲的致病性問題及其致病機(jī)制值得進(jìn)一步探索。 近年來，對云南、貴州等地的擬松材線蟲的研究發(fā)現(xiàn)，擬松材線蟲種群間存在明顯的致病性分化，室內(nèi)接種中部分?jǐn)M松材線蟲對3 年生松苗的致死速度甚至接近松材線蟲，在云南和貴州的部分林區(qū)也發(fā)現(xiàn)了擬松材線蟲單獨(dú)危害引起松樹萎蔫枯死的現(xiàn)象(李丹蕾，2005)。 但擬松材線蟲的致病力弱于松材線蟲卻是一個(gè)勿庸置疑的事實(shí)。 因此，研究擬松材線蟲和松材線蟲的致病性差異，對于全面認(rèn)識松樹線蟲萎蔫病的致病機(jī)理有重要意義。

線蟲對植物的致病性主要體現(xiàn)在2 個(gè)方面：一是線蟲在植物組織內(nèi)移動(dòng)時(shí)引起植物的機(jī)械損傷，二是線蟲通過口針注入植物細(xì)胞的食道腺分泌物誘發(fā)植物生理代謝改變。 線蟲食道腺分泌物被認(rèn)為是植物線蟲致病的關(guān)鍵因素，其中包含的物質(zhì)除碳水化合物外，主要是一些高濃度的蛋白，如各種水解酶類(纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和木質(zhì)素酶等)。 酶被認(rèn)為是松材線蟲病的主要致病因子，它直接參與樹木薄壁組織細(xì)胞死亡過程，影響整個(gè)形成層，導(dǎo)致樹木枯萎死亡(吳云和程柳，2018)。 這些酶的種類和數(shù)量在不同寄生階段和不同食道腺中均有差別，對植物細(xì)胞及其內(nèi)含物具有修飾作用，有利于線蟲的取食與移動(dòng)(Davis et al.，2000；Hussey，1989)。 纖維素酶具有分解纖維素的能力，能破壞松樹的細(xì)胞壁，使松樹內(nèi)部水分無法傳輸，從而導(dǎo)致松樹死亡(武瓊，2016)。 已有研究證明，線蟲食道腺分泌的纖維素酶在根結(jié)線蟲和胞囊線蟲的侵入和誘導(dǎo)取食點(diǎn)的形成中起了關(guān)鍵作用(Chen et al.，2005； Davis et al.，2004； Vanholme et al.，2004)。 松材線蟲的致病力也與蟲體分泌的纖維素酶活性相關(guān)(Kojima et al.，1994)。 在樹木早期出現(xiàn)病害階段，松材線蟲分泌出來的纖維素酶在其中起到?jīng)Q定性作用(王敏敏等，2006)。 從松材線蟲的提取液中也發(fā)現(xiàn)了纖維素酶的存在，且線蟲的毒性越強(qiáng)，纖維素酶的活性就越強(qiáng)。

擬松材線蟲是否分泌纖維素酶，以及纖維素酶與其致病力是否有關(guān)至今仍不清楚。 已有研究表明擬松材線蟲的遺傳多樣性高于松材線蟲，但松材線蟲和擬松材線蟲的致病力與地理距離和遺傳距離之間沒有必然的聯(lián)系(謝艷麗，2013)，這也間接表明擬松材線蟲致病力差異是由其他因素造成。鑒于此，本文在前期擬松材線蟲種群致病性測定的基礎(chǔ)上，以松材線蟲為對照對具有不同致病力的擬松材線蟲種群進(jìn)行纖維素酶活性測定，以期為擬松樹線蟲的致病機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

供試線蟲采自云南、貴州林區(qū)萎蔫枯死松樹上，經(jīng)過純化培養(yǎng)保存的7 個(gè)擬松材線蟲種群和1個(gè)松材線蟲種群(表1)，其中7 個(gè)擬松材線蟲種群對5 種4 年生松苗的致病力強(qiáng)弱排序?yàn)閅LX(云南瀘西)＞GY(貴州貴陽)＞YES(云南峨山)＞YSL(云南石林)＞YLP(云南羅平)＞YJC(云南江川)＞YXP(云南新平)(李丹蕾，2005)。

表1 供試線蟲及來源Table 1 Tested nematodes and sources

1.2 供試線蟲蟲體的蛋白提取液及分泌液的制備

將表1 中8 個(gè)線蟲種群經(jīng)純化后，依據(jù)嚴(yán)東輝和楊寶君(1997)的方法在灰葡萄孢Botrytis cinera Pers.上擴(kuò)大繁殖，收集線蟲并對其反復(fù)沖洗，最后濃縮成約105條線蟲懸浮液，置于M9 液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5 h 后，用M9 液體培養(yǎng)基沖洗3 次，所得的線蟲懸浮液分成2 份。 一份放入2 mL 的離心管中，加入1 mL M9 液體培養(yǎng)，放入-80 ℃冰箱中保存，低溫處理5 h 后放入冷凍干燥器中干燥7 h制成干粉，用少量0.01 mol·L-1pH7.2 的磷酸鹽緩沖液(含0.15 mol·L-1氯化鈉)稀釋制成勻漿液，勻漿液在12000 r·min-1下離心15 min，上清液即為蟲體蛋白提取液；另一份線蟲液重懸浮在1 mL M9液體培養(yǎng)液中，室溫下培養(yǎng)48 h 后在12000 r·min-1下離心15 min，上清液即為分泌液。 上述蟲體蛋白提取液和分泌液存貯于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 纖維素酶活性測定

1.3.1 線蟲提取液及分泌物中的蛋白質(zhì)含量測定

用分光光度計(jì)測出松材線蟲及擬松材線蟲提取液和分泌液在波長280 nm 處的光密度值，根據(jù)光密度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查對應(yīng)的蛋白值含量，做BAS 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3.2 瓊脂擴(kuò)散法比較纖維素酶活性 依據(jù)Mateos et al.(1992)的方法用0.2%的羧甲基纖維素(CMC)、1%的瓊脂和磷酸鹽緩沖液制成大約7 mm厚的反應(yīng)板，待反應(yīng)板冷卻后用打孔器打直徑為9 mm 的5 個(gè)孔，并編號按順序加入相同蛋白質(zhì)量的提取液、分泌液或1000 條活蟲，將反應(yīng)板入28 ℃溫箱中保溫反應(yīng)48 h，取出反應(yīng)板，用0.1%的剛果紅(80%的乙醇配制)染色6 min，用1 mol·L-1的氯化鈉漂洗30 min，拍照比較暈圈大小。 透明圈直徑越大，則表明其纖維素分解能力越強(qiáng)，即纖維素酶活性越高(張宇昊等，2004)。

1.3.3 DNS 法測定纖維素酶活性 依據(jù)索風(fēng)梅等(2004)的方法，以1%羧甲基纖維素作底物測定內(nèi)切β-l，4-葡聚糖酶(Cx 酶)的活性，底物均用檸檬酸緩沖液(pH 值5.6，0.2 mol·L-1)配制。 取上述底物0.2 mL、酶液0.01 mL 混勻，在45 ℃水浴保溫1 h 后，加入DNS 顯色劑0.2 mL，立即在沸水浴中顯色5 min，流水冷卻，稀釋定容至2.5 mL。 于490 nm 處測D 值，每處理重復(fù)3 次，同時(shí)設(shè)空白對照。以實(shí)驗(yàn)條件下單位蟲體數(shù)量(條)、單位時(shí)間(min)酶促反應(yīng)生成的還原糖(葡萄糖)量(mg)計(jì)算Cx酶活性，即：Cx=葡萄糖含量(mg)/線蟲量(條)×?xí)r間(h)。

1.4 纖維素酶同工酶分析

分別取各線蟲種群的蟲體蛋白提取液、分泌液、各100 條成蟲和幼蟲的蟲體蛋白提取液，采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳進(jìn)行纖維素同工酶分析(5%積層膠，分離膠10%，含0.2%羧甲基纖維素)(Rosso et al.，1999)。 電泳時(shí)積層膠電壓80 V分離膠電壓150 V。 然后將膠放入30 ℃的溫箱中保溫反應(yīng)7 h，再用0.1%的剛果紅(去離子水配制)染色30 min(胡凱基和楊寶君，1995)，最后用1 mol·L-1的氯化鈉漂洗退色至適當(dāng)，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲蟲體提取液、分泌液纖維素酶活性的瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)

在反應(yīng)板上松材線蟲及擬松材線蟲蟲體蛋白提取液、分泌液和1000 條線蟲樣點(diǎn)周圍出現(xiàn)了典型的反應(yīng)透明圈，其余部分呈現(xiàn)底物的紅色(圖1)，表明2 種線蟲蟲體都含有纖維素酶并向體外分泌。 測量發(fā)現(xiàn)，松材線蟲蟲體蛋白提取液、分泌物的樣點(diǎn)周圍出現(xiàn)的透明圈比擬松材線蟲分泌物的透明圈大，且具有顯著差異，說明相同單位體積的松材線蟲(YWD)蟲體蛋白提取液和分泌液中的纖維素酶活性高于擬松材線蟲。 7 個(gè)不同致病性的擬松材線蟲蟲體蛋白提取液、分泌物的樣點(diǎn)周圍出現(xiàn)的透明圈大小也存在差異，同樣致病力最強(qiáng)的的YLX 種群的透明圈顯著大于其他擬松材線蟲種群，致病力最弱的YXP 種群產(chǎn)生的透明圈最小(表2)。

2.2 線蟲蟲體蛋白提取液、分泌物纖維素酶活性的DNS 法定量測定

取相同蛋白質(zhì)含量的線蟲蟲體蛋白提取液、分泌物測定對羧甲基纖維素的內(nèi)切活性，結(jié)果如圖2所示。 松材線蟲種群YWD 的蟲體蛋白提取液、分泌物中的纖維素酶活性均遠(yuǎn)高于對應(yīng)所有的擬松材線蟲種群；各擬松材線蟲種群間纖維素酶活性差異較小，7 個(gè)擬松材線蟲種群蟲體蛋白提取液中纖維素酶活性的強(qiáng)弱順序依次為：YLX ＞GY ＞YES ＞YSL＞YLP＞YJC＞YXP，其中致病性最強(qiáng)的2 個(gè)擬松材線蟲種群YLX 種群和GY 種群在擬松材線蟲中表現(xiàn)出最強(qiáng)的纖維素酶活性，致病力最弱的YXP種群纖維素酶活性最弱。

2.3 纖維素酶同工酶分析

松材線蟲(YWD)和擬松材線蟲(GY、YLX、YXP)蟲體蛋白提取液和分泌液的纖維素酶同功酶電泳結(jié)果顯示，2 種線蟲均有3 條遷移率不同的譜帶C1、C2 和C3，其種內(nèi)同工酶譜型一致，而種間則有一定差異，擬松材線蟲的C2 譜帶寬于松材線蟲(圖3)。 對不同蟲態(tài)的纖維素同工酶分析發(fā)現(xiàn)，松材線蟲和擬松材線蟲的成蟲和幼蟲間均表現(xiàn)出一致的譜型(圖3B)，表明2 種線蟲纖維素酶基因的表達(dá)無階段性差異，纖維素酶基因的表達(dá)為各蟲態(tài)所必需。

圖1 瓊脂擴(kuò)散法測定線蟲纖維素酶活性Fig.1 Determination of nematode cellulase activity by means of agar diffusion

表2 瓊脂糖擴(kuò)散反應(yīng)對不同致病性線蟲種群形成的透明圈大小Table 2 Determination of the transparent circle size of agarose diffusion reaction on different pathogenic nematode populations

3 討論

關(guān)于纖維素酶在松材線蟲致病過程中的作用，國內(nèi)外已有較多的研究。 Odani et al.(1985)首先證明松材線蟲可以產(chǎn)生纖維素酶，并認(rèn)為松材線蟲產(chǎn)生的纖維素酶在松樹發(fā)病的早期至關(guān)重要；另研究證實(shí)，松材線蟲的體外分泌物中可以檢測到蛋白酶、過氧化物酶、淀粉酶和纖維素酶的活性(嚴(yán)東輝和楊寶君，1997)；在此基礎(chǔ)上，汪來發(fā)等(2005)分別用市售的上述4 種酶和松材線蟲分泌物接種3年生的黑松苗，發(fā)現(xiàn)只有纖維素酶和松材線蟲分泌物能夠?qū)е滤擅绠a(chǎn)生類似松樹萎蔫病的癥狀；Kojima et al.(1994)也發(fā)現(xiàn)松材線蟲強(qiáng)致病性株系的纖維素酶含量及活性比弱致病性株系的高。 根據(jù)上述研究結(jié)果可以初步認(rèn)為，松材線蟲分泌酶中最主要的是纖維素酶，是纖維素酶導(dǎo)致了松樹萎蔫病。而有關(guān)纖維素酶在擬松材線蟲致病過程中的作用研究較少，蔣麗雅和王曉蕓(1995)用纖維素酶擴(kuò)散法進(jìn)行纖維素酶的定性檢測，結(jié)果表明，松材線蟲蟲體含纖維素酶，并向體外分泌；擬松材線蟲不含纖維素酶，且不向體外分泌，因此認(rèn)為可以用檢測纖維素酶活性的方法來區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲。 而張奇等(2006)對松材線蟲分泌的纖維素酶進(jìn)行了分離純化，并制備了其特異性抗體，通過免疫學(xué)方法研究纖維素酶的生產(chǎn)和線蟲到松樹的入侵途徑，但是得到的纖維素酶特異性抗體對擬松材線蟲也存在一定的交叉反應(yīng)，其特異性還需進(jìn)一步證實(shí)。

本文通過對擬松材線蟲的蟲體蛋白提取物、分泌液和1000 條活蟲的纖維素酶瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，證實(shí)擬松材線蟲不僅體內(nèi)組織中含有纖維素酶，而且向體外分泌；同時(shí)，擬松材線蟲蟲體蛋白提取液和分泌液的纖維素酶DNS 法定量測定也顯示，擬松材線蟲的纖維素酶活性與致病性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，即致病性越強(qiáng)的擬松材線蟲種群其纖維素酶活性也越強(qiáng)。 因此可以推測與松材線蟲一致，纖維素酶也參與了擬松材線蟲的致病過程，可以初步認(rèn)定纖維素酶是松材線蟲和擬松材線蟲主要的致病相關(guān)酶類，會(huì)導(dǎo)致松樹萎蔫。

圖2 DNS 法測定線蟲蟲體提取液、分泌液纖維素酶活性Fig.2 Determination of cellulase activity in nematode extractions and secretions by DNS

圖3 松材線蟲及擬松材線蟲纖維素酶同工酶電泳Fig.3 Electrophoresis of cellulase isoenzymes of B. xylophilus and B. mucronatus

另外，對松材線蟲和擬松材線蟲的纖維素酶活性的比較發(fā)現(xiàn)，相同蛋白含量的松材線蟲蟲體蛋白提取液和分泌液中的纖維素酶活性遠(yuǎn)高于對應(yīng)的擬松材線蟲，這一結(jié)果也似乎暗示松材線蟲和擬松材線蟲的致病性差異可能與纖維素酶活性相關(guān)，但無法判斷纖維素酶活性的差異是由于2 種線蟲分泌的纖維素酶本身分解纖維素的效率不同還是由于分泌的纖維素酶數(shù)量不同引起的。 采用聚丙烯酰胺電泳對2 種線蟲的纖維素同工酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)松材線蟲和擬松材線蟲的纖維素酶同工酶譜型略有差異，這與胡凱基和楊寶君(1995)的結(jié)果一致。 但董娜(2003)認(rèn)為，松材線蟲與擬松材線蟲分泌的纖維素酶在活性和酶譜帶上無種間區(qū)別，這與前兩者的研究結(jié)果是相沖突的，而成幼蟲的纖維素酶的譜帶在遷移率和量上均無明顯區(qū)別，各株系間也無區(qū)別，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。 故僅憑同工酶電泳譜型的細(xì)微差異判斷2 種線蟲纖維素酶的功能存在差異還顯得證據(jù)不足，因此有必要在下一步的研究中分別純化2 種線蟲的纖維素酶后測定其單位質(zhì)量的酶活性，或通過更多的技術(shù)和手段測定和驗(yàn)證2 個(gè)近緣線蟲種分泌的纖維素酶的活性。

此外，關(guān)于纖維素酶組分的研究和報(bào)道也屢見不鮮。 纖維素酶最初被認(rèn)為是動(dòng)物依賴于與其共生的微生物產(chǎn)生的，而自身不能產(chǎn)生和分泌(Watanabe et al.，1998)。 后來研究發(fā)現(xiàn)，白蟻和線蟲可以分泌內(nèi)源性的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，且相關(guān)基因已經(jīng)得到分離和克隆(Smant et al.，1998； Wang et al.，2003)。 Ma et al. (2009)證實(shí)松材線蟲和擬松材線蟲分泌的纖維素酶均包括完整的3 類酶：內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，且內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性最高。 隨著分子技術(shù)的伸延，RNA 干擾(RNAi)也被用在線蟲體外基因功能的分析中(Fire et al.，1998)，已成為研究控制植物寄生線蟲致病基因功能的有效生物學(xué)工具(Dutta et al.，2015； Lilley et al.，2007)，已有研究使用RNAi 來調(diào)查B. xylophilus 的基因功能(Cardoso ＆ Fonseca，2013； Kang et al.，2011，2012；Li et al.，2011； Park et al.，2008； Wang et al.，2012)。 在通過浸泡法對B. xylophilus 的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶致病性相關(guān)基因進(jìn)行RNA 干擾沉默時(shí)，纖維素酶活性結(jié)果顯示，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的表達(dá)受到抑制且酶的活性顯著降低(Cheng et al.，2010； Ma et al.，2011)。 但由于浸泡法具有不持續(xù)性和干擾效果逐步衰退的劣勢，僅限遺傳給子一代，子二代又恢復(fù)至原來的野生型，其應(yīng)用受到很大限制，因此有必要從其他途徑尋找高效、穩(wěn)定的RNAi 干擾體系(牛寶龍等，2003； 楊謙和趙惠賢，2005； 葉建仁和黃麟，2012)。 對此，也可以通過體外注射dsRNA 至松樹樹干或通過轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)dsRNA 進(jìn)而起到對線蟲的RNA 干擾反應(yīng)，但這些方面的研究工作到目前為止較少，有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中研究擬松材線蟲分泌的纖維素酶與致病性的關(guān)系，驗(yàn)證了纖維素酶活性與致病性呈正相關(guān)。 周立峰(2017)的研究結(jié)果表明，擬松材線蟲群體間的致病差異受生長環(huán)境、因長期的地理隔離導(dǎo)致的生殖隔離、與適應(yīng)寄主體內(nèi)生活以及脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白等因素有關(guān)。 擬松材線蟲和松材線蟲2 個(gè)近緣種除了諸多相似方面，其種間的致病性差異卻很大，推測這是由多種復(fù)雜的因素引起的，纖維素酶可能只是引起致病性差異中的一個(gè)關(guān)鍵因素，因此還需要更多的證據(jù)來尋找致病機(jī)制和引起致病差異的原因。